裴峰 王廣達(dá) 高鵬 馮志明 胡珂鳴 陳宗祥 陳紅旗 崔傲 左示敏 ,

（1揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311400；4鎮(zhèn)江禾下土農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212008；5揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；*通信聯(lián)系人，email:smzuo@yzu.edu.cn）

水稻是我國(guó)三大主糧之一，全國(guó)有60%以上人口以稻米為食。民以食為天，保證稻米供給安全對(duì)于保證國(guó)家糧食安全至關(guān)重要[1]。2011年以來(lái)，我國(guó)人均稻谷占有量達(dá)152 kg[2]，溫飽問(wèn)題已基本解決，在此基礎(chǔ)上，人們對(duì)健康、安全和高品質(zhì)稻米的需求日益提高。降低稻米中有害物質(zhì)的積累，并提高其營(yíng)養(yǎng)成分，成為水稻育種的一個(gè)重要新方向。

稻米的安全品質(zhì)與農(nóng)田土壤息息相關(guān)，由于不當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝技術(shù)，許多有機(jī)和無(wú)機(jī)污染物進(jìn)入了農(nóng)田土壤，其中最為嚴(yán)重的當(dāng)屬重金屬污染[3]。農(nóng)業(yè)部對(duì)全國(guó)30萬(wàn)畝基本農(nóng)田保護(hù)區(qū)進(jìn)行抽樣調(diào)查，結(jié)果顯示其中重金屬超標(biāo)率12.1%，產(chǎn)出糧食中重金屬含量超標(biāo)率超過(guò)了10%[4]。重金屬污染元素包括鎘、砷、汞、鎳、鉛等，其中鎘污染的發(fā)生率最高，為25%，遠(yuǎn)超其他土壤重金屬污染率[5]。鎘是一種有色重金屬，與鉛鋅礦伴生，會(huì)隨著金屬礦石的冶煉而進(jìn)入到環(huán)境中，特別是20世紀(jì)的粗放式發(fā)展，導(dǎo)致許多農(nóng)田中出現(xiàn)了鎘超標(biāo)情況[6]。近年來(lái)，南方多地先后出現(xiàn)的“鎘大米”事件也充分顯示了農(nóng)田鎘污染問(wèn)題的嚴(yán)重性。鎘在人體內(nèi)的代謝半衰期可達(dá)到10～35年，會(huì)對(duì)骨骼、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生破壞，更甚者會(huì)導(dǎo)致畸形和癌癥[7-10]，因此，長(zhǎng)期食用鎘超標(biāo)大米會(huì)對(duì)身體造成不可逆的嚴(yán)重影響。我國(guó)對(duì)稻米中的鎘含量有明確標(biāo)準(zhǔn)，即大米鎘含量要求低于0.2 mg/kg，但國(guó)際食品法典委員會(huì)對(duì)大米中鎘的限量為0.4 mg/kg[11-12]。由于農(nóng)田面源污染治理是一個(gè)長(zhǎng)期而又艱巨的任務(wù)，因此，開(kāi)發(fā)鎘低積累型水稻品種具有十分重要的意義。

