張冬梅 張麗玲 高利超 朱婷婷

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要病因。已有多項研究試圖闡明DN的發(fā)病機制以促進藥物研發(fā)，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)DN的發(fā)展。血流動力學(xué)改變、代謝紊亂、免疫失調(diào)和濾過屏障受損是DN發(fā)生的主要機制[1]。此外，有研究[2]結(jié)果表明，腎小管特別是近端腎小管也是DN的損傷部位。進行性腎小管間質(zhì)纖維化是DN導(dǎo)致ESRD發(fā)生、發(fā)展的重要機制[3-4]。在尚未表現(xiàn)出明顯腎小球損傷的早期糖尿病患者尿液中，可檢測到近端腎小管上皮細(xì)胞(renal proximal tubular epithelial cell，RPTC)損傷的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。免疫失調(diào)與DN誘發(fā)的腎小管損傷密切相關(guān)[6-7]。但早期DN相關(guān)腎小管損傷的免疫機制尚不明確。

近年來，高通量測序技術(shù)和在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的研發(fā)為研究人員深入探索疾病的基因改變和潛在致病機制提供了重要手段。本研究團隊?wèi)?yīng)用CTD在線數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，https://ctdbase.org)、NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(The National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)、ARCHS4數(shù)據(jù)庫(all RNA-seq and ChIP-seq sample and signature search)、R語言軟件，以及DAVID 6.8在線生物信息數(shù)據(jù)庫(https://david.hcifcrf.gov)對早期DN小鼠腎小管的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)進行鑒定。利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)通路和基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析識別這些DEGs編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用及通路關(guān)系，篩選出可能的早期DN相關(guān)腎小管損傷的免疫調(diào)節(jié)樞紐基因，并進一步比較了樞紐基因在高糖刺激的人近端腎小管上皮細(xì)胞系(human renal proximal tubular epithelial cell,即HK-2細(xì)胞)與對照組中的表達差異，為進一步的機制研究提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 CTD在線數(shù)據(jù)庫篩查DN相關(guān)基因 CTD在線數(shù)據(jù)庫提供了關(guān)于化學(xué)分子與基因或蛋白質(zhì)相互作用、化學(xué)分子或基因與疾病關(guān)系的多種信息。通過輸入關(guān)鍵詞“糖尿病腎病(diabetic nephropathy)”，查找DN相關(guān)基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)為干擾分?jǐn)?shù)(inference scored)≥10分。

1.2 早期DN小鼠測序數(shù)據(jù)的獲取 本研究中所分析的高通量測序數(shù)據(jù)檢索自NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫。檢索條件：①關(guān)鍵詞，“早期糖尿病腎病(early development of diabetic nephropathy)”。②條目類型，系列(series)。③研究類型，高通量測序基因表達譜分析。④物種，小鼠。⑤腎臟組織細(xì)胞定位，RPTC。最終獲得由Tang Wanxin(唐萬欣)等提供的基于GPL17021 Illumina HiSeq 2500(Mus musculus)平臺的GSE95376高通量測序數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集以RPTC作為研究樣本，總共包含4個干預(yù)時間點[即連續(xù)5 d經(jīng)小鼠尾靜脈注射50 mg/(kg·d)的鏈脲佐菌素,樣本收集時間為注射0、2、4和8周時]共8個樣本。

1.3 數(shù)據(jù)處理及DEGs篩選 ARCHS4數(shù)據(jù)庫是Alexander Lachmann等基于NCBI-GEO、序列讀取存檔(Sequence Read Archive，SRA；https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/tag/sra)等數(shù)據(jù)庫開發(fā)的公共數(shù)據(jù)庫，具備數(shù)據(jù)直觀探索、交互式可視化的特點，可分析基因表達水平、預(yù)測基因生物學(xué)功能和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系等。應(yīng)用ARCHS4數(shù)據(jù)庫的BioJupies功能進一步分析4個干預(yù)時間點的DEGs。并利用R語言軟件(4.0.2版本)的limma軟件包對獲得的DEGs進行進一步篩選。將P<0.05，log2(fold change,FC)的絕對值>1作為篩選DEGs的條件，以篩選出不同干預(yù)時間點共同的DEGs，并與CTD在線數(shù)據(jù)庫所獲的DN相關(guān)基因進行維恩圖可視化分析，最終得到2個數(shù)據(jù)庫共表達差異基因(co-DEGs)。

