謝愛卿， 楊海川， 徐興然， 鄒祥

1.西南大學 藥學院， 重慶 400715； 2.重慶藥友制藥有限責任公司， 重慶 401121

巖藻多糖(fucoidan)， 也被稱為褐藻糖膠， 是一種由巖藻糖硫酸酯構成的水溶性多糖， 具有廣泛的生物活性， 如抗氧化、 抗病毒及抑制幽門螺旋桿菌等[1]． 巖藻多糖在褐藻中的含量低(大約0.1%)， 存在提取工藝復雜、 提取率低等限制， 從而影響對巖藻多糖生理活性的研究和應用開發(fā)[2]． 微生物來源的巖藻多糖主要是指含巖藻糖胞外多糖(fucose-containing exopolysaccharide， FucoPol)， 產FucoPol菌株主要來源于腸桿菌屬和芽孢桿菌屬[3]． FucoPol的分子結構中不含硫酸基， 導致其生物活性不足[4]， 但其優(yōu)勢是可以通過基因工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化等手段來提升產量， 實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產.

多糖硫酸化修飾是一種通過化學法在多糖的分子鏈上接枝硫酸基團的方法． 硫酸化修飾可以增強原多糖的某些活性或產生新的生物活性， 如免疫活性、 抗病毒活性及抗菌活性等， 其中抗氧化活性的增強備受研究者關注． Xu等[5]對黑加侖多糖進行硫酸化修飾， 體外實驗表明硫酸化黑加侖多糖比黑加侖多糖具有更強的抗氧化活性和a-淀粉酶抑制活性； Liu等[6]對梭柄松苞菇子實體多糖(mCVP-1S)進行硫酸化改性， 發(fā)現(xiàn)硫酸化實體多糖具有更好的體外抗氧化活性及抗凝血活性， 并發(fā)現(xiàn)取代度和三螺旋結構是影響其生物活性的重要因素； Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)硫酸化植物乳桿菌胞外多糖顯示出比原始胞外多糖更強的自由基清除活性， 硫酸化胞外多糖可以保護Caco-2細胞免受蠟狀芽孢桿菌腸毒素引起的損傷.

本研究以本課題組篩選的Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產生的FucoPol為原料[8]， 通過化學法進行硫酸化修飾， 在分子結構中引入硫酸基團， 并對硫酸化FucoPol(FucoPol-S)進行紅外和核磁表征， 測定硫酸基含量， 以及體外抗氧化活性及細胞相容性， 為實現(xiàn)FucoPol的應用開發(fā)奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試劑

FucoPol由Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產生； Fucoidan， 上海麥克林生化科技有限公司； 氯磺酸、 吡啶、 硫酸亞鐵、 過氧化氫溶液、 氯化硝基四氮唑藍、 β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和吩嗪硫酸甲酯均為分析純， 上海易恩化學技術有限公司； 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)基、 100×青霉素-鏈霉素溶液， 重慶睿宸生物科技有限公司.

1.2 儀器與設備

TGL-16M型臺式高速冷凍離心機， 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司； 600 MHz核磁共振波譜儀， 瑞士布魯克儀器有限公司； Synergy H1型酶標儀， 美國安捷倫科技有限公司.

1.3 細胞和菌株

小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞株，Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株由本實驗室保存.

1.4 實驗方法

1.4.1 胞外多糖制備及分離提取

參考Li等[9]方法進行FucoPol的發(fā)酵和分離提?。甂osakoniasp. CCTCC M2018092菌株首先在250 mL錐形瓶中培養(yǎng)活化20 h， 菌液轉移到15 L種子罐中預培養(yǎng)13 h， 預生長的種子液轉移到50 L發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵96 h.

發(fā)酵結束后， 發(fā)酵液進行部分酸水解降低粘度以便于進行后續(xù)的分離提純． 發(fā)酵液使用濃硫酸調節(jié)pH值至2.0， 在80 ℃下水解4 h． 使用陶瓷膜過濾除去發(fā)酵液中的菌體和不溶性雜質． 使用截留分子量為10 000 g/mol的高分子膜進行超濾以進一步去除小分子雜質． 接著， 通過Sevag法脫蛋白， 最后通過透析(截留分子量8 000 g/mol)和凍干得到FucoPol.

