徐鑫澤，施澤坤，紀(jì)曉貝，李志剛，李 瀟，劉文波，林春花，繆衛(wèi)國

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228）

炭疽菌（Colletotrichumspp.）是一類分布范圍廣泛的植物病原真菌[1]。橡膠樹炭疽病在橡膠種植園區(qū)普遍發(fā)生，是橡膠樹的葉部“兩病”之一，可造成葉片脫落、嫩梢回枯、果實(shí)腐爛等一系列癥狀，導(dǎo)致割膠時(shí)間推遲，產(chǎn)膠量下降[2]。在多數(shù)植膠園中，橡膠樹主要受膠孢炭疽菌復(fù)合群（Collectotrichum gloeosporioidesspecies complex）侵染，部分報(bào)道受尖孢炭疽菌復(fù)合群（Collectotrichum acutatumspecies complex）侵染[3]。在我國，橡膠樹炭疽菌主要由膠孢炭疽菌復(fù)合群下的暹羅炭疽菌（Collectotrichum. siamense）和果生炭疽菌（Collectotrichum fructicola）所引起[4]。

鑒于炭疽菌危害的嚴(yán)重性，其分類問題一直是植物病理學(xué)與菌物學(xué)研究的熱點(diǎn)。炭疽菌繁多的種類，豐富的遺傳多態(tài)性，復(fù)雜的復(fù)合種群為在種水平上的鑒定帶來了諸多困難。目前，針對炭疽菌的有效分類手段還是以形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)為基礎(chǔ)[5]。在形態(tài)學(xué)分類中，菌落特征、分生孢子、分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞形態(tài)、附著孢形態(tài)以及其他結(jié)構(gòu)為主要鑒定依據(jù)，并結(jié)合培養(yǎng)特征和寄主范圍作為輔助手段[6]，但炭疽菌的特征往往隨不同的環(huán)境條件的變化而改變，即使在純培養(yǎng)的條件下，分生孢子與分生孢子梗、附著孢和菌絲的形態(tài)與大小也未必是完全相同的。不穩(wěn)定的因素、種水平上相似的結(jié)構(gòu)特征與繁瑣的實(shí)驗(yàn)流程影響了炭疽菌的快速識別與鑒定?；蛐蛄蟹治鰸M足了快速、準(zhǔn)確、靈敏的分類要求，例如核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer,ITS）序列是炭疽菌分子手段鑒定中使用最廣泛的片段[7-10]，但基于ITS的序列分析依然存在不準(zhǔn)確性，對于復(fù)合群間或復(fù)合群內(nèi)的近緣相似種，單基因序列的分析并不能準(zhǔn)確反應(yīng)其親緣關(guān)系，因此無法在種水平上準(zhǔn)確識別。多基因系統(tǒng)分析研究物種分離、群體構(gòu)成以及群體的系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系已經(jīng)成為流行趨勢。結(jié)合形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與利用多基因序列分析可以更精準(zhǔn)地將炭疽菌鑒定至屬以下水平，因此多基因譜系分析被越來越廣泛地在炭疽菌分類研究中使用[11-12]。但多基因序列分析需要依靠龐大的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫來運(yùn)作，需要一定生物信息學(xué)基礎(chǔ)，整個(gè)流程也需要不少的人力與時(shí)間成本。

