馬原軍， 王晉， 董青山， 何峰， 陳曉華， 苗輝， 于世賓

1. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院解剖生理學(xué)教研室，陜西 西安（710032）； 2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院口腔科，湖北武漢（430070）； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系輻射防護醫(yī)學(xué)教研室，陜西 西安（710032）

與大多數(shù)科學(xué)技術(shù)一樣，電磁脈沖（electromagnetic pulse，EMP）是一把“雙刃劍”，不同強度的物理參數(shù)作用于生物體，會產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)［1］。近年來國內(nèi)外學(xué)者對EMP 的生物學(xué)效應(yīng)研究主要集中在低頻率（頻率小于100 Hz）、低能量（磁場強度小于20 mT）領(lǐng)域，并發(fā)現(xiàn)適宜的EMP 可直接作用于軟骨和骨，積極維護軟骨和骨的內(nèi)穩(wěn)態(tài)［2-7］，并且還能促進骨內(nèi)血管生成［8］。而對于高能EMP 的生物學(xué)效應(yīng)研究較少。頜面部屬于人體的主要暴露部位，在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中致傷機會較多，更易受到EMP 的影響。顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）是頜面部唯一的關(guān)節(jié)，更是口頜系統(tǒng)功能（開閉口、咀嚼、言語等）發(fā)揮的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其主要組成部分髁突軟骨更是下頜骨的重要生發(fā)中心，具有終身改建能力。因此，探究高強度EMP 對髁突軟骨的生物學(xué)效應(yīng)具有重要意義。本研究擬探索不同高強度（電場強度在100～1 000 kV/m）EMP 照射對大鼠髁突軟骨的生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 動物、EMP 暴露和TMJ 組織制備

取8周齡雄性SD大鼠66只，體質(zhì)量190 ～210 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供（動物合格證號：SYXK（陜）2021-0036）。將大鼠隨機分為假輻照組（Sham 組）、輻照組（EMP 組），并按照場強的不同，將EMP 組 分 為EMP1 組（500 kV/m）和EMP2 組（270 kV/m）。EMP 組大鼠均接受持續(xù)10 000 次的脈沖電磁輻射，頻率10 Hz，脈寬40 ns，上升前沿20 ns，重復(fù)頻率1 pps。根據(jù)輻照后1 h、3 h、12 h、24 h、3 d 不同取材時間點將EMP 組大鼠分為5 個亞組，每組均6 只大鼠。研究期間，所有的大鼠都在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)，并喂食滅菌食物和蒸餾水，本研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審核通過（審批號：2021 倫審字080 號）。

于輻照后1 h、3 h、12 h、24 h、3 d 用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉動物，解剖分離雙側(cè)TMJ 組織，其中每只大鼠的左側(cè)TMJ 于4%多聚甲醛中固定24 h，脫鈣后石蠟包埋，進行連續(xù)切片；右側(cè)TMJ沿髁突頭部將軟骨組織剪下并放于-80 ℃凍存，用于Western blot 檢測。

1.2 主要試劑和儀器

免疫組化：COL2A1 小鼠抗體（sc-52658，Santa Cruz，美國）、ADAMTS-5 兔抗體（DF13268，Affinity，美國）、MMP-13 兔抗體（DF6494，Affinity，美國）、cleaved-Caspase3 兔抗體（AF7022，Affinity，美國）。

Westerm blot：ADAMTS-5 兔抗體（DF13268，Affinity，美國）、MMP-13 兔抗體（DF6494，Affinity，美國）、cleaved-Caspase3 兔抗體（AF7022，Affinity，美國）。β-actin 兔抗體（4970S，CST，美國）。Tripure裂解液（Roche，德國），SDS-PAGE 配膠試劑盒（Bio-Rad，美國）。BCA 試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）。Chemi-Doc XRS+WB 發(fā)光成像系統(tǒng)（1708265，Bio-Rad，美國）。

硬組織切片機（RM2255，徠卡，德國），光學(xué)顯微鏡（DM2000，徠卡，德國），熒光顯微鏡（CKX53，Olympus，日本），HE（碧云天，中國）和番紅O固綠（Sigma-Aldrich，美國），TUNNEL 試劑盒（碧云天，中國）。

