朱清亮，李增平，丁婧鈺，張 宇，程樂樂

（海南大學 植物保護學院，?？?570228）

相思樹（Acaciaspp.）是豆科相思子屬的一種常綠喬木，常見的有臺灣相思（A. confuseMerr.）、馬占相思（A. mangiumWilld.）、耳葉相思（A. auriculiformisA.Cunn.ex Benth.）等。相思樹具根瘤固氮，速生豐產(chǎn)，改土性能好的特點[1]。相思樹的木材纖維含量高，是造紙的優(yōu)良材料，也可制成枕木以及各類家具與農(nóng)具，還可以用作飼料與薪炭材，馬占相思樹皮可以制作品質(zhì)優(yōu)良的栲膠[2-4]。此外，相思樹還是優(yōu)良的速生行道樹與綠化植物，也是我國南方沿海防風林主要的造林樹種之一，其在我國的工業(yè)發(fā)展與生態(tài)建設上發(fā)揮著重要的作用[2]。海南地處中國的熱帶地區(qū)，在多種生態(tài)環(huán)境下，特別是在熱帶雨林中，生長著各種大型真菌，在眾多的大型真菌類群中，以靈芝科（Ganodermataceae）最為常見，其物種數(shù)目多達72種，占中國已知靈芝科真菌總數(shù)的70%左右，其中的15種在海南被作為藥用真菌[5]。近年來，筆者在田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在海南不同市縣種植的臺灣相思、馬占相思和耳葉相思均有受靈芝菌侵染后引發(fā)的根腐病，導致相思樹整株枯死，并在林間形成中心病區(qū)。目前，國內(nèi)外對靈芝（Ganoderma）侵染引起的相思樹紅根病有一定的報道。1988年，弓明欽[6]在對海南進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，多種樹木包括如青皮象耳豆（Enterolobium contortisiliquum）、紅皮 象 耳 豆（E. contortisiliqum）、臺 灣 相 思（A.confuse）、鳳凰木（Delonix regia）、鐵刀木（Cassia siamea）等受到熱帶靈芝（Ganoderma tropicum）與擬熱帶靈芝（G. ahmadii）侵染引起根腐病且發(fā)病較重，但未對2種病原進行致病性測定與進一步的鑒定。1993年，MAHMUD等[7]報道了馬來西亞與巴布亞新幾內(nèi)亞的馬占相思上發(fā)生根腐病。1996年，Mehrotra等[8]鑒定了印度馬占相思根腐病的病原菌為靈芝（G. lucidum）。1998—2001年，岑炳沾等[9]對廣東相思樹主要栽培區(qū)進行調(diào)查，根據(jù)子實體形態(tài)將廣東馬占相思與耳葉相思根腐病病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum(Leyss.ex Fr.) Karst.），并鑒定臺灣相思根腐病病原菌為假芝菌（Amauroderma omphalodes(Berk.)Torr.）。劉運華等[10]對廣西的相思樹進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)馬占相思心腐均是從間伐的傷口開始，再擴展到心材并向上下蔓延。2002年，戴玉成等[11]在海南考察時發(fā)現(xiàn)了臺灣相思樹干基腐朽病，并通過形態(tài)觀察將病原鑒定為熱帶靈芝（G. tropicum）與粗柄假芝（A. elmerianum）。秦凡文[12]在對海南省橡膠園靈芝屬真菌進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)熱帶靈芝（G. tropicum）是危害相思樹并造成死亡的重要病原物。但已有的相關報道主要以傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法為主，由于靈芝在不同生境下的形態(tài)可塑性較強，其鑒定結(jié)果往往容易受到環(huán)境與研究者主觀因素的干擾。同時，目前尚未見有熱帶靈芝（G.tropicum）引起相思樹種紅根病的系統(tǒng)性報道。為進一步明確引起海南相思樹根腐病的病原靈芝菌種類，本研究結(jié)合形態(tài)學與分子生物學手段對海南相思樹靈芝菌根腐病病原菌進行了系統(tǒng)性鑒定，以期為生產(chǎn)上防治海南相思樹靈芝菌根腐病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本臺灣相思根腐病樣本采自海南省?？谑薪鹋X公園（20°0′40′′N，110°19′8′′E）、馬占相思根腐病樣本采自儋州西慶農(nóng)場（19°32′11′′N，109°26′50′′E）、耳葉相思根腐病樣本采自昌江紅林農(nóng)場（19°17′37′′N，108°57′55′′E）等地。從發(fā)病相思上采集靈芝菌擔子果，對病株進行拍照、定位并記錄。擔子果用塑料保鮮袋裝好帶回并設計編號，拍照，測量大小。