自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（natural resistanceassociated macrophage protein, Nramp）是生物體中進(jìn)化保守的一個(gè)大家族，作為質(zhì)子偶聯(lián)的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以轉(zhuǎn)運(yùn)錳、鋅、銅、鐵、鎘、鎳、鈷、和鋁離子[13-15]。OsNramp5基因于2012年被初次報(bào)道，其在水稻根部負(fù)責(zé)錳、鐵、鎘的吸收以及這些元素的轉(zhuǎn)運(yùn)，亞細(xì)胞定位顯示OsNramp5蛋白定位于根尖成熟區(qū)的內(nèi)皮層和外皮層的質(zhì)膜上[16]。敲除該基因可致水稻喪失對(duì)鎘吸收的大部分能力，同時(shí)對(duì)錳和鐵的吸收也受到一定影響[16-18]。OsNramp5-KO敲除植株的根、地上部和稻米中鎘含量都明顯低于對(duì)照，尤其是稻米中的鎘含量下降極為明顯[16,19]。為此，有研究認(rèn)為可用OsNramp5-RNAi植株中籽粒中鎘的極低積累而地上部仍有一定量的鎘富集特性，作為鎘污染農(nóng)田的土壤修復(fù)植物材料[17,20]。在對(duì)該基因的相關(guān)操作中，發(fā)現(xiàn)不同品種的轉(zhuǎn)基因材料農(nóng)藝表型間不盡相同，如在中花11中敲除該基因可導(dǎo)致幼苗長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰罱K產(chǎn)量?jī)H有原材料的11%，在越光中敲除該基因則不影響長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量和口感[16,19]。Wang等[21]敲除了黃華占中OsNramp5基因，發(fā)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的影響會(huì)隨著基因缺失程度的增加而增加。Tang等[22]在華占和隆科638S背景中對(duì)該基因進(jìn)行了敲除，得到了不影響生長(zhǎng)量、產(chǎn)量和籽粒品質(zhì)的低鎘水稻，同時(shí)將它們與隆兩優(yōu)華占進(jìn)行雜交，得到了性狀優(yōu)良的雜交低鎘水稻，說(shuō)明該基因在低鎘水稻育種中具有重要價(jià)值。

除了重金屬污染導(dǎo)致的稻米品質(zhì)安全問(wèn)題外，全球還有約1/3人口存在“隱性饑餓”問(wèn)題，即由于飲食結(jié)構(gòu)等因素的影響，造成這部分人群對(duì)鈣、鐵、鋅、硒等人體四大健康元素的攝入嚴(yán)重不足，最終不利于人體健康。比較而言，鈣、鐵、鋅、硒的缺乏在中國(guó)更為普遍[23-24]。比起鈣和鐵在奶制品及常見(jiàn)的蔬菜中廣泛存在，鋅和硒的主要食物來(lái)源顯得不夠普遍。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)建議鋅和硒攝入量標(biāo)準(zhǔn)為每人每天15 mg和50 μg[25]。鋅元素主要存在于海產(chǎn)品和動(dòng)物內(nèi)臟之中，這也決定了我國(guó)多數(shù)人的日常膳食中對(duì)鋅的攝入不足。大米中鋅的含量很低，精米中鋅平均含量?jī)H12 mg/kg，通過(guò)大米攝入的鋅僅為3.6～6.0 mg/d[26]。對(duì)硒元素，Gao等[27]對(duì)我國(guó)蘇州地區(qū)居民的每日膳食硒攝入量進(jìn)行了調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厝司鴶z入量為43.9 μg/d，明顯低于WHO和FAO的人均推薦攝入量[28]；膳食中的日常硒主要攝入來(lái)源是豬肉和谷物，分別占24.7%和22.6%[27]。我國(guó)存在一條東北-西南走向的低硒帶，緯度跨越大，缺硒地區(qū)覆蓋了國(guó)土面積的72%，暗示我國(guó)大多數(shù)人對(duì)硒的攝入不足[29]。由于稻米是我國(guó)絕大多數(shù)人的日常主食，增強(qiáng)稻米中的鋅和硒含量將是提升我國(guó)居民對(duì)這兩種元素?cái)z入量的可行途徑之一。施用鋅肥和硒肥或者選擇天然富硒土壤是目前富鋅、富硒稻米生產(chǎn)的主要策略[30-31]。其中，有研究還發(fā)現(xiàn)施用這兩種元素的肥料有利于減少水稻對(duì)鎘的吸收，降低籽粒中鎘的含量[32-36]。