1.4 DEGs的PPI構(gòu)建及模塊分析 利用STRING在線工具(https://string-db.org/)識別co-DEGs編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，并利用Cytoscape軟件(3.7.1版本)的MCODE插件分析出最重要的功能模塊Module-1，進一步通過DAVID 6.8在線生物信息數(shù)據(jù)庫對Module1-1中的基因進行GO生物學(xué)過程的富集分析。

1.5 DEGs富集分析與核心基因篩選 應(yīng)用DAVID 6.8在線生物信息數(shù)據(jù)庫對co-DEGs進行GO和KEGG 通路富集分析。利用在線繪圖工具(https://www.bioinformatics.com.cn)將富集分析結(jié)果進行可視化，以氣泡圖展示。同時，通過上述富集分析篩選出富集在免疫反應(yīng)集群中的DEGs，并將富集在Module-1的基因與富集在免疫反應(yīng)集群中的基因進行維恩圖可視化分析，得到重疊的核心基因集群。最后，利用Cytoscape軟件的cytoHubba插件的4種不同的計算方法[MCC(Maximal Clique Centrality)、Degree、EPC(Edge Percolated Component)和MNC(Maximum Neighborhood Component)]篩選出該核心基因集群中最關(guān)鍵的樞紐基因。

1.6 核心基因驗證

1.6.1 實驗試劑 RNA提取試劑盒購自中國成都福際生物技術(shù)有限公司，5×All-In-One MasterMix、EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-No Dye購自美國Abcam公司。RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF，100 mmol/L)、磷酸化蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠制備試劑盒、TBS緩沖液均購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物購自中國合肥蘭杰柯科技有限公司。Tris、SDS、Glycine、BSA、TWEEN 20均購自德國Bioforxx公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司。干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)抗體購自美國Proteintech公司；GAPDH抗體購自澳大利亞Affinity公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司。引物β-actin序列為 5’-AAT CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA-3’,5’GGA TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3’；引物IRF7序列為5’-CCC AGC AGG TAG CAT TCC C-3’,5’-GCA GCA GTT CCT CCG TGT AG-3’;均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。

1.6.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HK-2細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度5.5 mmol/L)中，于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞(3×104個/mL)接種于6孔板。以葡萄糖濃度為30 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，納入高糖組; 以葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h，納入對照組。

1.6.3 RNA提取與實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細(xì)胞核心基因表達 應(yīng)用RNA提取試劑盒分別提取各組HK-2細(xì)胞總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，以2 μL cDNA進行PCR擴增反應(yīng)，采用 2-ΔΔCt法計算IRF7 mRNA的相對表達量。

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測IRF7蛋白質(zhì)表達 收集各組 HK-2 細(xì)胞加入蛋白質(zhì)裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，按照每孔30 μg蛋白質(zhì)樣品上樣，在80～120 V電壓下進行電泳。轉(zhuǎn)膜后加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。加入二抗(1∶5 000 稀釋)后，37 ℃搖床中孵育1.5 h，進行化學(xué)發(fā)光顯影，掃描記錄數(shù)據(jù)。

1.7 核心基因通路分析 通過KEGG在線分析工具查找核心基因相關(guān)信號通路,并通過NCBI數(shù)據(jù)庫查閱該基因與腎臟損傷的相關(guān)機制，整合分析并繪制出該核心基因的相關(guān)信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)處理及DEGs篩選 應(yīng)用CTD在線數(shù)據(jù)庫共獲得與DN相關(guān)的6 576個基因。通過ARCHS4數(shù)據(jù)庫及R語言軟件的limma軟件包分析GSE95376數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)早期DN小鼠的4個干預(yù)時間點共有435個DEGs，其中表達上調(diào)的基因130個，表達下調(diào)的基因305個。應(yīng)用ARCHS4數(shù)據(jù)庫繪制關(guān)于GSE95376數(shù)據(jù)集各干預(yù)時間點DEGs的火山圖顯示,干預(yù)2周的DN小鼠較對照組有599個上調(diào)DEGs，483個下調(diào)DEGs，干預(yù)4周的DN小鼠較對照組有212個上調(diào)DEGs, 444個下調(diào)DEGs，干預(yù)8周的DN小鼠有1 104個上調(diào)DEGs，879個下調(diào)DEGs(圖1A～1C)。利用在線繪圖工具對3個干預(yù)時間點的DEGs進行維恩圖可視化分析，結(jié)果顯示共有435個DEGs(圖1D)。