1.2 供試苗木選擇種植于海南大學植物保護學院教學實踐基地內(nèi)2～3 a生的臺灣相思、馬占相思、耳葉相思等作為供試苗木。

1.3 培養(yǎng)基PDA與木屑培養(yǎng)基分別參照文獻[13-14]提供的配制方法。

1.4 引物與試劑PCR引物由生工生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。OMEGA Fungal DNA Kit，DNA Marker DL2000，2×TaqMasterMix(Dye)。

表1 用于擴增病原菌ITS、SSU與LSU基因的引物序列

1.5 菌株分離采用擔子果組織分離法分離菌株。具體方法參考方中達《植病研究方法》[13]，純化出菌株后備用，從臺灣相思、馬占相思與耳葉相思上采集到的靈芝屬擔子果上分離的菌株中各選擇1株分別命名為TWXSGF001、MZXSGF001和EYXSGF001。

1.6 致病性測定接種方法參照文獻[14]的方法，略加改動，先配制木屑培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌3 h后備用。從長有目標菌株菌落的培養(yǎng)基上劃取菌絲塊，放置在袋裝木屑培養(yǎng)基中，用報紙包裹室溫黑暗放置30 d，當木屑培養(yǎng)基表面長滿菌絲后用作接種體，進行致病性測定。以相同方法制作接入空白瓊脂塊的木屑棒作為對照。選擇5株健康的臺灣相思、馬占相思與耳葉相思幼樹，在莖干基部制造傷口，將布滿菌絲的接種體貼于傷口，下方用濕棉花保濕，再用保鮮膜纏繞固定接種體，對照組采用相同方法，2個月后檢查苗木接種部位的發(fā)病情況并拍照。

1.7 病原菌鑒定

1.7.1 形態(tài)學鑒定以趙繼鼎《中國真菌志》第十八卷靈芝科[18]、卯曉嵐《中國大型真菌》[19]、吳興亮《中國靈芝圖鑒》[20]等書籍為依據(jù)對病原菌進行形態(tài)學鑒定。觀察病原菌擔子果的形狀、大小、顏色、有無菌柄、有無光澤、菌肉質(zhì)地、擔孢子直徑顏色等形態(tài)特征并進行拍照記錄。

1.7.2 分子鑒定用真菌DNA提取試劑盒提取供試擔子果的DNA，使用引物ITS1/ITS4，NS1/NS4和LROR/LR7對所提取的DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系見表1。PCR擴增產(chǎn)物送至?？陂缴锛夹g(shù)有限公司測序，將獲得的測序結(jié)果在NCBI上進行比對并上傳NCBI獲得GenBank登錄號。在GenBank上搜尋靈芝與其他屬中同時含有ITS，SSU，LSU基因的菌株，下載相關序列，使用Sequences Matrix進行拼接，使用MEGA7.0對拼接好的序列通過NJ法構(gòu)建進化樹，對所采集的病原菌進行分子鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)分析處理所測數(shù)據(jù)用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

2.1.1 臺灣相思紅根病癥狀臺灣相思在發(fā)病初期出現(xiàn)葉片褪綠、發(fā)黃、下垂，樹勢差，新生葉子變小等癥狀，隨著病程進展，樹葉逐漸枯萎，枯枝變多，樹冠變小，最后整株枯死（圖1-A、圖1-B）。在臺灣相思的樹干和莖基部，可以產(chǎn)生大量的擔子果，其形態(tài)隨不同地區(qū)生長環(huán)境變化而產(chǎn)生差異（圖1-C）。發(fā)病莖干和樹根會產(chǎn)生海綿狀濕腐（圖1-D），病根表面黏泥沙（圖1-E），用水洗凈后可見黑紅色革質(zhì)菌膜（圖1-F）。海南各地臺灣相思紅根病的癥狀基本相似，總體田間發(fā)病率約為3%～4%。

