張春梅，閆 芳，宋 海，張喜峰1,，陳 葉1,

(1. 河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2. 甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000;3. 河西學(xué)院 生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院，甘肅 張掖 734000)

黃參Sphallerocarpusracills，傘形科Apiaceae迷果芹屬Sphallerocarpus的單種植物[1]，在我國(guó)零星分布于西北、東北、華北地區(qū)，尤其分布于祁連山、焉支山(甘肅張掖市境內(nèi))，像張掖市山丹縣這樣大面積形成群落優(yōu)勢(shì)的情況很罕見(jiàn)[2]。研究黃參對(duì)祁連山區(qū)水土保持、遏制草場(chǎng)沙漠化和維持生物多樣性具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義?！侗静菥V目》中記載，黃參具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、通經(jīng)活絡(luò)等功效，其肉質(zhì)根富含人體必需的16種氨基酸，被譽(yù)為“小人參”[3]，作為營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)、藥用價(jià)值極高的天然珍品，黃參成為甘肅特產(chǎn)、西部開(kāi)發(fā)交易會(huì)指定產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力與開(kāi)發(fā)前景。由于生態(tài)環(huán)境惡化及當(dāng)?shù)匕傩盏穆訆Z式經(jīng)營(yíng)，野生黃參種群數(shù)量驟減[3]。

絕大部分非模式生物缺乏基因組數(shù)據(jù)，因此，獲得轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息尤為重要[4-7]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是獲取基因序列的首選方式[8-9]，非常有利于研究無(wú)參考基因組的非模式植物[10-11]，研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)有助于揭示生物體的基因表達(dá)、研究結(jié)構(gòu)變異、新基因以及植物的優(yōu)良性狀及功能基因的定位[12-15]。

目前，瀕危野生黃參種質(zhì)的功能基因組、基因序列信息及遺傳背景匱乏，對(duì)黃參的搶救性保護(hù)及其遺傳結(jié)構(gòu)研究迫切需要基因組資源。關(guān)于黃參轉(zhuǎn)錄組信息尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用BGISEQ-500平臺(tái)，對(duì)黃參幼嫩葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究黃參轉(zhuǎn)錄組，并結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)獲得的Unigene(轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)序列)開(kāi)展功能注釋、代謝通路和EST-SSR分析，獲得的轉(zhuǎn)錄組信息將為今后黃參分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和關(guān)鍵基因的克隆以及功能分析等提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為黃參基因組水平的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料采自甘肅省張掖市山丹縣軍馬場(chǎng)。野生黃參，于2018年5月進(jìn)行單株取樣，采集當(dāng)年剛生長(zhǎng)出的幼嫩葉片，迅速放入液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要儀器

超級(jí)工作臺(tái)(蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司)；多樣品組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；SANYO制冰機(jī)(濟(jì)南金茂科創(chuàng)科技有限公司)；冷凍離心機(jī)(CL-21R，Thermo，美國(guó))；超聲破碎儀(FS-150，Ultrasonic processor，中國(guó))；震蕩儀(Shaker，Thermo，美國(guó))；金屬浴(GL-150，其林貝爾，中國(guó))；分析天平(BSA224S，Sartorius，德國(guó))；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(麥克森公司)；NanoDrop 2000微量分光亮度計(jì)(Thermo Scientific, USA)；Agilent 2100 Bioanalyzer(美國(guó)安捷倫公司)；NovaseqTM6000(美國(guó)Illumina公司)。

1.2.2 主要試劑

TRIzol?Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、乙醇等化學(xué)試劑購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；NovaSeqTM6000 v1.5試劑盒(美國(guó)Illumina公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1 黃參葉片RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采集當(dāng)年剛生長(zhǎng)出的幼嫩葉片，液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱中，以保證RNA的相態(tài)保持在剛采摘時(shí)的狀態(tài)。采用試劑盒法，Trizol試劑，TIANGEN提取方法參照試劑說(shuō)明。葉肉細(xì)胞移入1.5 mL 離心管中，加入1 mL Trizol，混勻，室溫靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s， 靜置2 min；4 ℃12 000 g離心15 min，裂解液分層成水相和有機(jī)相，取上清；加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min；4 ℃ 12 000 g 離心10 min，棄上清，水相轉(zhuǎn)移后，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 ℃ 7 500 g離心5 min，短暫離心，吸去殘留液體，棄上清；晾干3～5 min；將獲得的RNA沉淀溶于30 μL的DEPC(焦炭酸二乙酯)水中。DEPC是RNA酶的強(qiáng)抑制劑，是一種潛在的致癌物質(zhì)，操作中應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。

