文│黃永生（深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院、深圳市動物疫病預(yù)防控制中心）

徐志遠 婁華*（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一種急性、熱性、出血性、高度接觸性的烈性傳染病。該病可引起各個品種和年齡段的豬發(fā)病，其臨床特征為高熱、皮膚發(fā)紺、嘔吐、便血、淋巴結(jié)嚴(yán)重出血、脾腫大3～10倍，典型敗血癥，發(fā)病急、病程短、死亡率高。近年來，非洲豬瘟給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大威脅的同時也造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，目前非洲豬瘟被稱為養(yǎng)豬業(yè)的“頭號殺手”。

非洲豬瘟病毒是目前惟一已知的蟲媒DNA病毒。自1921年首次在非洲肯尼亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)ASFV后，該病毒相繼在西班牙、意大利、法國、比利時、馬耳他以及荷蘭等國家和地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)90年代，該病毒在歐洲大部分地區(qū)被消滅，但仍流行于意大利撒丁島。2007年，ASFV首次傳入俄羅斯高加索地區(qū)格魯吉亞，并于當(dāng)年8月在亞美尼亞暴發(fā)流行，此后ASFV傳播到烏克蘭、白俄羅斯。2014年在立陶宛、愛沙尼亞、波蘭、拉脫維亞相繼報道非洲豬瘟疫情。2017年，意大利、羅馬尼亞、捷克共和國以及匈牙利等國暴發(fā)非洲豬瘟疫情。2018年8月，我國在遼寧省沈陽市某豬場首次發(fā)現(xiàn)ASFV，此后我國的一些其他省份相繼發(fā)生非洲豬瘟疫情。

目前，非洲豬瘟尚無安全、有效的疫苗以及特異性藥物進行非洲豬瘟的防治，對其防控依然采取的是快速檢測結(jié)合有效的生物安全措施為主。因而，ASF快速檢測方法的建立對于ASF的診斷、疫情的確認與及時處置、防控與凈化起到至關(guān)重要的作用。

一、非洲豬瘟病毒的特點

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬中唯一的成員，其結(jié)構(gòu)為復(fù)雜的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約為200納米，基因組為線性雙鏈DNA，基因組全長度170～190kb，包含151～167個開放閱讀框，可以編碼170多種蛋白，目前超過一半的蛋白功能未知。成熟病毒顆粒包含54種結(jié)構(gòu)蛋白，其中病毒血清學(xué)檢測方法研究最為常用的結(jié)構(gòu)蛋白為p30、p54、p72。ASFV具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，對外界環(huán)境的抵抗力非常強，血清等有機質(zhì)的存在也可以增加病毒的抵抗力。ASFV根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白p72的B646L基因序列的不同可分為24種基因型，而依據(jù)病毒顆粒表面蛋白的抗原性又可以分為8種不同的血清型。ASFV是目前惟一已知的蟲媒DNA病毒，鈍緣蜱是其重要的傳播媒介。ASFV可以借助口鼻間接觸與破損的皮膚進行直接接觸的水平方向傳播，也可以通過糞便、尿液、唾液等排泄物或分泌物的接觸進行間接接觸傳播。除此之外，相關(guān)研究還表明，ASFV還可以借助氣溶膠進行短距離傳播。ASFV在未熟制肉品、凍肉、腌肉、泔水中可以長時間存活，在糞便以及受污染的豬舍內(nèi)可以存活30天之久，豬只飼喂泔水也是引起ASFV傳播的重要途徑。