拉曼散射是一種與入射光頻率不同的非彈性散射，通過拉曼散射可以準(zhǔn)確地獲取樣品的分子結(jié)構(gòu)信息，對于構(gòu)成樣品體內(nèi)的基本生化物質(zhì)的檢測非常靈敏，因此拉曼光譜被稱作“指紋”圖譜[13-15]。拉曼光譜儀與共聚焦顯微技術(shù)的有機(jī)結(jié)合被稱為共聚焦顯微拉曼技術(shù)，其為物種區(qū)分與鑒定帶來了新的途徑。共聚焦顯微拉曼技術(shù)利用代謝物的拉曼散射以快速、免處理、無損、寬譜帶的方式提供樣本所含的拉曼特征信號，例如碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等均可生成特定的拉曼光譜，進(jìn)而可了解生物體內(nèi)的物質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)信息。共聚焦顯微拉曼技術(shù)僅采集物鏡焦點(diǎn)區(qū)域的拉曼信號，通過拉曼光譜和共聚焦顯微鏡的結(jié)合，將焦點(diǎn)以外的背景信號拒之門外，更有利于小體積樣本的掃描分析，例如細(xì)胞或孢子；此外，生物體內(nèi)的水分是在其他光譜測量中重要的干擾因素，而水的拉曼峰是很弱的，幾乎不會對檢測結(jié)果造成干擾，這對含水的微生物樣本的檢測具有一定的優(yōu)勢，因此共聚焦顯微拉曼技術(shù)已經(jīng)被用于真菌與細(xì)菌的分類鑒定中[16-18]。例如，甘琴華等[19]使用共焦拉曼顯微技術(shù)在變種水平上進(jìn)行細(xì)菌的免培養(yǎng)檢測，鑒定的效率與準(zhǔn)確性不亞于16s rDNA。Evelin等[20-21]使用拉曼光譜技術(shù)在屬和種水平上實(shí)現(xiàn)了人類皮膚癬菌以及建筑物損壞相關(guān)真菌的檢測和鑒定。然而，基于共聚焦拉曼顯微技術(shù)的檢測和鑒定在植物病原真菌孢子的研究上，尤其在炭疽菌分類研究中鮮有報(bào)道。在本研究中，筆者利用共聚焦顯微拉曼光譜儀對造成橡膠樹炭疽病的3種炭疽菌孢子的拉曼光譜進(jìn)行了掃描，并以一種非橡膠樹炭疽菌孢子作為對照，分析了其拉曼光譜特征，并結(jié)合主成分分析（PCA）實(shí)現(xiàn)了3種炭疽菌在種水平上的區(qū)分，表明了占據(jù)主要區(qū)分主要權(quán)重所依靠的3個(gè)主要峰值。本研究旨在為病原真菌孢子的鑒別與分類提供高效、可靠、靈敏的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 樣品處理熱帶炭疽菌（Colletotrichum tropicale）菌株HN15、暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）菌株HN08、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）菌株HN02，這3種橡膠樹炭疽菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。將這3種橡膠樹炭疽菌與對照即非橡膠樹炭疽菌（Colletotrichum alatae）接種在PDA培養(yǎng)基上，放置于28 ℃下培養(yǎng)。接種3 d后，刮去表面菌絲破壞菌落結(jié)構(gòu)，在光照條件下進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢。3 d后使用ddH2O洗下孢子并通過Miracloth濾 布(Merck KgaA,孔 徑22～25μm,Germany)過濾去除雜質(zhì)。繼而收集孢子懸浮液，孢子懸浮液在10000 r·min-1下離心3 min并去除上清，ddH2O洗滌2次，稀釋至105CFU·mL-1。取孢子懸浮液20μL(≈2×103個(gè)孢子) 滴在拋光一面的單晶硅基底上(1 cm×1 cm)，吹干備用。

1.2 拉曼光譜測量使用共聚焦顯微拉曼光譜儀(inVia Reflex of Renishaw,England)對炭疽菌孢子進(jìn)行拉曼光譜測量，配備了可產(chǎn)生514 nm激發(fā)光的50 mW激光光源。在測量前使用單晶硅位于520 cm-1的拉曼峰校準(zhǔn)儀器，使用50倍物鏡采集單個(gè)孢子的拉曼光譜，光譜采集范圍為600～2000 cm-1，作用在樣品上的最終激光功率約為5 mW，光斑直徑為1μm，采集時(shí)間為10 s，依靠2 400 cm-1光柵可實(shí)現(xiàn)光譜分辨率為1 cm-1。