A 干預(yù)2周的DN小鼠RPTC的DEGs火山圖 B 干預(yù)4周的DN小鼠RPTC的DEGs火山圖 C 干預(yù)8周的DN小鼠RPTC的DEGs火山圖 D 對3個干預(yù)時間點的DEGs進行維恩圖可視化分析

2.2 DEGs的PPI構(gòu)建及模塊分析 將上述CTD在線數(shù)據(jù)庫DN(CTD-DN)相關(guān)基因與GSE95376數(shù)據(jù)集3個干預(yù)時間點co-DEGs進行維恩圖可視化分析，篩選出229個co-DEGs(圖2A)。利用STRING在線工具分析該229個co-DEGs編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，并通過Cytoscape軟件可視化，提示該229個co-DEGs之間聯(lián)系密切。使用MCODE插件篩選出最重要的模塊Module-1，提示該模塊中的26個基因之間關(guān)系緊密，顏色越深的基因在模塊中的作用越關(guān)鍵(圖2B)。通過DAVID在線分析工具對該模塊中的所有基因進行GO生物學(xué)富集分析，發(fā)現(xiàn)26個基因的主要功能：①對病毒的防御反應(yīng)(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、STAT2、ISG15、IFIT1、OASL1、IFIT3、IFIT2、OASL2)；②應(yīng)對病毒(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IFIT1、OASL1、IFIT3、IFIT2、OASL2)；③免疫系統(tǒng)過程(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IRF7、IFIT1、OASL1、IFIT3、IIGP1、HERC6、IFIT2、OASL2)；④先天免疫反應(yīng)(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IRF7、IFIT1、OASL1、IFIT3、IIGP1、HERC6、IFIT2、OASL2)；⑤細(xì)胞對IFN-β的反應(yīng)(包括GBP6、STAT1、IGTP、IRGM2、IFIT1、IFIT3、IIGP1)。

A 對CTD-DN相關(guān)基因和3個干預(yù)時間點co-DEGs進行維恩圖可視化分析 B 通過MCODE插件分析來自功能最重要模塊Module-1的DEGs編碼的蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 co-DEGs功能富集分析與核心基因篩選 利用DAVID在線分析工具對上述229個co-DEGs進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示DEGs主要富集在肝炎病毒、流行性感冒病毒和皰疹病毒感染，以及破骨細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂解的調(diào)節(jié)、2型糖尿病及胰高血糖素信號通路等(圖3A和表1)。GO富集分析結(jié)果顯示，基因主要富集于病毒防御反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、先天性免疫反應(yīng)、脂質(zhì)及類固醇代謝過程、防御病毒、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及基因表達等生物學(xué)過程等(圖3B和表2)。功能最重要的模塊Module-1的基因主要富集在免疫相關(guān)生物學(xué)過程中，進一步將Module-1中的基因與富集在免疫應(yīng)答集群中的DEGs進行維恩圖可視化分析，得到11個參與免疫應(yīng)答的關(guān)鍵DEGs:IRF7、IIGP1、IFIT3、OASL1、DDX58、IFIT2、IFIT1、IFIH1、RSAD2、HERC6和BST2。通過Cytoscape的cytoHubba插件篩選出免疫應(yīng)答集群中最關(guān)鍵的核心基因并將其可視化，應(yīng)用4種計算方法(MCC、Degree、EPC、MNC)得出排名順序，均提示IRF7位于這11個差異基因相互作用的核心位置(表3)。