1.4.2 硫酸化多糖制備

采用氯磺酸-吡啶法進行FucoPol的硫酸化[10]． 在磁力攪拌和冰水浴冷卻的條件下， 將6 mL氯磺酸通過恒壓滴液漏斗緩慢加入12 mL無水吡啶中， 在40 min內滴加完成， 得到淡黃色固體狀硫酸化試劑.

將500 mg FucoPol粉末加入20 mL甲酰胺， 于室溫下磁力攪拌分散30 min． 加入硫酸化試劑， 于50 ℃反應2 h． 冷卻至室溫， 使用4 mol/L NaOH溶液調整反應液的pH值至7.0左右， 使用3倍體積乙醇沉淀硫酸化多糖． 5000 r/min離心5 min后棄去上清液， 使用去離子水溶解沉淀， 流水透析(截留分子量3 500 g/mol)12 h， 去離子水中透析24 h． 透析液凍干后得硫酸化多糖(FucoPol-S).

1.4.3 硫酸化修飾驗證

通過傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和核磁氫譜(1HNMR)進行結構表征． 制備的硫酸化多糖樣品使用常規(guī)方法壓片， 采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析(掃描范圍400～4 000 cm-1)； 取5 mg干燥的多糖樣品溶解于0.5 mL氘代水中， 內標為TMS， 進行1HNMR分析.

式中： S為硫酸化多糖中的硫酸基質量分數(shù)；m2為硫酸根質量， 單位為mg；m1為硫酸化多糖質量， 單位為mg.

1.4.4 羥基自由基清除活性測定

參考Chen等[12]的方法測定巖藻多糖、 FucoPol-S和FucoPol羥基自由基(·OH)清除活性． 使用去離子水配制不同濃度的樣品溶液． 在96孔板中， 將160 μL樣品溶液與40 μL 9 mmol/L FeSO4溶液和40 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液充分混合， 再加入20 μL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液． 混合均勻后， 于37 ℃靜置30 min， 并于酶標儀上測定510 nm處吸光度． 維生素C(Vc)作為陽性對照， 以去離子水替代多糖溶液作為空白， 每組設置3個重復孔． 計算·OH清除率：

式中：Y1為·OH清除率；A0為空白孔吸光度；A1為樣品孔吸光度.

1.4.5 超氧陰離子清除活性測定

式中：Y2為超氧陰離子清除率；A0為空白孔吸光度；A1為樣品孔吸光度.

1.4.6 細胞毒性測定

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞在完全培養(yǎng)基(補充有100 U/mL青霉素、 100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)中生長， 并在37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

通過CCK-8試劑盒測定FucoPol-S對RAW264.7細胞的細胞毒性[14-15]． 在96孔板中接種100 μL稀釋至5.0×104個/mL的細胞， 每組設6個重復孔． 培養(yǎng)12 h后， 棄去原培養(yǎng)基， 分別用100 μL以完全培養(yǎng)基溶解的FucoPol-S(12.5 μg/mL至50 μg/mL)處理細胞24 h． 將多糖溶液替換為等體積完全培養(yǎng)基作為空白組． 隨后， 向每個孔中加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標儀測定450 nm處的吸光度． 計算細胞活力：

式中：V為細胞活力；A0為空白組吸光度；A1為多糖實驗組吸光度.

1.4.7 細胞抗氧化活性測定

參考鄒靈秀等[16]的方法進行細胞氧化損傷模型構建． 在96孔板中接種100 μL以完全培養(yǎng)基稀釋至5.0×104個/mL的RAW 264.7細胞， 每組設6個重復孔． 培養(yǎng)12 h， 棄去原培養(yǎng)基， 用100 μL DMEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度H2O2(0～900 μmol/L)處理細胞12 h． 隨后， 向每個孔中加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標儀測定450 nm處的吸光度． 計算細胞活力.