二、免疫學(xué)檢測方法

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assey，ELISA）是OIE推薦的用于ASFV診斷最常用的血清學(xué)檢測方法。ELISA的原理是將某種酶與抗體結(jié)合形成酶標(biāo)抗體，然后與吸附于固相載體上的相應(yīng)的抗原或者抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，加入底物溶液，發(fā)生酶分子催化反應(yīng)，呈現(xiàn)不同的顏色變化，據(jù)此來判斷抗原或抗體的含量。根據(jù)檢測靶標(biāo)的不同，可以將其分為直接ELISA、間接ELISA、雙夾心ELISA以及阻斷ELISA。采用ELISA方法進行ASFV檢測時，對于抗原檢測最為常用的靶標(biāo)為p30、p54、p72、p32、K205R。ELISA方法具有操作簡便、質(zhì)優(yōu)價廉、實用性強、快速以及對儀器設(shè)備要求不高的優(yōu)點，適用于ASFV的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查以及定期監(jiān)測。Barderas等利用制備的重組p30蛋白開發(fā)了檢測非洲豬瘟病毒的間接ELISA方法，實現(xiàn)了對ASFV的特異性抗體的檢測。Cubillos等基于ASFV東非分離株制備出了重組p30蛋白，并設(shè)計了相應(yīng)的ELISA診斷方法，經(jīng)檢測可以準(zhǔn)確檢測出ASFV。Wardley等以抗ASFV的特異性抗體IgG為包被單抗，設(shè)計了間接ELISA試驗，實現(xiàn)了對ASFV抗原的檢測，其最低檢測濃度為50HAD50/毫升，上限檢測濃度為500HAD50/毫升。Perez Filgueira D M等借助昆蟲細胞表達的重組蛋白p30作為包被抗原，設(shè)計了間接ELISA檢測方法用于非洲豬瘟病毒抗體的檢測，對采樣于西班牙以及來自非洲不同地區(qū)的672份豬血取其血清作為樣品檢測，可以檢測到非洲豬瘟病毒的特異性抗體，同時，通過此種方法可以實現(xiàn)對ASFV早期感染樣品的檢測。因此，也證實了此種間接ELISA檢測方法具有較高的敏感性。鄔旭龍等依據(jù)原核表達的pk205R蛋白為包被抗原，設(shè)立了檢測ASFV抗體的間接ELISA診斷方法。由此表明，ELISA檢測方法及開發(fā)的相關(guān)試劑盒在ASFV的檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

2.免疫熒光試驗。免疫熒光試驗（Immunofluorescence assey，IFA）的原理是利用熒光素標(biāo)記相應(yīng)的抗原或抗體，使之與其相對應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原—抗體免疫復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察，實現(xiàn)對未知抗原或抗體的檢測。根據(jù)其檢測靶標(biāo)是抗原或抗體，可以將其分為直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗。直接免疫熒光試驗的原理是利用熒光素（如異硫氰酸熒光素）標(biāo)記抗ASFV的特異性單抗或多抗，將其與組織觸片以及薄層冷凍切片上的抗原直接發(fā)生反應(yīng)后鏡檢，實現(xiàn)對ASFV的抗原檢測。此種方法具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，但也存在不足之處，如對操作技術(shù)要求高、對實驗室設(shè)備要求高以及需要特定的操作環(huán)境等。間接免疫熒光試驗的原理是將感染ASFV的細胞（如原代以及傳代培養(yǎng)細胞）固定于固相載體（載玻片）上，加入待檢測血清，使之發(fā)生特異性反應(yīng)，若待檢測的血清樣品中含有ASFV的特異性抗體，則會與含有ASFV抗原的特定細胞進行結(jié)合，進而會與熒光染料標(biāo)記的二抗發(fā)生特異性結(jié)合，形成特異性熒光復(fù)合物，通過熒光顯微鏡觀察可對此復(fù)合物做出判斷。此種檢測方法與直接免疫熒光試驗存在一樣的不足之處。免疫熒光試驗對于急性感染ASFV豬只樣品檢測的敏感性較高，但不適用于亞急性及慢性感染豬只的檢測。Heuschele等通過免疫熒光試驗實現(xiàn)了對不產(chǎn)生紅細胞吸附現(xiàn)象的ASFV的檢測。

3.免疫印跡試驗。免疫印跡試驗（Immunoblotting test，IBT）的原理是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，通過一抗與二抗的孵育，實現(xiàn)對ASFV抗原或抗體的檢測，這是一種凝膠電泳與免疫分析化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)。免疫印跡試驗具有特異性強、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、高通量的優(yōu)點，同時對于含有細胞化合物的抗原進行檢測時假陽性率低，但操作煩瑣，對實驗設(shè)備以及實際試驗操作環(huán)境要求較高，此種方法僅適用于實驗室檢測。Kazakova等基于其制備的較高純度重組表達p30蛋白開發(fā)了相對應(yīng)的免疫印跡檢測方法，實現(xiàn)了對ASFV感染豬只的血清及組織樣品的檢測，具有非常高的特異性和敏感性。對于家豬或野豬以及自然感染狀態(tài)下的豬只，可在感染ASFV后6～8天從其血清或組織器官中檢出相應(yīng)的特異性抗體。