每種炭疽菌的測量包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)取視野中隨機(jī)的10個(gè)孢子來測量拉曼光譜，為了避免激光照射損傷，每個(gè)孢子只采集1次光譜。最后使用每種真菌收集到的30張光譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此外，隨機(jī)選取30個(gè)空白處作為基底的背景光譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理由于背景噪聲、孢子本身的差異、實(shí)驗(yàn)設(shè)備的影響，同種炭疽菌孢子的拉曼光譜可能會略微有所不同。同時(shí)，孢子本身的熒光背景、隨機(jī)和非相關(guān)因素也可能會影響收集到的光譜，例如產(chǎn)生基線升高和雜峰。因此，需對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一的前處理。其中包括減去單晶硅基底光譜，使用Labspec 5(HORIBA Scientific,Orsay,France) 進(jìn)行曲線平滑、基線校正（5階，Polymon）。使用EXCEL (Microsoft,USA)計(jì)算實(shí)驗(yàn)采集范圍內(nèi)每個(gè)波數(shù)對應(yīng)拉曼強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差以評估光譜的精確性和可重復(fù)性，并以陰影部分表示。使用Origin 2021b（教育版，OriginLab，USA）進(jìn)行作圖和PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜特征分析在測量的4種炭疽菌中，熱帶炭疽菌（C.tropicale）和暹羅炭疽菌（C. siamense）同屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群（C. gloeosporioidesspecies complex），而尖孢炭疽菌（C. acutatum）屬于尖孢炭疽復(fù)合群（C. acutatumspecies complex），作為不同寄主對照的非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）也同屬于膠孢炭疽菌復(fù)合群（C. gloeosporioidesspecies complex）。對熱帶炭疽菌（C. tropicale）、暹羅炭疽菌（C.siamense）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）以及非橡膠樹炭疽菌（C.alatae）孢子的光譜掃描的結(jié)果（圖1）顯示，4種炭疽菌的孢子幾乎具有相同的光譜模式和峰位。不同的是，非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）孢子產(chǎn)生了極強(qiáng)的拉曼信號，為了避免由不同發(fā)育階段或生長狀態(tài)所帶來的測量誤差，對其不同階段均進(jìn)行了測量，結(jié)果與之前一致，說明其具有極強(qiáng)的拉曼信號，這或許是由不同寄主或種間差異所導(dǎo)致。相同的光譜模式表明它們產(chǎn)生拉曼峰的內(nèi)源性物質(zhì)組成是幾乎一致的，區(qū)別在于含量高低與組成比例的不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的拉曼信號強(qiáng)度與峰值比例不同。其最重要的特征在于，4種炭疽菌孢子的拉曼光譜均在3個(gè)相同的波數(shù)處共有3個(gè)主要的特征峰，分別位于1005、1155、1515 cm-1。同時(shí)，筆者推測相同的拉曼光譜模式與特征峰位置可能是眾多炭疽菌所共有的，而不僅限于實(shí)驗(yàn)中所測量的復(fù)合群與種類。根據(jù)以往的報(bào)道，1005 cm-1處的峰值被認(rèn)為由細(xì)胞質(zhì)蛋白中的苯丙氨酸的分子環(huán)呼吸振動(dòng)的貢獻(xiàn)[22-24]；1155 cm-1處的峰值代表著細(xì)胞壁中C-C和C-N拉伸[18-25]；1515 cm-1處峰值則由N-H鍵、C-H鍵和C=C雙鍵伸縮所導(dǎo)致[26]。

除此以外，根據(jù)它們的平均拉曼光譜還觀察到了位于960、1194、1290、1446 cm-1的幾處共有的小峰。960 cm-1處峰值由C-N鍵伸縮與C=C鍵變形所產(chǎn)生；1194 cm-1處的峰值由芳香族氨基酸產(chǎn)生；1290 cm-1處的峰值由酰胺III和胸腺嘧啶產(chǎn)生；1446 cm-1處峰值由脂肪鏈的C-H鍵彎曲產(chǎn)生[22-24,27]。雖然4種炭疽菌孢子顯示出了相同的光譜趨勢和幾乎相同的峰值位置，但3個(gè)主要波數(shù)1005、1155和1515 cm-1處的峰值強(qiáng)度明顯不同。同時(shí)，即使受孢子本身狀態(tài)與儀器光電噪聲的影響，它們的平均拉曼光譜依然顯示出了較小的標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍（以陰影部分表示）。此外，不僅僅是3個(gè)主要峰值的強(qiáng)度不同，其峰值之間的比例也不同。例如，尖孢炭疽菌（C.acutatum）、熱帶炭疽菌（C. tropicale）和暹羅炭疽菌（C. siamense）孢子的拉曼光譜在1155和1515 cm-1這2個(gè)波數(shù)處的峰值強(qiáng)度比也是不同的，分別為0.69、0.86和0.95，這也導(dǎo)致了同一張平均光譜中不同峰位對應(yīng)的峰面積占總體峰面積的比例不同，比如尖孢炭疽菌（C. acutatum）在1155 cm-1處對應(yīng)峰面積所占總體峰面積的比例明顯小于其他3種。3個(gè)主要峰值的信號強(qiáng)度差異、峰值比例與光譜趨勢成為了區(qū)分它們的良好依據(jù)。