圖1 臺灣相思樹紅根病癥狀

擔子果編號：HNHKJNL201909281003；HNDZ-202010221023；HNHK202108111034；HNHK2021-08111035；HNHK202108119036；HNHK2021081-11037。

2.1.2 馬占相思紅根病癥狀馬占相思在發(fā)病初期無明顯癥狀，后出現(xiàn)葉片發(fā)黃，萎垂，脫落（圖2-A），樹冠稀疏，部分枝條在葉片脫落后枯死。病株生長不良，長勢衰弱，最終整株葉片脫落并枯死（圖2-B）。在環(huán)境條件適合時，莖干和莖干基部能產(chǎn)生黃褐色到紅褐色的擔子果（圖2-C），即使枯樹被砍倒，樹樁上多處在雨季過后依然會長出擔子果（圖2-D）。該病發(fā)生較多，在儋州、定安、陵水等地均有發(fā)現(xiàn)，田間發(fā)病率為4%～5%。

圖2 馬占相思紅根病癥狀

擔子果編號；HNDZDC201910161005；HNXQ-202001061011；HNBS202008291013；HNDA2020-09031016；HNDA202009031017；HNDA20201021-1021；HNLS 202011201025；HNDA202108141043；HNQH20 2109051057。

2.1.3 耳葉相思紅根病癥狀耳葉相思受到侵染后隨著病情發(fā)展出現(xiàn)樹冠稀疏，葉片短小，發(fā)黃、下垂，枯枝多等癥狀，發(fā)病后期整株枯死（圖3-A、圖3-B）。病株死后變成枯樹，病原菌依然能夠在其病殘體特別是根莖部存活數(shù)年。在環(huán)境濕度大的時候，病樹的莖干和莖基部上會長出紅褐色擔子果（圖3-C～圖3-E）。耳葉相思根腐發(fā)病較少，田間發(fā)病率約為1%～2%。

擔子果編號：HNCJ202108261036；HNDZXL-202109271068。

2.2 致病性測定人工接種2～3個月后，被接種不同待測菌株TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001的各5株相思樹苗樹冠葉片失綠、發(fā)黃或枯死，接種部位組織白腐，有的長有黃白色腐竹狀菌膜、黑紅色革質(zhì)菌膜，對照創(chuàng)傷部位已長出愈傷組織，頂端葉片無異常變化（圖4）。從發(fā)病植株的接種部位采取樣本，再分離得到相同的菌株，結(jié)果表明分離菌TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001均為3種相思樹的致病菌。

TWXSGF001、MZXSGF001、EYXSGF001 3株菌株分別在木屑培養(yǎng)基生長120 d后長出與田間發(fā)病植株上生長相似的擔子果（圖5）。

圖5 相思紅根病原菌誘導產(chǎn)生的擔子果

2.3 形態(tài)鑒定

2.3.1 臺灣相思紅根病原菌的形態(tài)特征在PDA培養(yǎng)基上生長的TWXSGF001病原菌菌絲絨毛狀，平伏生長，乳白色圓形，邊緣整齊，無氣味（圖6-A）。擔子果一年生，生長初期的擔子果為球狀，以純白色為主。有短柄，有漆樣光澤。菌柄細長，側(cè)生，紅褐色至紫黑色。生長后期的擔子果有柄或無柄，木栓質(zhì)到木質(zhì)。菌蓋近半圓形、近腎形或近扇形，單生或疊生，大小為（2.5～8.5）cm×（4.5～15） cm，厚0.5～2 cm，表面紅褐色、紫褐色或紫紅色，有漆樣光澤，靠邊緣為黃褐色至白色，中心厚邊緣??；厚0.5～1.9 cm，菌肉為褐色，無黑色殼質(zhì)層；菌管長0.1～0.2 cm，褐色；孔面污白色或淡褐色。不同地區(qū)的臺灣相思樹病株上長出的擔子果形態(tài)略有差異（圖6-B～圖6-D）。擔孢子卵圓形，雙層壁，頂端平截，外壁光滑透明；內(nèi)壁淡褐色有小刺，部分中央有1個油滴。大小為（6.2～8.9）μm×（3.6～6.4）μm，平均長7.540μm，平均寬5.01μm，長寬比Q為1.394～1.729（圖6E）。