1.3 HE 染色和番紅O 固綠染色

將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，分別進行HE 和番紅O 固綠染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察髁突軟骨中帶的形態(tài)（圖1 虛線所示）并拍照，在Photoshop 軟件中測量軟骨全層厚度（圖1 直線所示）和番紅O固綠陽性面積占比。

Figure 1 Schematic diagram of TMJ cartilage histomorphology in rats(×200)圖1 大鼠TMJ 軟骨組織形態(tài)學(xué)示意圖(×200)

1.4 免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，參照SABC 法進行免疫組化染色。使用COL2A1抗體（1∶50）、ADAMTS-5抗體（1∶200）、MMP-13 抗體（1∶200）、cleaved-Caspase3 抗體（1∶200）。采集圖像后，在200 倍視野下的軟骨中帶隨機選取3 個1 000 dpi × 2 000 dpi 且覆蓋全部肥大層的區(qū)域（圖1 方框所示），計算Ⅱ型膠原陽性面積比和陽性細胞率。

1.5 TUNEL 染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，參照說明書進行TUNEL 染色以檢測軟骨細胞凋亡情況。在熒光顯微鏡下進行分析，每組隨機選取3 張圖像進行計數(shù)并比較各組軟骨中TUNEL 陽性細胞數(shù)量。

1.6 Western blot 檢測

通過Tripure 裂解液溶解髁突軟骨組織并提取總蛋白，BCA 法測定蛋白總量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，分別用ADAMTS-5（1∶1 000）、MMP-13（1∶2 000）、cleaved-Caspase3（1∶2 000）的一抗進行孵育。β-actin（1∶4 000）作為內(nèi)參對照。二抗孵育后常規(guī)ECL 發(fā)光，然后在Chemi-Doc XRS+WB 發(fā)光成像系統(tǒng)下顯影。圖像采集后運用Image Lab 5.2.1 軟件進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用雙盲法對所有圖片進行采集、計數(shù)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差的形式表示，采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組之間的差異采取oneway ANVOA 檢驗，組與組之間的兩兩比較采取Tukey 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高強度的EMP 照射引起了髁突軟骨的退行性變

如圖2 所示，在Sham 組中，HE 染色顯示髁突軟骨各層細胞排列規(guī)則，層次清晰，纖維層表面完整；番紅O 固綠染色顯示，染色陽性的蛋白聚糖分布均勻、規(guī)則，主要分布于軟骨肥大層及前肥大層，少量分布于增殖層，且與固綠著色分界清晰；Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示，Ⅱ型膠原陽性區(qū)域與蛋白聚糖類似，主要分布于肥大層及前肥大層。

經(jīng)EMP 暴露后，HE 染色顯示EMP1 組輻照后1 h、3 h、12 h、24 h、3 d 和EMP2 組輻照后1、3 h 的髁突軟骨表層完整性遭破壞，出現(xiàn)了纖維層少量剝脫（箭頭所示），各組髁突軟骨厚度對比Sham 組均未見明顯差異（P＞0.05）；番紅O 固綠染色顯示EMP 兩組輻照后12、24 h 出現(xiàn)了蛋白聚糖的分布不規(guī)則，陽性面積百分比顯著下降（EMP1 12 h：q=4.882，P＜0.01；EMP1 24 h：q= 5.808，P＜0.01；EMP2 12 h：q= 3.001，P＜0.05；EMP2 24 h：q=3.990，P＜0.05）；Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示對比Sham 組，EMP1 組輻照后3、12 h 出現(xiàn)了Ⅱ型膠原的染色不均，陽性面積百分比顯著下降（3 h：q=3.546，P＜0.05；12 h：q= 6.760，P＜0.001），而EMP2 組未見明顯異常（P＞0.05）。

2.2 高強度的EMP 照射促進了髁突軟骨基質(zhì)降解因子的表達

如圖3 所示，在Sham 組中，免疫組化染色結(jié)果顯示軟骨基質(zhì)降解因子ADAMTS-5 和MMP-13 主要分布于髁突軟骨前肥大層和肥大層淺層，陽性細胞少且染色淺。