參考Zhang等[17]的方法進行細胞抗氧化實驗． 在96孔板中接種100 μL以完全培養(yǎng)基稀釋至5.0×104cell/mL的RAW 264.7細胞， 每組設6個重復孔． 培養(yǎng)12 h， 棄去原培養(yǎng)基， 實驗組用100 μL完全培養(yǎng)基稀釋的不同質量濃度的FucoPol-S(0.5～50 μg/mL)和巖藻多糖(0.5～50 μg/mL)處理細胞24 h． 隨后， 加入100 μL 1.5 mmol/L DMEM培養(yǎng)基稀釋的H2O2溶液， 培養(yǎng)12 h． 空白組以等體積完全培養(yǎng)基替代多糖溶液， 等體積DMEM培養(yǎng)基替代過氧化氫溶液． 過氧化氫對照組以等體積完全培養(yǎng)基替代多糖溶液． 最后， 向每孔加入10%CCK-8溶液， 于37 ℃孵育2 h， 使用酶標儀測定450 nm處的吸光度． 計算細胞活力.

1.4.8 數(shù)據統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制實驗數(shù)據相關圖片． 實驗結果是3次及以上分析的平均值， 使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據顯著性分析，p<0.05表示數(shù)據差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果與討論

2.1 硫酸化修飾驗證

發(fā)酵液經酸水解、 膜過濾、 透析凍干后得到FucoPol． 500 mg FucoPol硫酸化得到558 mg FucoPol-S， 產率111.6%(圖1)． 通過比濁法在FucoPol中未檢測到硫酸基存在， 而測得FucoPol-S和巖藻多糖硫酸基含量分別為28.2%，20.7%.

圖1 FucoPol硫酸化修飾反應

在FucoPol-S的FT-IR光譜中出現(xiàn)了硫酸基團的特征吸收帶， 1 258 cm-1附近的條帶歸屬于不對稱S=O雙鍵的伸縮振動， 證明硫酸基團成功引入[17]． 800～850 cm-1左右的吸收帶由C-O-S對稱振動引起， 該范圍的紅外吸收可用來推斷硫酸基團在硫酸化多糖中的取代位置， 在含半乳糖單元的多糖中845 cm-1，830 cm-1和820 cm-1位置的條帶分別分配給的C-4硫酸化、 C-2硫酸化和C-6硫酸化[18]． FucoPol-S的紅外光譜中在808 cm-1和832 cm-1出現(xiàn)了吸收峰， 可以推斷FucoPol的硫酸化主要發(fā)生在C-6和C-2位置(圖2).

圖2 FucoPol和FucoPol-S FT-IR光譜圖

在FucoPol-S的1HNMR圖中， 歸屬于巖藻糖甲基的質子峰化學位移值向低場移動(由1.29移至1.44)， 提示在巖藻糖單元上發(fā)生了硫酸化修飾[19]． 而化學位移3.2～4.6之間歸屬于巖藻糖、 葡萄糖、 半乳糖和葡萄糖醛酸的質子峰都整體向低場方向發(fā)生了移動， 說明硫酸化修飾隨機發(fā)生在各個單糖單元的羥基上.

2.2 自由基清除活性

羥基自由基(·OH)是人體內存在的活性氧之一， 其能輕易地穿過細胞膜并與碳水化合物、 蛋白質和DNA等生物大分子發(fā)生反應， 是導致細胞氧化損傷的主要原因． 因此， 減少·OH對于人體健康具有重要意義． 采用Fenton試劑產生·OH， 測定巖藻多糖、 FucoPol-S和FucoPol對·OH的清除活性(圖3)． 3種多糖的·OH清除率具有濃度依耐性， 半數(shù)抑制質量濃度分別為IC50(巖藻多糖)=0.67 mg/mL；IC50(FucoPol-S)=1.82 mg/mL；IC50(FucoPol)>8.00 mg/mL． 當質量濃度增達到8.0 mg/mL時， FucoPol-S的·OH清除率為81.61%， 巖藻多糖的·OH清除率為80.34%， 兩者差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)， FucoPol的·OH清除率為43.37%， 顯著小于FucoPol-S(p<0.05)． 對比FucoPol-S和FucoPol， 結果顯示硫酸化修飾顯著增強了巖藻多糖的·OH清除活性， 說明硫酸根在清除·OH中起重要作用． 對比FucoPol-S和巖藻多糖， 結果顯示FucoPol-S的半數(shù)抑制質量濃度高于巖藻多糖， 但高質量濃度時兩者·OH清除活性相當． Wang等[20]研究表明硫酸化多糖可能通過螯合Fe2+來減少·OH的產生， 我們推測高取代度的硫酸化多糖中可用于螯合Fe2+的羥基減少， 可能是高取代FucoPol-S ·OH清除活性略低于Fucoidan的原因.