1.3.2 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組序列組裝

取一定量的RNA 樣品，使用 oligo(dT)磁珠富集mRNA。加入試劑盒中提供的打斷試劑，適溫反應(yīng)一定時(shí)間后mRNA片段化。合成一鏈、二鏈cDNA。配制反應(yīng)體系，使接頭與cDNA連接。PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收、擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物變性，充分混勻，得到單鏈環(huán)形產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物變性，即得到文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量委托陜西致研生物科技有限公司使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)，檢測(cè)合格后采用BGISEQ-500測(cè)序。利用Trinity軟件對(duì)reads進(jìn)行序列組裝，使用BUSCO軟件對(duì)組裝序列進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估基因組裝完整性。

1.3.3 功能注釋及SSR檢測(cè)

利用生物信息學(xué)分析獲得的黃參Unigene。為獲得全面的基因功能信息，對(duì)組裝得到的Unigene進(jìn)行7大功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)∟R(NCBI non redundant protein sequences)、NT(NCBI nucleotide sequences)、KOG/COG(clusters of orthologous groups of proteins/eu-Karyotic ortholog groups)、GO (gene ontology，基因本體)、KEGG(kyoto encyelopedia of genes and genomes)、SwissProt (reviewed protein sequence database)和Pfam(protein family)。使用MISA對(duì)Unigene進(jìn)行檢測(cè)，軟件參數(shù)為1-12、2-6、3-5、4-5、5-4、6-4、100，150，其中：1-12代表單堿基重復(fù)至少12次才算SSR，100表示2個(gè)SSR之間的間隔堿基數(shù)大于100 bp，150表示SSR位點(diǎn)距離兩端側(cè)翼序列大于150 bp。雙堿基6次，三堿基5次，以此類(lèi)推，重復(fù)單元最多有6個(gè)堿基，2個(gè)微衛(wèi)星之間的距離小于100 bp。隨機(jī)選取10對(duì)引物，委托陜西致研生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序、de novo組裝

測(cè)序共獲得70.24 M原始讀數(shù)，去除低質(zhì)量的reads，得到68.48 M clean reads，最終獲得6.85 Gb。質(zhì)量評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表1，轉(zhuǎn)錄本和Unigene組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，測(cè)序得到的黃參數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以滿(mǎn)足后續(xù)的生物信息學(xué)分析。其中，長(zhǎng)度為200～300 bp的有25 343條Unigene(40.66%)，長(zhǎng)度為>300～500 bp的有16 463條Unigene(26.42%)，長(zhǎng)度為>500～3 000 bp的有15 276條Unigene(24.51%)，5 241條Unigene(10.01%)的長(zhǎng)度大于3 000 bp，由此可知，隨著基因長(zhǎng)度增加，基因數(shù)量下降。使用Transdecoder檢測(cè)出62 323個(gè)CDS(見(jiàn)表2)。

表1 黃參測(cè)序后的質(zhì)量評(píng)估Tab. 1 Quality evaluation of-sequencing output data in Sphallerocarpus racills

表2 黃參測(cè)序后的轉(zhuǎn)錄本和Unigene組裝統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Data assembly for transcript and unigene in transcriptome of Sphallerocarpus racills

2.2 黃參轉(zhuǎn)錄組基因總體注釋情況

對(duì)黃參轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行7大功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)Y(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，注釋成功的Unigene數(shù)目最多的是NR(e≤10-5)，有66 451條，占總Unigene的66.46%；NT(e≤10-5)有49 390條，占49.40%；Swissprot(e≤10-5)有48 281條，占48.29%；KEGG(e≤10-10)有51 479條，占51.49%； KOG(e≤10-3)有61 116條，占61.13%；Pfam(e≤0.01)有55 859條，占55.87%。GO(e≤10-3)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的基因最少，有36 958條，占36.97%；比對(duì)結(jié)果顯示，在7大數(shù)據(jù)庫(kù)中均能成功注釋的Unigene有17 074條，占總Unigene的17.08%。

表3 黃參轉(zhuǎn)錄組基因注釋情況統(tǒng)計(jì)Tab. 3 Statistics of gene annotation of Sphallerocarpus racills transcriptome