圖6 臺灣相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3.2 馬占相思紅根病原菌的形態(tài)特征MZXSGF001菌株在PDA培養(yǎng)基上生長的病原菌菌絲絨毛狀，菌落為白色圓形，邊緣圓鈍，平伏生長，（圖7-A）。擔子果一年生，單生，有柄或無柄，木栓質(zhì)或木質(zhì)。菌蓋半圓形，腎形或扇形，長4～12 cm，寬3.5～8.0 cm，邊緣厚0.2～0.7 cm，柄長4～8 cm。菌蓋中心為紅褐色，邊緣為黃褐色或白色，表面有漆樣光澤，有同心環(huán)紋。菌肉深褐色，無殼質(zhì)層。背面白色或淡褐色，無光澤，邊緣圓鈍。菌柄長，側(cè)生，紅褐色至紫褐色（圖7-B～圖7-D）。擔孢子南瓜子形或頂端平截，有內(nèi)外兩層壁，外壁透明，內(nèi)壁褐色，（5.3～7.2）μm×（6.8～11.2）μm，平均長9.13μm，平均寬6.16μm，長寬比Q為1.133～1.833（圖7-E）。

圖7 馬占相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3.3 耳葉相思紅根病原菌的形態(tài)特征菌落特征：在PDA上，菌絲平伏生長，絨毛狀，邊緣平滑，菌落為白色圓形，無氣味（圖8-A）。擔子果一年生。菌肉褐色，無黑色殼質(zhì)層，單層或多層。有細柄或無柄，木栓質(zhì)或木質(zhì)，菌蓋單生，長4.0～7.4 cm，寬4.0～6.8 cm，邊緣厚0.6～0.8 cm，柄長5.8～7.2 cm，半圓形，扇形或腎形，有同心環(huán)紋。正面靠邊緣一圈為白色，朝內(nèi)均為深紅褐色。有光澤；背面通常白色至淡褐色，沒有光澤，邊緣圓鈍。菌柄細長，側(cè)生，深紅褐色（圖8-B～圖8-E）。擔孢子南瓜子形，中間有一個較大的油滴，雙層壁，淡褐色，大小為（4.5～6.4）μm×（6.6～10.0）μm，平均長8.09 cm，平均寬5.71 cm。長寬比Q為1.25～1.56（圖8-F）。根據(jù)其形態(tài)特征參考《中國靈芝圖鑒》《中國大型真菌》《中國真菌志》等文獻，將上述3種病原菌初步鑒定為熱帶靈芝[Ganoderma tropicum(Jungh.) Bres.][19]。

圖8 耳葉相思紅根病病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.4 分子生物學鑒定測序結(jié)果顯示，rDNA-ITS序列為610～619 bp，SSU序列為1048～1084 bp，LSU序列為960～1104 bp（表2）。在NCBI上進行Blastn比對，結(jié)果顯示，所得序列與熱帶靈芝[G. tropicum(Jungh.) Bres.]序列的相似度均高于98%。選取親緣關系較近的10個菌株，經(jīng)序列比對后在MEGA7.0中利用NJ法構(gòu)建進化樹。結(jié)果可見，分離獲得的菌株均與熱帶靈芝聚為一類（圖9）。結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定與分子生物學鑒定結(jié)果，將侵染臺灣相思、馬占相思與耳葉相思的菌株TWXSGF001、MZXSGF001與EYXSGF001鑒定為熱帶靈芝[G. tropicum(Jungh.)Bres.]。