對比Sham 組，EMP1 組中ADAMTS-5 在輻照后3、12、24 h（3 h：q= 3.394，P＜0.05；12 h：q= 5.530，P＜0.01；24 h：q= 4.923，P＜0.01）和MMP-13 在輻照 后3、12 h（3 h：q= 3.758，P＜0.05；12 h：q=5.312，P＜0.01）的染色陽性細胞率顯著增大，并逐漸擴大到肥大層全層。EMP2組中，ADAMTS-5在輻照 后3、12 h（3 h：q= 3.213，P＜0.05；12 h：q=3.168，P＜0.05）和MMP-13 在 輻 照 后12 h（q=3.030，P＜0.05）的染色陽性細胞率對比Sham 組顯著增大，而分布范圍較EMP1 組小。

如 圖4 所 示，經(jīng)EMP 暴 露 后，對 比Sham 組，EMP1 組髁突軟骨的ADAMTS-5 蛋白表達在輻照后1、3、12 h 明顯上升（1 h：q=3.779，P＜0.05；3 h：q=2.962，P＜0.05；12 h：q= 3.098，P＜0.05），MMP-13蛋白表達在輻照后1、3 h 明顯上升（1 h：q= 3.509，P＜0.05；3 h：q= 3.024，P＜0.05）；EMP2 組髁突軟骨的ADAMTS-5 蛋白表達在輻照后1 h 明顯上升（q= 4.189，P＜0.05），而MMP-13 蛋白表達在各時間點未見明顯差異。

2.3 高強度的EMP 照射促進了髁突軟骨細胞的凋亡

如圖5 所示，在Sham 組中，髁突軟骨全層幾乎沒有TUNEL 染色陽性的凋亡細胞。對比Sham 組軟骨，EMP1 組在輻照后1、3、12、24 h（1 h：q=3.063，P＜0.05；3 h：q= 4.940，P＜0.01；12 h：q=5.518，P＜0.01；24 h：q= 4.048，P＜0.01）和EMP2組軟骨在輻照后1、3、12 h（1 h：q=3.155，P＜0.05；3 h：q= 3.627，P＜0.05；12 h：q= 3.651，P＜0.05）時，TUNEL 陽性細胞數(shù)量明顯增多，并且TUNEL 陽性細胞多位于髁突軟骨的纖維層及增殖層。凋亡關(guān)鍵分子cleaved-Caspase3 的免疫組化染色結(jié)果顯示，Sham 組中染色陽性細胞數(shù)量較少且染色淺。對比Sham 組軟骨，EMP1 組在輻照后1、3、12 h（1 h：q= 3.420，P＜0.05；3 h：q= 5.251，P＜0.01；12 h：q= 4.273，P＜0.01）和EMP2 組在輻照后3 h、12 h（3 h：q= 3.594，P＜0.05；12 h：q= 3.455，P＜0.05）時，cleaved-Caspase3 陽性細胞率明顯上升，并且出現(xiàn)胞質(zhì)深染，陽性范圍擴大到增殖層。

如圖4 所示，經(jīng)EMP 暴露后，對比Sham 組，EMP1 組髁突軟骨的cleaved-Caspase3 蛋白表達在輻照后3、12、24 h 明顯上升（3 h：q= 3.964，P＜0.01；12 h：q= 4.775，P＜0.01；24 h：q= 3.043，P＜0.05）；EMP2 組髁突軟骨的cleaved-Caspase3 蛋白表達在輻照后3 h 明顯上升（q=3.798，P＜0.05）。