2.2 PCA聚類分析使用PCA對3種橡膠樹炭疽菌孢子預(yù)處理后的拉曼光譜進(jìn)行聚類分析，而鑒于非橡膠樹炭疽菌（C. alatae）的拉曼光譜具有肉眼可辨的極強(qiáng)的峰值特征，因此未將其包含在PCA聚類分析中。依靠每張孢子拉曼光譜的PC1、PC2和PC3得分，將散點(diǎn)圖投影到三維空間中，位置和大小反映了孢子的分類關(guān)系。該投影分析（圖2）顯示了在種水平上較高的靈敏度，3種橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜可以準(zhǔn)確地劃分為3個(gè)簇。它們的95%置信區(qū)間有一定程度的重疊，這是由于一些不穩(wěn)定的樣本因素所導(dǎo)致的，整體來看并不影響聚類效果。圖3所示，前3個(gè)主成分共同占據(jù)了99.70%的解釋度，其中，依靠1005 cm-1，1155 cm-1和 1 515 cm-13個(gè)主要峰值的差異，PC1占據(jù)了97.76%的分辨能力。位于963，1195，1291，1446 cm-1處的幾個(gè)小的峰值也在PC1中占據(jù)了一定的權(quán)重，但不如3個(gè)主要峰值明顯。同時(shí)，PC2與PC3這兩個(gè)主成分也能在一定程度上有效解釋區(qū)分度，例如，998、1152和1507 cm-1在PC2與PC3的負(fù)軸上也占據(jù)了一定的權(quán)重。但是，在PCA特征提取的過程中，更傾向于自動(dòng)選擇降維后較大的特征值與特征向量?？傮w而言，3種橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜很容易聚類為3個(gè)簇，表明使用拉曼光譜技術(shù)在種水平上區(qū)分炭疽菌孢子種類是可行的。

圖2 3種橡膠樹炭疽菌孢子的PCA得分圖橢圓陰影區(qū)域表示每種孢子的95%置信區(qū)間。

圖3 3種橡膠樹炭疽菌孢子的PC1、PC2、PC3主成分荷載圖

3 討 論

本研究依靠共聚焦顯微拉曼技術(shù)對3種橡膠樹炭疽菌孢子以及1種非橡膠樹炭疽菌孢子的拉曼光譜進(jìn)行了特征分析，找出了共有的1005、1155和1515 cm-1波數(shù)處3個(gè)主要拉曼峰，以及位于960、1194、1290、1446 cm-1處的次級拉曼峰，繼而對峰值貢獻(xiàn)的歸屬進(jìn)行了初步判斷。結(jié)合PCA聚類分析在三維空間得分圖中快速有效地將3種橡膠樹炭疽菌孢子聚類為3個(gè)簇，在荷載圖中展示了區(qū)分它們在PC1、PC2以及PC3中主要依靠的拉曼峰。結(jié)果表明，1005、1155和1515 cm-1波數(shù)處3個(gè)拉曼峰不僅是炭疽菌所共有的，更是利用拉曼光譜結(jié)合PCA在種水平上區(qū)分它們的主要依據(jù)。

本研究提供了一種鑒別炭疽菌孢子的全新的方法，與基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定方法相比，共聚焦顯微拉曼技術(shù)具有靈敏與微量樣品需求的優(yōu)勢，且樣品是無需預(yù)富集和預(yù)處理的，有望達(dá)到單孢子水平的檢測與鑒定。本研究為病害防控，快速鑒別，真菌分類提供有力的技術(shù)支撐。當(dāng)然，為了提高診斷的可靠性和可選擇性，更多的種類炭疽菌孢子樣本應(yīng)在的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步引入，以便建立完整的孢子光譜數(shù)據(jù)庫。