4.膠體金免疫層析法。膠體金免疫層析法（C o l l o i d a l g o l d immunochromatography，GICA）是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物用于抗原或抗體檢測的新型固相載體免疫檢測技術(shù)。膠體金免疫層析試紙條包括質(zhì)控線和檢測線兩部分，質(zhì)控線是保證試紙條是完好的，而檢測線的存在是對樣本進行檢測，檢測線的存在與否用于檢測結(jié)果的判斷。此種檢測方法具有易操作性、實用性、快速、便攜、費用低、特異性好的優(yōu)點，不需要專業(yè)的儀器設(shè)備，肉眼即可進行檢測結(jié)果判斷等優(yōu)點，但對于檢測樣本濃度有一定的要求。膠體金免疫層析試紙條適用于ASFV的現(xiàn)場快速初步診斷、ASFV的流行病學(xué)調(diào)查以及定期監(jiān)測、急性感染、疑似感染與病死豬的檢測，但不適用于ASFV感染的早期檢測。Sastre等基于制備的抗ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72的單克隆抗體，建立了用于ASFV抗原檢測的免疫層析試紙條。張鑫宇等基于制備的抗ASFV的p54蛋白的抗體，建立了具有較高特異性的膠體金免疫層析檢測法。林彥星等利用量子點標(biāo)記葡萄球菌A蛋白，建立了相應(yīng)的量子點免疫層析檢測技術(shù)，可用于ASFV抗體的快速檢測。吳海濤等基于原核表達的ASFV衣殼蛋白PET-30A-P72，利用雙抗體夾心法原理，制備了純化的用于膠體金標(biāo)記的特異性多抗，建立了具有較高靈敏度的膠體金免疫層析抗原檢測法。

三、核酸檢測方法

1.常規(guī)PCR檢測法。常規(guī)PCR（Polymerase chain reaction) ，稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這種檢測方法依據(jù)的是雙鏈擴增的原理，在引物、模板DNA以及4種脫氧核苷酸存在的情況下，在DNA聚合酶的催化作用下，依據(jù)堿基互補配對原則，在體外實現(xiàn)目的DNA片段的指數(shù)級擴增。常規(guī)PCR檢測方法是OIE推薦的用于ASFV診斷的核酸檢測方法，也是當(dāng)前實驗室較為實用的ASFV鑒別診斷方法。常規(guī)PCR檢測法具有特異性高、靈敏度高、簡便快速的優(yōu)點，且可實現(xiàn)擴增反應(yīng)終點產(chǎn)物的定性或半定量分析。這種檢測方法需要專業(yè)的熱循環(huán)儀，對操作人員的技術(shù)要求高，需要特定的實驗室環(huán)境條件等，因而并不適用于ASFV的現(xiàn)場快速檢測，是用于ASFV確診的實驗室檢測方法。Aguero M等建立了用于ASFV感染的早期診斷的PCR檢測方法，具有較高的特異性和敏感性。Giammarioli等建立了用于非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）以及豬細小病毒（PPV）的檢測與鑒別診斷的多重PCR。張倩等建立了用于PRRSV、PCV-2、PPV以及PRV鑒別診斷的多重PCR檢測方法，經(jīng)過實際樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)其具有較高的敏感性。Hu等建立了用于ASFV、PRRSV以及PRV鑒別診斷的三重PCR檢測方法。Luo等基于ASFV的P72蛋白基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立了相應(yīng)的PCR檢測方法，其檢測限為60個拷貝。