A co-DEGs的KEGG通路富集分析 B co-DEGs的GO-BP富集分析

表1 co-DEGs前10個顯著富集的KEGG通路

表2 co-DEGs前10個顯著富集的GO生物學(xué)過程

表3 4種不同計算方法篩選核心基因的排序

2.4 核心基因的驗證 通過核心基因的篩選，IRF7被鑒定為早期DN相關(guān)腎小管損傷的關(guān)鍵DEGs。體外實驗結(jié)果顯示，高糖組IRF7 mRNA相對表達量為1.633±0.058，顯著高于對照組的1.153±0.087(P<0.05)。IRF7蛋白質(zhì)相對表達量為0.127±0.018，顯著高于對照組的0.060±0.005(P<0.05)。

2.5 核心基因的通路分析 應(yīng)用KEGG在線工具，輸入關(guān)鍵詞IRF7，選擇其與炎癥、凋亡及免疫相關(guān)的信號通路，包括Toll樣受體信號通路(hsa04620)、NOD樣受體信號通路(hsa04621)和RIG-Ⅰ樣受體信號通路(hsa04622)，并結(jié)合NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫查閱IRF7導(dǎo)致腎臟損傷的相關(guān)信號通路，整理出IRF7參與炎癥、凋亡及抗病毒的信號通路(圖4)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在病毒、細(xì)菌及內(nèi)源性損傷相關(guān)分子的刺激下，可通過不同途徑刺激IRF7表達，并最終參與Ⅰ型IFN及N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生，從而參與炎癥、凋亡、抗病毒等過程。

注：IRF7主要富集在Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和RIG-Ⅰ樣受體信號通路，參與炎癥、凋亡及抗病毒等生物學(xué)過程。NOD2為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2；MAVS為線粒體抗病毒信號蛋白；TRIF為IFN-β TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白；TRAF3/6為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3/6；TBK1為TANK結(jié)合激酶1；IKKε為IκB激酶；TLR2/3/4/5/7/8/9為Toll樣受體2/3/4/5/7/8/9；MyD88為髓樣分化因子88；TIRAP為Toll IL-1受體域銜接蛋白；RIP2為受體相互作用蛋白2；PI3K為磷酸酰肌醇-3激酶；rac為Rac家族小GTP酶；BTK為布魯頓酪氨酸激酶；LPS為脂多糖；DAMPs為損傷相關(guān)分子模式；IRAK1/4為IL-1受體相關(guān)激酶1/4；LFNG為O-巖藻糖肽3-β-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶

3 討 論

本研究通過從CTD數(shù)據(jù)庫下載DN相關(guān)基因，以及從NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫提取DN小鼠的腎小管高通量測序數(shù)據(jù)，利用ARCHS4在線分析網(wǎng)站及生物信息學(xué)技術(shù)鑒別出2個數(shù)據(jù)庫重疊的229個co-DGEs，進行PPI分析及模塊分析。結(jié)果顯示，Module-1模塊的co-DEGs基因主要富集在免疫反應(yīng)、固有免疫系統(tǒng)等生物學(xué)功能上。進一步行GO和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示co-DEGs主要富集在病毒感染及代謝相關(guān)途徑，如甲型H1N1流行性感冒病毒感染、單純皰疹病毒感染、破骨細(xì)胞分化、脂肪分解調(diào)節(jié)及胰高血糖素信號通路等。GO富集分析提示這些DEGs大多富集在免疫相關(guān)的生物過程，如免疫系統(tǒng)過程、先天性免疫反應(yīng)、病毒防御反應(yīng)、細(xì)胞對IFN-β的反應(yīng)等。多項研究[7-12]結(jié)果表明，免疫反應(yīng)及免疫系統(tǒng)對DN的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞均參與到DN的病理生理過程中。通過Toll樣受體信號等先天性免疫相關(guān)通路可檢測糖尿病過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性危險相關(guān)分子模式，通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)無菌性的小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)[7]。上述結(jié)果表明，篩選出的DEGs可能通過免疫介導(dǎo)的腎小管損傷影響 DN 的進展。