2.2.1 NR功能注釋

NR庫(kù)注釋結(jié)果的物種分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1顯示，匹配最多的物種是胡蘿卜Daucuscarotasubsp.sativus，注釋到的基因數(shù)量最多，共有45 239條，占比為68.08%，同源性最高；其余依次為大麥Hordeumvulgaresubsp.vulgare、向日葵Helianthusannuus、藍(lán)隱藻GuillardiathetaCCMP2712、輪藻Klebsormidiumnitens，分別有963、711、638、524條Unigene，占比分別為1.45%、1.07%、0.96%、0.85%，黃參與這4種植物的同源性均相對(duì)較低，同源序列都不足2%，剩下近30%分布于其他物種，共有18 333條Unigene(占27.59%)屬于其他序列。

圖1 根據(jù)NR注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)注釋不同物種的分布Fig. 1 Statistics of species distribution of Unigenes annotation in NR database for Sphallerocarpus racills

2.2.2 GO功能注釋分類(lèi)

注釋到生物學(xué)過(guò)程大類(lèi)(共15個(gè)亞類(lèi))的基因有18 317條，其中，占比最高的亞類(lèi)為細(xì)胞過(guò)程(cellular process)，注釋數(shù)量為11 026，其次為生物調(diào)節(jié)過(guò)程(biological regulation)，注釋數(shù)量為3 710，有關(guān)細(xì)胞增殖、碳利用等的基因表達(dá)甚少。

注釋到細(xì)胞組分大類(lèi)(共11個(gè)亞類(lèi))的基因有25 108條，其中，細(xì)胞(cell)和細(xì)胞膜組分(membrane part)占比最高，分別為11 062和10 341條，再次是細(xì)胞器部分(organelle part)，基因?yàn)? 512條，而定位于病毒核心、細(xì)胞器的基因幾乎未表達(dá)。

注釋到分子功能大類(lèi)(共14個(gè)亞類(lèi))的基因?yàn)?4 615條，其中，最具有代表性的是參與分子結(jié)合功能(binding)，注釋數(shù)量最多(18 119)，其次是與催化活性(catalytic activity)相關(guān)的基因，注釋數(shù)量為16 074，而與蛋白質(zhì)標(biāo)簽、分子載體活性、分子轉(zhuǎn)運(yùn)活性、養(yǎng)分庫(kù)活動(dòng)、毒素活性相關(guān)的基因幾乎未表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

圖2 Unigene的GO功能分類(lèi)Fig. 2 GO function classification of Unigene

2.2.3 代謝通路分析

KEGG注釋結(jié)果見(jiàn)圖3，注釋到51 479條Unigene，占總Unigene的51.49%。注釋成功的所有Unigene歸屬到5大類(lèi)代謝通路中的20條通路。11條與代謝有關(guān)的通路，有15 162個(gè)Unigene，占29.45%：以全局和總覽圖代謝通路(global and overview maps)在所有代謝通路中所占比例最高(11 346個(gè)，22.04%)。其次為碳水化合物代謝通路(4 137個(gè)，8.04%)和脂類(lèi)代謝通路(2 618個(gè)，5.09%)。與遺傳信息處理相關(guān)的代謝通路有4條，其中以翻譯過(guò)程(translation，4 341，8.43%)所占比例最高，其次是折疊、分類(lèi)與降解(folding, sorting and degradation，3 851，7.49%)代謝通路。與環(huán)境信息處理相關(guān)的通路有2條——信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)和膜運(yùn)輸(membrane transport)，分別為2 489、446條。細(xì)胞過(guò)程和生物系統(tǒng)的相關(guān)通路最少，各有1條，占4.67%和3.30%。

圖3 黃參轉(zhuǎn)錄組Unigene的代謝通路功能分布統(tǒng)計(jì)Fig. 3 KEGG classification of Sphallerocarpus racills transcriptome