2.熒光定量PCR檢測法。熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的原理是在反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過捕捉熒光信號來追蹤擴增反應(yīng)產(chǎn)物，實現(xiàn)PCR反應(yīng)進程的實時監(jiān)測，最終通過呈現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)初始反應(yīng)模板定量分析。這種檢測方法具有特異性強、靈敏性極高、穩(wěn)定性好、操作簡便、準(zhǔn)確性及可靠性高的優(yōu)點。因其具有極高靈敏度的特點，更需注重規(guī)范操作過程。相對于常規(guī)PCR而言，反應(yīng)更為迅速，且閉管操作污染小。這種檢測方法同樣需要專業(yè)的熱循環(huán)儀，對儀器設(shè)備要求及試驗條件要求高，只適用于實驗室檢測。熒光定量PCR檢測法是非洲豬瘟病毒檢測最為常用的實驗室檢測方法。King等基于ASFV的VP72特定基因序列設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，建立了檢測ASFV的熒光定量PCR檢測方法，檢測限為40個拷貝。郭少平等基于ASFV的K205R基因序列構(gòu)建了熒光定量PCR檢測方法。張彩虹等基于ASFV的VP72基因序列設(shè)計相應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建了只針對ASFV檢測的熒光定量PCR檢測方法，具有高度的特異性和敏感性的特點。王建華等依據(jù)ASVF的CP530R（pp62）基因序列以及高致病性PRRSV的NSP2基因序列，分別設(shè)計相對應(yīng)的特異性引物和TaqMan探針，建立了用于ASFV與高致病性PRRSV鑒別診斷的熒光定量PCR檢測方法。王彩霞等基于ASFV的CD2v基因序列設(shè)計對應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建了ASFV檢測的熒光定量PCR，最低檢測限為10個拷貝。Haines F J等依據(jù)ASFV和CSFV的基因序列建立了具有較高靈敏度的雙重鑒別診斷熒光定量PCR檢測方法。由此可見，熒光定量PCR檢測法是ASFV檢測應(yīng)用最為廣泛且精準(zhǔn)度最高的檢測技術(shù)。

3.等溫擴增技術(shù)。等溫擴增技術(shù)是一種恒溫條件下依賴于DNA酶作用的新型核酸擴增技術(shù)。常見的等溫擴增技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase protein amplification，RPA）、交叉引物擴增技術(shù)（C r o s s i n g Priming Amplification，CPA）、滾環(huán)擴增技術(shù)（R o l l i n g c i r c l e amplification，RCA）以及雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）。等溫擴增技術(shù)具有簡便、快速、便攜、耗費低以及敏感度高的優(yōu)點，對儀器設(shè)備、操作人員技術(shù)、試驗條件等要求不高，且檢測結(jié)果的判斷更為直觀，更適合于現(xiàn)場快速診斷。James H E等基于ASFV的拓撲異構(gòu)酶基因Ⅱ建立了用于ASFV快速診斷的高特異性的LAMP檢測法，檢測時長為30分鐘，相對于其他檢測方法而言耗時短。王建昌等依據(jù)ASFV的VP72基因序列建立了用于ASFV快速檢測的RPA技術(shù)。Fan等基于ASFV的B646L基因序列設(shè)計特異性引物，設(shè)計了用于ASFV檢測的高特異性的重組聚合酶輔助擴增檢測法。

4.其他核酸檢測方法。除了上述三類常見基于非洲豬瘟病毒核酸的檢測方法，還有數(shù)字PCR、納米PCR、探針雜交技術(shù)、微流控芯片技術(shù)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)等核酸檢測方法。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種新型的核酸檢測方法，如今已成為研究人員對于非洲豬瘟病毒檢測關(guān)注的焦點。王鑫杰等基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，建立了ASFV的核酸快速檢測方法，并開發(fā)了相應(yīng)的Cpf1試劑盒。郭春和等基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，建立了針對ASFV的精準(zhǔn)快速檢測方法。

四、總結(jié)

近年來，非洲豬瘟給國內(nèi)外的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大的威脅，造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，非洲豬瘟病毒快速檢測方法的建立顯得尤為重要。非洲豬瘟病毒快速檢測方法的建立，可以為ASF診斷、疫情確認與及時處置、防控以及凈化提供重要的技術(shù)手段。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，特別是分子水平檢測技術(shù)的發(fā)展，在保證檢測方法的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性以及可靠性的前提下，ASFV的檢測將會向著集約化、工業(yè)化、自動化、高通量、高性能、低成本方向發(fā)展，檢測用儀器設(shè)備也會向著微型化、便攜化趨勢發(fā)展，向社會提供隨時隨地、精準(zhǔn)快速的檢測技術(shù)。