表2 菌株的序列登錄號

3 討 論

本研究采集了海南3種相思樹紅根病的病原菌擔子果，分離得到病原菌完成致病性測定，結(jié)合形態(tài)學與分子生物學方法將引起海南臺灣相思、馬占相思、耳葉相思紅根病的病原菌鑒定為熱帶靈芝（G. tropicum）。弓明欽[6]將海南臺灣相思根腐病病原菌經(jīng)形態(tài)學鑒定為熱帶靈芝（G.tropicum），本研究結(jié)果與其研究結(jié)果相同。岑炳沾等[9]根據(jù)子實體形態(tài)將廣東多地馬占相思與耳葉相思根腐病病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum），Mehrotra等[8]將印度馬占相思樹根腐病的病原菌鑒定為靈芝（G. lucidum）。吳如慧等[22]通過形態(tài)學特征鑒定和SSU序列分析將海南定安、臨高等地的臺灣相思根腐病原菌鑒定為假芝(Amauroderma rugosum)。戴玉成等[11]報道引起海南五指山與瓊中的臺灣相思死亡的根腐病原菌為熱帶靈芝(Ganoderma tropicum)和粗柄假芝 (Amauroderma. elmerianum)。多種靈芝菌均可引起相思樹根腐病，包括靈芝屬(Ganoderma)與假芝屬(Amauroderma)下的多個物種，不同地區(qū)和不同地理環(huán)境下相思樹根腐的病原菌可能不同。在田間調(diào)查的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)，海南海口、定安、瓊中、萬寧、樂東、保亭、三亞、東方、昌江、白沙、儋州、澄邁、臨高等市縣均發(fā)現(xiàn)由熱帶靈芝引起的相思樹根腐病，此病多在公路旁的行道樹上發(fā)現(xiàn)，在海南各地分布廣泛。

熱帶靈芝引起相思樹紅根病，其地上枝條枯死程度與地下根系腐爛程度存在相關性。病原菌從相思樹莖基部或根部侵入后在根部感染部位形成黃白色、腐竹狀的菌膜，然后繼續(xù)發(fā)育，在樹莖基部產(chǎn)生大型子實體；病株死后，病原菌依然能夠在其病殘體特別是根莖部存活數(shù)年，在雨季和雨季過后，其近地面和暴露于地表的根上依然能長出黃白色擔子果。在病害蔓延的過程中，可通過病根與健康植株的根系接觸產(chǎn)生短距離的傳播，長距離的傳播通過人力和風雨對病原菌子實體產(chǎn)生的擔孢子擴展蔓延，并在林間形成明顯的發(fā)病中心。在本研究的調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)相思樹紅根病多在道路邊與公園內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而山林內(nèi)發(fā)現(xiàn)較少，說明人為活動加劇了病害的傳播。同時，在土壤濕度較大、較為粘重且透氣性較差的地方該病發(fā)生較重。在高溫、高濕季節(jié)，相思樹紅根病也更容易發(fā)生。

由于紅根病在染病前期不易被發(fā)現(xiàn)與診斷，一旦出現(xiàn)明顯癥狀或長出擔子果時其內(nèi)部組織已經(jīng)大部分白腐，施藥較難治愈。在對熱帶靈芝所致紅根病的防治上，應堅持“預防為主，綜合防治”的植保方針，徹底清除病樹病根，及時銷毀其病殘體是預防此病發(fā)生的關鍵措施。在公園與市政綠化的過程中，應避免在除草時傷及樹木莖基部造成傷口而導致紅根病的發(fā)生。此外，在設計和培育防護林時，要注意將豆科與非豆科植物混合種植，也可以起到預防減緩紅根病發(fā)生和傳播的效果。一旦發(fā)生病情，應當盡可能在早期進行診斷。對已被輕度侵染的發(fā)病樹木建議用十三嗎啉或根康等藥劑進行灌根處理，對于發(fā)病嚴重的老齡樹木應及早清除，將病殘體和子實體集中燒毀，防止病害擴散。