于 汐 劉 醒 趙潔潔 焦 陽(yáng) 陸 炎 楊琰英 李小英 湯其群

肥胖引起的胰島素抵抗與巨噬細(xì)胞活化和炎癥因子釋放引起的慢性代謝性炎癥有關(guān)，被認(rèn)為是肥胖引起胰島素抵抗的關(guān)鍵機(jī)制[1]。Hotamisligil等[2]的研究結(jié)果表明，肥胖脂肪組織產(chǎn)生的TNF-α可導(dǎo)致胰島素抵抗，抑制TNF-α可減輕胰島素抵抗，將肥胖與炎癥和胰島素抵抗聯(lián)系起來(lái)。McNelis等[3]的研究揭示了巨噬細(xì)胞，包括脂肪組織巨噬細(xì)胞(adipose tissue macrophage，ATM)是炎癥因子的主要來(lái)源，在引發(fā)代謝性炎癥和胰島素抵抗方面具有重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子陰陽(yáng)1(Yin Yang 1，YY1)表達(dá)廣泛，屬于多梳組蛋白家族。YY1可根據(jù)所在環(huán)境和募集的特定輔助因子激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[4]。YY1可調(diào)節(jié)約7%的哺乳動(dòng)物基因，涉及廣泛的生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)生和分化等。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究[5-6]結(jié)果表明，肝臟YY1通過(guò)上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)或抑制法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)參與葡萄糖和脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。YY1可增加前脂肪細(xì)胞中脂滴的累積，通過(guò)抑制Chop10的表達(dá)刺激脂肪生成，表明其在引起肥胖中發(fā)揮潛在的作用。此外，小鼠骨骼肌中YY1的缺乏改善了胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor IGF)信號(hào)傳導(dǎo)，并保護(hù)其免受雷帕霉素誘導(dǎo)的胰島素抵抗和血脂異常[7]。

盡管YY1在上述代謝器官中具有多重作用，但是巨噬細(xì)胞YY1是否與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)仍待研究。本研究旨在闡明巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子YY1基因通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子和脂肪因子分泌，影響脂肪組織和全身的胰島素敏感性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 C57BL/6J的YY1f/f小鼠、lysozyme-Cre[lyz2-cre(+/-)]小鼠(SPF級(jí))均購(gòu)自美國(guó)Jacksonlab公司。繁殖策略：通過(guò)Cre-Loxp系統(tǒng)將>8周齡(適當(dāng)繁殖年齡)的YY1f/f小鼠與lyz2-cre小鼠交配，得到Y(jié)Y1f/-；lyz2-cre小鼠。將YY1f/-；lyz2-cre小鼠與YY1f/f小鼠交配，得到Y(jié)Y1f/f；lyz2-cre小鼠(即巨噬細(xì)胞YY1基因特異性敲除小鼠)，再將YY1f/f；lyz2-cre小鼠與YY1f/f小鼠大量繁殖，得到實(shí)驗(yàn)組YY1f/f；lyz2-cre小鼠及對(duì)照組YY1f/f小鼠。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組各設(shè)6～11只雄性小鼠，各小鼠的出生時(shí)間相差7 d內(nèi)。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法規(guī)。

將小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物房。正常飲食飼料：舒克貝塔牌SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠糧(貨號(hào)為1010038，購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)。高脂飲食飼料：Research Diets飼料(貨號(hào)為D12492，脂肪占總熱量的60%，購(gòu)自上海睿安生物科技有限公司)。飼料均經(jīng)鈷(Co)60輻照滅菌，無(wú)沙門菌等致病菌。飲用水經(jīng)高壓蒸餾后使用，每周換水2次。

1.2 小鼠基因型驗(yàn)證 DNA的提?。杭粜∈竽_趾或耳朵置于1.5 mL Eppendorf(EP)離心管中，加入裂解液(450 μL)和蛋白酶K(50 μL)，確保組織在液面下。將EP離心管置入烘箱60 ℃、4～6 h或者過(guò)夜，中間震蕩1次，以裂解充分。16 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP離心管中，做好標(biāo)記。每管加入800 μL無(wú)水乙醇，顛倒混勻，靜置10 min，再以16 000×g離心10 min，棄上清液，倒扣后晾干，每管加入50 μL三聚乙二胺四乙酸(TE)緩沖液溶解，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。DNA濃度一般為100 ng/μL左右。