3 討 論

近年來隨著無線電通訊設(shè)備和電磁能設(shè)備使用的迅速增長，EMP 對人類健康的影響越來越受到公眾的關(guān)注。目前國內(nèi)外文獻中僅有少量研究嘗試模擬高頻、高場強的EMP 來探索其生物學(xué)效應(yīng)。2015 年Liu 等［9］發(fā)現(xiàn)900 MHz 的高頻輻射可以導(dǎo)致精子脂質(zhì)過氧化增加。2019 年Li 等［10］發(fā)現(xiàn)1 800 MHz 的電磁輻射可引起NIH/3T3 細胞凋亡率增加、凋亡相關(guān)分子p53 表達上調(diào)和線粒體損傷。2019 年Li 等［11］將大鼠置于400 kV/m 的電磁場中給予200 次脈沖刺激1、6、24 h 后，發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮層細胞凋亡，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷，其機制可能通過Toll 樣受體（Toll-like receptors 4，TLRs）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號激活了小膠質(zhì)細胞并誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)。2020 年王文瑩等［12］研究發(fā)現(xiàn)場強700 kV/m、頻率1 Hz 的EMP 照射7、14 d 能夠明顯損傷大鼠的海馬體神經(jīng)元，并且損傷程度與暴露時間呈正相關(guān)。以上研究均提示一定強度EMP 可以造成機體損傷，但目前國內(nèi)外尚未見到有關(guān)高強度EMP 對頜面部組織的生物效應(yīng)研究。

作為TMJ 的重要組成部分和頜面部骨骼的重要生發(fā)中心之一，髁突軟骨屬纖維軟骨。在復(fù)雜的下頜運動中，髁突軟骨發(fā)揮著重要的應(yīng)力緩沖、關(guān)節(jié)潤滑等作用［13］。髁突軟骨主要由軟骨細胞和軟骨細胞外基質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)中含有豐富的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原成分，這些成分對于維持軟骨的抗剪切、抗拉伸、抗壓縮性能至關(guān)重要［14］。然而，一旦TMJ 發(fā)生病變，軟骨基質(zhì)成分和細胞因子的改變可以直接或間接地參與關(guān)節(jié)退變過程［15］。髁突軟骨退變早期主要表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)降解、軟骨細胞凋亡等［15-17］，繼而引起軟骨下骨的異常骨改建［18］。本實驗?zāi)M了高強度電磁輻射環(huán)境對大鼠TMJ 軟骨的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在EMP 組中大鼠髁突軟骨纖維表層出現(xiàn)了不同程度的剝脫、軟骨細胞外基質(zhì)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的染色異常、髁突軟骨細胞基質(zhì)降解和凋亡相關(guān)分子表達升高、TUNEL 陽性的凋亡細胞數(shù)量增多等早期關(guān)節(jié)退變癥狀，這提示髁突軟骨是高強度EMP 的重要靶器官，高強度的EMP 可以誘發(fā)髁突軟骨的退行性變，直接影響軟骨穩(wěn)態(tài)的維持。該結(jié)果與當(dāng)前研究中報道的低頻率、低能量EMP 可以顯著逆轉(zhuǎn)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）進程中的軟骨退行性變進程［19-22］恰好相反，這也進一步印證了EMP 的“雙刃劍”效應(yīng)。

本研究中觀察到實驗組的大鼠髁突軟骨在EMP 輻照后的24 h 內(nèi)均出現(xiàn)了明顯損傷，并且損傷持續(xù)時間隨輻照參數(shù)不同而產(chǎn)生差異，但最終兩組病損隨時間逐漸恢復(fù)，并在3 d 時檢測指標未見明顯差異，這提示EMP 可以造成大鼠髁突軟骨早期的一過性損傷。然而也有文獻報道EMP 的生物學(xué)效應(yīng)具有波動性，其能量在動物體內(nèi)蓄積后可以在較長的時間內(nèi)，在不同時間點導(dǎo)致不同程度的損傷效應(yīng)［23-24］。因此，EMP 對大鼠髁突軟骨的遠期損傷效應(yīng)有待進一步研究。

與此同時，本研究仍然存在幾點不足：首先實驗中EMP 組大鼠僅接受了10 Hz、10 000 次的脈沖電磁輻射，即暴露時間約為17 min。其次，本實驗以8 周齡雄性SD 大鼠為研究對象，未涉及雌性大鼠或其他年齡段雄性大鼠的影響，并且在檢測指標中未對輻照后大鼠的行為學(xué)變化進行觀察。未來將針對以上問題開展進一步研究。

【Author contributions】 Ma YJ, Yu SB designed the main experiments, analyzed the data and wrote article. Wang J, Dong QS, He F,Chen XH, Miao H contributed to the acquisition and analysis of data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.