2.2.4 KOG注釋分類(lèi)

KOG數(shù)據(jù)庫(kù)包含了7個(gè)完整基因組真核生物的直系同源家族蛋白質(zhì)。黃參轉(zhuǎn)錄組有61 116條Unigeine獲得了注釋?zhuān)伎俇nigene的61.13%，分為26大類(lèi)功能區(qū)，包括功能預(yù)測(cè)、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、分子加工、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝等蛋白質(zhì)家族。在不同的功能分類(lèi)中，基因數(shù)量存在明顯差異，一般功能預(yù)測(cè)類(lèi)基因數(shù)量最多(11 205，18.33%)，其次是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(7 618，12.46%)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)運(yùn)輸(5 306，8.68%)、未知功能(5 019，8.21%)、轉(zhuǎn)錄(4 006，6.56%)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(3 694，6.04%)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸(3 616，5.92%)、RNA加工和修飾(3 412，5.59%)。除此之外，負(fù)責(zé)碳水化合物運(yùn)輸與代謝有2 510個(gè)Unigene(4.11%)，負(fù)責(zé)脂類(lèi)運(yùn)輸和代謝有2 391個(gè)Unigene(3.91%)，同時(shí)1 984個(gè)Unigene負(fù)責(zé)能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、細(xì)胞骨架、次生代謝產(chǎn)物生物合成與轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制、重組與修復(fù)、細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、細(xì)胞分裂、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、防御機(jī)制及輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝匹配數(shù)目較少(均小于3%)(圖4)。只有極少數(shù)Unigene負(fù)責(zé)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)(均小于0.13%)。由此可見(jiàn)，黃參中功能預(yù)測(cè)的基因最多，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、修飾及蛋白質(zhì)運(yùn)輸參與的基因次之，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)最少。

圖4 黃參轉(zhuǎn)錄組Unigene的KOG注釋分類(lèi)Fig. 4 KOG classification of Sphallerocarpus racills

2.3 基因轉(zhuǎn)錄因子分析

植物轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)也稱(chēng)為反式作用因子，是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，與應(yīng)答生物和非生物脅迫密切相關(guān)。與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB類(lèi)、bZIP類(lèi)、WRKY類(lèi)、AP2/EREBP類(lèi)和NAC類(lèi)5個(gè)大家族[16]。對(duì)黃參轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖5，共預(yù)測(cè)到2 370個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的Unigene，分布在57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中。由圖5可知，C2H2屬于最大家族，Unigene數(shù)量為268個(gè)，占總Unigene數(shù)量的11.31%；其次是MYB、WRKY、BHLH、C3H、AP2-EREBP、NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族較多，Unigene數(shù)量分別為220、154、145、130、121、110，分別占9.28%、6.49%、6.10%、5.49%、5.06%、4.64%。轉(zhuǎn)錄因子的分析可從功能基因組的水平上為進(jìn)一步開(kāi)展黃參研究提供數(shù)據(jù)支持。

圖5 黃參轉(zhuǎn)錄因子家族分布Fig. 5 Transcription factor family distributionin Sphallerocarpus racills

2.4 黃參轉(zhuǎn)錄組SSR檢測(cè)分析

對(duì)黃參轉(zhuǎn)錄組Unigene的簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR(simple sequence repeat)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示17 308個(gè)SSR分布于13 256個(gè)Unigene中。二堿基重復(fù)的數(shù)量最多(6 721，38.83%)，其次是三堿基重復(fù)(6 302，23.21%)，其余為單堿基重復(fù)(3 378，19.52%)、五堿基重復(fù)(363，2.10%)，最少的是四堿基和六堿基重復(fù)，均為272，占1.57%(見(jiàn)表4)。二堿基SSR中，重復(fù)頻率最高是TA、AT和TC，最低是GC；三堿基重復(fù)總共60種，發(fā)生頻率最高的是CAA、TGTTTG，最低的是CGA和CGG；四堿基重復(fù)頻率最高是AAAT、CACT和TTTG，最低是ACAG。重復(fù)次數(shù)越多，多態(tài)性越高，多態(tài)性位點(diǎn)較多的是二、三堿基重復(fù)，去除SSR位點(diǎn)靠前或靠后的序列，將序列輸入Primer3引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)其中的10對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 黃參SSR分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab. 4 Summary of simple sequence repeat (SSR) in Sphallerocarpus racills

表5 黃參SSR部分引物(10對(duì))設(shè)計(jì)表Tab. 5 Information of partial primers of development in Sphallerocarpus racills (10 pairs)