瓊脂糖凝膠電泳：PCR完成后，每管加入6×上樣緩沖液2 μL，起指示作用。配制2%瓊脂糖凝膠，140 V電泳30～40 min。PCR設(shè)置陰性對(duì)照，保證體系無(wú)污染。YY1條帶位置：野生型YY1 223 bp，YY1f/-369/223 bp，YY1f/f369 bp。lyz2-cre條帶位置：lyz2-cre(+/-)700/350 bp，lyz2-cre(-/-)350 bp。若瓊脂糖凝膠電泳在700 bp處顯示條帶，即表明lyz2-cre基因成功表達(dá)。

1.3 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)提取 小鼠予吸入異氟烷麻醉，斷頸處死，取完整腿骨，浸泡于滅菌杜氏磷酸緩沖液(DPBS)中，在DPBS中剝離腿骨上的肉，再將剝好的腿骨浸入含1640培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，剪開腿骨兩端，用預(yù)吸5 mL的注射器(插入1 mL針頭)輕輕吹動(dòng)骨腔，下接15 mL離心管，吹盡紅色的巨噬細(xì)胞。用1 mL的移液槍反復(fù)吹打懸浮的巨噬細(xì)胞組織，經(jīng)70 μm篩網(wǎng)進(jìn)50 mL離心管，300×g離心10 min，如有紅細(xì)胞則需要裂解；將分離好的小鼠巨噬細(xì)胞，置于小鼠BMDM誘導(dǎo)培養(yǎng)液(LCM)中，除去上清液鋪板，每2 d更換1次培養(yǎng)液，7 d后BMDM誘導(dǎo)基本完成。提取細(xì)胞中RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。若巨噬細(xì)胞YY1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量(轉(zhuǎn)錄水平)顯著降低，即表明巨噬細(xì)胞YY1基因特異性敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 qRT-PCR 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反轉(zhuǎn)錄前將RNA 70 ℃ 10 min充分變性。依據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，PCR過(guò)程：反應(yīng)階段42 ℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活階段95 ℃ 5 s。在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)DNA(cDNA)中加入焦碳酸二乙酯處理過(guò)并經(jīng)高溫高壓滅菌的超純水(DEPC水)稀釋10倍，分裝后置于-20 ℃冰箱中凍存。qRT-PCR的反應(yīng)體系：DEPC水2 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，cDNA 2 μL，熒光DNA結(jié)合染料(SYBR)5 μL。qRT-PCR程序(反轉(zhuǎn)錄后的DNA擴(kuò)增程序)：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s后62 ℃ 15 s(共40個(gè)循環(huán))，72 ℃ 30 s。檢測(cè)正常飲食的兩組小鼠BMDM中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 葡萄糖耐量、胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠均給予高脂飲食和正常飲食喂養(yǎng)至第12～13周齡時(shí)，進(jìn)行葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)：空腹16 h后，測(cè)定空腹(注射后0 min)血糖水平，注射20%葡萄糖(劑量1 mL/kg)，記錄注射后15、30、60、90、120 min時(shí)的血糖水平。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)：空腹6～8 h后，測(cè)定空腹(注射后0 min)血糖水平，注射胰島素(劑量0.75 U/kg)，記錄注射后15、30、60、90、120 min時(shí)的相對(duì)血糖變化值。注意小鼠注射操作時(shí)間，以保證在給藥后指定時(shí)間檢測(cè)血糖，并準(zhǔn)備20%葡萄糖救助血糖水平過(guò)低的小鼠。

1.6 胰島素信號(hào)通路檢測(cè) 兩組小鼠予高脂飲食后，每組取3只小鼠，注射0.9%氯化鈉溶液和胰島素(劑量均為0.75 U/kg)激活胰島素信號(hào)通路，10 min后用手術(shù)剪取小鼠的附睪脂肪、肌肉和肝臟組織，采用免疫印跡法檢測(cè)3種組織中蛋白激酶B(Akt)-糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)通路關(guān)鍵蛋白(Akt、Gsk3β)的磷酸化水平。