圖3 ·OH清除活性比較

圖清除活動性比較

2.3 細胞抗氧化實驗結果

使用不同質量濃度的FucoPol-S處理RAW 264.7細胞24h后， 結果顯示50 μg/mL及以下均未顯示出細胞毒性， 說明FucoPol-S具有較好的生物安全性(圖5).

圖5 FucoPol-S對RAW 264.7細胞的毒性實驗

用濃度遞增的過氧化氫溶液處理RAW 264.7細胞12 h后， 其細胞活力逐漸降低， 當過氧化氫濃度達到0.9 mmol/L時， 細胞活力降至25.59%． 其中， 當濃度為0.7 mmol/L時， 細胞活力為54.86%． 基于該結果， 后續(xù)實驗將使用0.7 mmol/L過氧化氫處理12 h作為細胞氧化損傷條件.

細胞抗氧化實驗中， 比較了不同質量濃度的FucoPol-S和巖藻多糖對過氧化氫誘導的RAW 264.7細胞活力喪失的保護作用(圖6)． 結果顯示， 當使用5 μg/mL FucoPol-S或50 μg/mL巖藻多糖時， 均能顯著的提升細胞活力， 其中FucoPol-S以更低質量濃度達到和巖藻多糖相當?shù)谋Ｗo作用． 據報道， 細胞抗氧化能力與硫酸化多糖自由基清除活性高度相關[22]， FucoPol-S在低質量濃度表現(xiàn)出細胞抗氧化活性可能與其較低的超氧陰離子半數(shù)抑制質量濃度有關． 同時注意到， 當FucoPol-S質量濃度進一步增加時， 細胞活力再度降低， 這可能與高質量濃度抗氧化物質導致細胞中的負反饋調節(jié)有關.

圖6 FucoPol-S和Fucoidan對H2O2處理的RAW 264.7細胞活力影響

3 結論

以Kosakoniasp. CCTCC M2018092菌株發(fā)酵產生的FucoPol為原料， 采用氯磺酸-吡啶法進行硫酸化改性， 制備了一種硫酸基含量為28.2%的硫酸化巖藻多糖， 硫酸基團在各單糖單元的醇羥基上均有分布． 使用非選擇性硫酸化方法， 大多數(shù)硫酸根基團與多糖中空間位阻較小的C-6伯羥基相連， 硫酸基接枝位置對生物活性也具有一定的影響[23]． 硫酸化修飾往往能增強多糖的的抗氧化活性[24]， 可能的機制是在多糖分子中引入硫酸基團引起O-H鍵的解離能減弱， 增加硫酸化多糖的供氫能力[25].

FucoPol-S對細胞氧化損傷具有保護作用． 在進一步的細胞抗氧化實驗中， FucoPol-S顯示出良好的細胞相容性， 并能顯著減少過氧化氫誘導的RAW 264.7細胞活力降低， 且FucoPol-S能以低質量濃度(5 μg/mL)達到與高質量濃度巖藻多糖(50 μg/mL)相當?shù)募毎寡趸Ч?說明在低濃度下即可對細胞氧化損傷產生保護作用.

綜上所述， 以發(fā)酵法經硫酸化修飾的的FucoPol-S對比褐藻來源的Fucoidan在超氧陰離子自由基清除及低濃度細胞抗氧化方面具有明顯優(yōu)勢， 且原料具有廉價易得的優(yōu)勢， 在未來抗氧化功能食品及保健制品開發(fā)中具有廣泛應用前景.