3 討論與結(jié)論

高通量測(cè)序深受研究者歡迎，并越來(lái)越多地應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題。例如，在基因組水平上對(duì)還沒(méi)有參考序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序，獲得該物種的參考序列。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到植物特殊功能基因的挖掘與鑒定[17]，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)。本研究采用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)黃參葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了野生黃參功能基因組信息。全長(zhǎng)非嵌合序列中存在大量的冗余序列，將其聚類(lèi)到一起進(jìn)行去冗余，得到新的一致性序列，然后將非全長(zhǎng)序列比對(duì)到一致性序列上進(jìn)行校正，最終得到準(zhǔn)確度大于99%的高質(zhì)量序列，即為轉(zhuǎn)錄本。本研究最終得到總有效堿基數(shù)6.85 Gb，得到99 981個(gè)Unigene，轉(zhuǎn)錄本總長(zhǎng)度113 850 816 bp，平均長(zhǎng)度1 138 bp，N50的長(zhǎng)度1 874 bp，GC含量39.93%。N50是評(píng)價(jià)組裝序列完整性的重要指標(biāo)，N50越長(zhǎng)，代表組裝的完整性越好。本研究結(jié)果顯示，黃參Q20(堿基正確識(shí)別率達(dá)99%)序列占96.42%，Q30(堿基正確識(shí)別率達(dá)99.9%)高質(zhì)量序列占92.09%，堿基錯(cuò)誤率為0.01%，低于1%，表明所獲得的黃參轉(zhuǎn)錄組序列質(zhì)量較高。

將黃參Unigene比對(duì)到7大功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)渲校?)黃參Unigene比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫(kù)共有66 451條注釋成功，與胡蘿卜有較高同源性，而與其他物種的同源性較低。2)GO分析顯示，黃參有78 040條Unigene得到注釋?zhuān)垂δ芊譃樯镞^(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能3大類(lèi)，分別有15、11、14個(gè)亞類(lèi)，最富集的通路主要是在生物學(xué)過(guò)程中。3)在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析結(jié)果中，黃參共有61 116條Unigeine獲得了注釋。26個(gè)可能的功能大類(lèi)中，黃參功能預(yù)測(cè)的基因最多，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、修飾及蛋白質(zhì)運(yùn)輸參與的基因次之，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)最少。4)KEGG是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具，涵蓋了藥物開(kāi)發(fā)(drug development)、細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類(lèi)疾病，僅限動(dòng)物(human diseases)、代謝(metabolism)、生物系統(tǒng)(organismal systems)等方面。本研究中黃參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的有富集在20條代謝通路中的51 479個(gè)Unigenes，與代謝相關(guān)的通路最多，第2位是碳水化合物代謝基因。該發(fā)現(xiàn)有助于揭示黃參淀粉及藥用物質(zhì)合成途徑，功能基因的分析、代謝通路的注釋等，為后期開(kāi)展黃參的代謝組學(xué)、功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)，這部分內(nèi)容將在后續(xù)工作中做進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)錄因子也稱(chēng)為反式作用因子，是指能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控多個(gè)與抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，使植物的抗逆性得到改善，可為基礎(chǔ)研究及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，因此，也逐漸成為植物抗逆機(jī)制研究的核心內(nèi)容。植物的抗逆性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族均與植物的抗逆性有重要關(guān)系。目前已從高等植物中分離鑒定出數(shù)百種轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆性密切相關(guān)，可調(diào)控植物體感受干旱、高鹽、低溫和病原等信號(hào)的相關(guān)基因的表達(dá)[18]。C2H2型鋅指蛋白主要涉及生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)控植物抗逆境脅迫、抗病和生長(zhǎng)發(fā)育方面的生物學(xué)功能[19]；MYB轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫逆境[20]；WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近幾年研究比較熱的與植物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[21]，參與轉(zhuǎn)錄重編程的調(diào)控[22]，在多種生物和非生物脅迫及諸如水楊酸[23]、赤霉素[24]等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。目前，越來(lái)越多的研究表明WRKYs是ABA應(yīng)答信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[24]。BHLH是第二大類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，還參與調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激素合成[25]，結(jié)構(gòu)高度保守，它和NAC一樣，是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)不同的生物脅迫和低溫、干旱及高鹽等非生物逆境[25]。生長(zhǎng)在祁連山中的黃參抗逆性強(qiáng)，通過(guò)研究這些轉(zhuǎn)錄因子，將有利于進(jìn)一步揭示這些轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控黃參更好地適應(yīng)逆境脅迫。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR標(biāo)記是目前最理想的分子標(biāo)記，廣泛用于開(kāi)展遺傳多樣性、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建和比較基因組學(xué)研究[15]。本試驗(yàn)的SSR分析結(jié)果為野生黃參的分子標(biāo)記及遺傳學(xué)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果揭示，黃參具有豐富的基因表達(dá)，并通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得了黃參基因的注釋信息及代謝通路，獲得的轉(zhuǎn)錄組信息將為后續(xù)黃參分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和關(guān)鍵基因的克隆及功能分析等研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。