為了進一步分析出免疫相關(guān)的核心基因，本研究將Module-1中的基因與富集在免疫應(yīng)答集群中的DEGs進行維恩圖可視化分析，篩選出IRF7、IIGP1、IFIT3、OASL1、DDX58、IFIT2等11個重要的參與免疫應(yīng)答的DEGs。在通過cytoHubba 插件計算得到的基因中，IRF7占據(jù)網(wǎng)絡(luò)樞紐位置。IRF7是IFN調(diào)節(jié)因子基因編碼的相關(guān)蛋白家族成員之一,其具有經(jīng)典的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，最重要的生物學(xué)功能是誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，參與機體抗病毒及免疫反應(yīng)[13]。IRF7參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括自身免疫性疾病[14]、呼吸道炎癥[15]、腫瘤[16]、自生免疫性胰腺炎[17]及糖尿病[18]等。IRF7在腎臟免疫損傷中同樣扮演重要角色。在豬腎上皮細(xì)胞(PK15)中IRF3/IRF7過表達可通過TLR4信號通路減弱炎癥反應(yīng)[19]。在CKD中，增多的循環(huán)RNA作為內(nèi)源性損傷分子顯著提高NF-κB、IRF3和IRF7水平，進而調(diào)節(jié)CKD的免疫炎癥反應(yīng)[20]。在5/6腎切除大鼠模型中，IRF7的表達水平在腎切除后15、60 d均明顯升高，并伴隨著進行性的高血壓和蛋白尿、肌酐水平升高及嚴(yán)重的腎小球和小管間質(zhì)損傷，其機制可能是通過激活TLR2/4/5-MyD88-TRAF6-IRF7信號通路導(dǎo)致炎癥因子釋放及促進炎癥小體形成[21]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在早期DN小鼠RPTC中，IRF7表達水平顯著升高，且位于免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的核心位置，并進一步在HK-2 細(xì)胞的體外實驗中得到證實，提示IRF7與早期DN免疫損傷密切相關(guān)。

本研究進一步對IRF7進行了KEGG相關(guān)通路分析，發(fā)現(xiàn)其主要通過Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和RIG-Ⅰ樣受體信號通路參與炎癥、凋亡及免疫反應(yīng)等。Toll樣受體是激活I(lǐng)RF7的重要模式識別受體之一。TLR2可在炎癥性單核細(xì)胞和骨髓來源的巨噬細(xì)胞中被內(nèi)化并激活I(lǐng)RF1、IRF3和IRF7[22-23]，同時TLR3、TLR7、TLR9、RIG-Ⅰ、NOD等信號通路在病原體刺激下也可激活I(lǐng)RF7[24]。在DN中，受損或死亡的細(xì)胞可釋放一些內(nèi)源性損傷相關(guān)分子(如DAMPs)[25]，其可與特定的Toll樣受體相互作用誘導(dǎo)先天性免疫反應(yīng)。在DN中，腎臟TLR2、TLR4水平明顯升高[26-27];損傷相關(guān)分子可激活TLR2、TLR4，從而形成肌小體復(fù)合物并誘導(dǎo)TRAF6的活化，進而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)相關(guān)基因表達。持續(xù)免疫介導(dǎo)的慢性炎癥可導(dǎo)致腎小球、腎小管及腎間質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致腎臟纖維化病變、腎功能惡化和ESRD[25]。本研究結(jié)果提示，在早期DN患者的RPTC中, IRF7表達水平顯著增高，同樣在高糖刺激的HK-2細(xì)胞中IRF7表達水平也明顯升高，并通過生物信息學(xué)分析鑒定出IRF7具有重要的免疫應(yīng)答功能，KEGG通路分析及經(jīng)數(shù)據(jù)庫信息篩查進一步明確了IRF7參與腎臟損傷的潛在機制，提示IRF7可作為治療DN的早期干預(yù)靶點。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法鑒定出IRF7為早期DN腎小管免疫應(yīng)答的樞紐基因。這一結(jié)果在HK-2細(xì)胞的體外實驗中得到了進一步的證實。KEGG通路分析闡述了IRF7參與DN相關(guān)腎損傷的潛在機制。這些結(jié)果為進一步深入探索早期DN的免疫損傷相關(guān)分子機制提供了依據(jù)，并為DN的早期治療挖掘了新的潛在靶點。