1.7 蛋白質(zhì)電泳 配制10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)膠。分離膠配方：4.7 mL水、2.5 mL 40%丙烯酰胺/亞甲基雙丙烯酰胺溶液(Acr/bis)、2.6 mL 1.5 mol/L Tris-HCL、0.1 mL 10%SDS、0.1 mL 10%過(guò)硫酸銨(AP)、0.004 mL四甲基乙二胺(TEMED)。濃縮膠配方：1.48 mL水、0.25 mL 40%Acr/bis、0.25 mL 1.0 mol/L Tris-HCL、0.02 mL 10%SDS、0.02 mL 10%AP、0.002 mL TEMED。上樣量為15～20 μg，預(yù)染內(nèi)參(GAPDH)蛋白1.0～2.5 μL。恒壓75～80 V 1 h后，將電壓調(diào)為100～120 V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳。將電泳后的SDS-PAGE膠切割至小于或等于6 cm×8 cm大小的濾紙，在膠上平鋪已用電泳緩沖液浸濕的大小為6 cm×8 cm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，恒壓90 V 120 min轉(zhuǎn)膜。

1.8 血清胰島素、瘦素和脂聯(lián)素水平檢測(cè) 兩組小鼠均予高脂喂養(yǎng)至第20周齡，從其眼球取血，分離血漿，凍存血清，采用ELISA法(ELISA試劑盒購(gòu)自加拿大Anogen公司)檢測(cè)血清中胰島素、瘦素和脂聯(lián)素水平。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞YY1基因特異性敲除小鼠模型驗(yàn)證 瓊脂糖凝膠電泳見700 bp處顯示條帶，表明lyz2-cre基因表達(dá)成功。見圖1。實(shí)驗(yàn)組小鼠BMDM中，YY1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.020±0.003，顯著低于對(duì)照組的1.000±0.060(P<0.001)，表明巨噬細(xì)胞YY1基因特異性敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

未編號(hào)樣品為內(nèi)參蛋白，編號(hào)161、162樣品未見lyz2-cre條帶，編號(hào)1、154樣品成功表達(dá)lyz2-cre基因

2.2 兩組小鼠葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 高脂喂養(yǎng)下，實(shí)驗(yàn)組小鼠注射葡萄糖后60、90 min時(shí)的血糖水平均顯著低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P值均<0.05)，兩組間注射葡萄糖后0、15、30、120 min時(shí)血糖水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射胰島素后30、60、90 min時(shí)的相對(duì)血糖值均顯著低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P值分別<0.05、0.001、0.01)，兩組間注射胰島素后0、15、120 min時(shí)相對(duì)血糖值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。正常飲食喂養(yǎng)下，兩組各時(shí)間點(diǎn)間血糖水平和相對(duì)血糖值的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表1 兩組小鼠高脂飲食喂養(yǎng)下葡萄糖耐量(血糖水平)和胰島素耐量(相對(duì)血糖值)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

表2 兩組小鼠正常飲食喂養(yǎng)下葡萄糖耐量(血糖水平)和胰島素耐量(相對(duì)血糖值)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

2.3 兩組小鼠胰島素信號(hào)通路結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪脂肪中胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Akt及Gsk3β磷酸化水平均明顯上調(diào)，表現(xiàn)為磷酸化Akt(p-Akt)及磷酸化Gsk3β(p-Gsk3β)蛋白質(zhì)顯影較對(duì)照組同種處理明顯增強(qiáng)；肌肉和肝臟組織中Akt和Gsk3β磷酸化水平無(wú)明顯變化，表現(xiàn)為p-Akt及p-Gsk3β的蛋白質(zhì)顯影與對(duì)照組同種處理相比無(wú)明顯差異。見圖2。

t-Akt:總Akt。t-Gsk3β:總Gsk3β。1、2、3 對(duì)照組+0.9%氯化鈉溶液 4、5、6 實(shí)驗(yàn)組+0.9%氯化鈉溶液 7、8、9 對(duì)照組+胰島素 10、11、12 實(shí)驗(yàn)組+胰島素 A 附睪脂肪B 肌肉 C 肝臟組織

2.4 兩組高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血清胰島素、瘦素、脂聯(lián)素水平比較 實(shí)驗(yàn)組血清瘦素、脂聯(lián)素水平均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組血清胰島素水平較對(duì)照組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血清胰島素、瘦素、脂聯(lián)素水平的比較

2.5 兩組小鼠BMDM中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組小鼠BMDM中IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.001)。見表4。

表4 兩組小鼠BMDM中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

現(xiàn)有研究[5-7]結(jié)果表明，YY1在肝臟、脂肪組織和肌肉中都具有多種代謝調(diào)節(jié)功能，但其在巨噬細(xì)胞中的作用仍待闡明。本研究分析了巨噬細(xì)胞YY1基因敲除小鼠的代謝變化，結(jié)果顯示：高脂喂養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠注射葡萄糖后60、90 min時(shí)的血糖水平均顯著低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)，注射胰島素后30、60、90 min時(shí)的相對(duì)血糖值均顯著低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)，提示YY1基因敲除改善了小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感性，表明巨噬細(xì)胞中的YY1基因具有影響葡萄糖代謝的作用。

脂聯(lián)素是白色脂肪組織分泌量最豐富的脂肪因子，具有抗炎和胰島素增敏特性[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，肥胖的嚙齒類動(dòng)物和人類的血漿脂聯(lián)素水平降低，脂聯(lián)素缺乏的小鼠暴露于高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)生葡萄糖不耐受和胰島素抵抗[10]。相反，脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)或給予重組脂聯(lián)素可改善肥胖小鼠的胰島素敏感性和葡萄糖穩(wěn)態(tài)[11]。此外，脂聯(lián)素抑制巨噬細(xì)胞的TNF-α表達(dá)和相關(guān)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎膩喰蚚12]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清脂聯(lián)素水平顯著高于對(duì)照組，表明了其在抗炎和胰島素增敏方面具有潛在作用。

胰島素抵抗是2型糖尿病的標(biāo)志之一，與胰島素信號(hào)通路下游分子水平密切相關(guān)。同時(shí)，Gsk3是胰島素信號(hào)通路最重要的分子之一。Akt磷酸化抑制Gsk3β，導(dǎo)致Gsk3β去磷酸化并活化，從而增加糖原合成[13]。Gsk3β受到胰島素等上游刺激物的抑制，這對(duì)于維持胰島素信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，Gsk3β過(guò)度激活與胰島素抵抗密切相關(guān)[14]；在高脂喂養(yǎng)小鼠的附睪脂肪中，Gsk3β活性增加[15]。此外，新的證據(jù)表明，脂肪組織中Gsk3β的功能障礙介導(dǎo)了多種因素對(duì)脂肪生成、胰島素敏感性，甚至炎癥的調(diào)節(jié)作用[16]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪脂肪中胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Akt及Gsk3β磷酸化水平均明顯上調(diào)，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠Akt-Gsk3β通路被激活，進(jìn)而表現(xiàn)為胰島素敏感性改善，推測(cè)其與敲除了巨噬細(xì)胞YY1基因有關(guān)。脂聯(lián)素對(duì)Gsk3β的調(diào)節(jié)或相互作用目前仍缺乏研究，推測(cè)肥胖小鼠的巨噬細(xì)胞YY1基因敲除通過(guò)上調(diào)脂聯(lián)素和Akt磷酸化的Gsk3β水平來(lái)提高胰島素敏感性。肥胖的脂肪組織常常有大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，以M1巨噬細(xì)胞數(shù)量增多為主，其中釋放的炎癥因子與胰島素抵抗有關(guān)。因此，在脂肪組織中比較容易觀察到胰島素信號(hào)通路的變化；而在肌肉和肝臟組織中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)則相對(duì)較少，對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響則較小。

綜上所述，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子YY1基因敲除小鼠可能通過(guò)減輕巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，從而增強(qiáng)脂肪組織中胰島素信號(hào)通路活性，進(jìn)一步改善高脂飲食小鼠的胰島素敏感性。巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子YY1基因敲除可通過(guò)激活A(yù)kt-Gsk3β胰島素通路來(lái)改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性，這可能與脂肪因子的分泌增多和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的減輕有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子YY1基因可能是肥胖相關(guān)胰島素抵抗的潛在治療策略。