南粳46是江蘇省近年主要推廣的優(yōu)良食味高產(chǎn)水稻品種，在江蘇省內(nèi)外不同級(jí)別的優(yōu)良食味稻米品比中多次獲得金獎(jiǎng)，已成為江蘇優(yōu)良食味水稻的“標(biāo)桿性”品種[37-38]。本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，在南粳46背景下對(duì)OsNramp5基因進(jìn)行敲除，創(chuàng)建了無(wú)外源轉(zhuǎn)基因成分的nramp5-KO敲除系，進(jìn)而對(duì)敲除系的主要農(nóng)藝、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性以及在鎘、鋅、硒等元素不同處理下籽粒中相關(guān)元素積累量進(jìn)行了全面分析。結(jié)果可為健康、安全的高端大米生產(chǎn)提供新材料與種植參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與肥料

供試水稻品種為南粳46及其OsNramp5敲除系nramp5-KO。試驗(yàn)使用的硒肥由蘇州硒谷科技有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)SETEK-BF-003，其成分為氨基酸≥100 g/L、Cu+Fe+Zn+Mn+B≥20 g/L，Se≥1000 mg/L；葉面噴施的錳肥為MnSO4，鋅肥為ZnSO4·7H2O。

1.2 載體構(gòu)建

利用Miao等[39]描述的CRISPR載體(引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬(wàn)建民教授團(tuán)隊(duì))和方法構(gòu)建OsNramp5的基因編輯載體，具體為：使用CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)設(shè)計(jì)sgRNA，在該網(wǎng)站target genome里選擇Oryza sa tiva(RAPDB），Locus Tag中輸入OsNramp5的基因登錄號(hào)(Os07g0257200)，在結(jié)果中選擇評(píng)分較高的靶點(diǎn)。通過(guò)比較，最終選用的18 bp基因特異性序列為TTCTTCCTGTACGAGAGC，在該序列前后加上接頭，構(gòu)成OsNramp5-sgRNA-F引物：AGATGATCC GTGGCATTCTTCCTGTACGAGAGCGTTTTAGA GCTATGC；將其反向互補(bǔ)獲得OsNramp5-sgRNA-R引物：GCATAGCTCTAAAACGCTCTC GTACAGGAAGAAGCCACGGATCATCT。將引物OsNramp5-sgRNA-F和OsNramp5-sgRNA-R直接進(jìn)行PCR退火反應(yīng)（在10 μL體系中各加入1 pmol/L的引物，94℃10 min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10 min），構(gòu)建到sgRNA中間載體pOs-sgRNA上，接著將其亞克隆到含Cas9表達(dá)組件的目標(biāo)載體pC1300-Cas9上，測(cè)序正確后擴(kuò)大繁殖提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中。

1.3 敲除系的獲得與篩選

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻南粳46的愈傷組織，使用潮霉素篩選，獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株，采用CTAB法提取T0代植株葉片DNA。以日本晴OsNramp5基因序列為參考序列，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）在目標(biāo)PAM區(qū)兩側(cè)適當(dāng)位置設(shè)計(jì)引物，以確?？蓴U(kuò)增出敲除位點(diǎn)所在的第9外顯子，最終設(shè)計(jì)出引物OsNramp5-CX-F/OsNramp5-CX-R（GGCATCAGT CAGAGGAATCAAGG/GGCACATACGCTGGAC AGTAC）對(duì)南粳46野生型和T0代轉(zhuǎn)基因植株的葉片DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，將T0代轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果分別與南粳46野生型的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，分析目標(biāo)PAM區(qū)是否存在序列變異。保留發(fā)生突變并引起氨基酸序列改變的T0代突變株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在T1代群體中，采用Cas9蛋白編碼基因特異引物Cas9-F/Cas9-R（GTCGCCTACCA CGAGAAGTA/GTGAGGTCCTGGTGGTGCTC）和潮霉素篩選標(biāo)記基因特異引物HPT-F/HPT-R（ACG GTGTCGTCCATCACAGTTTCC/TTCCGGAAGTG CTTGACATTGGGGA）進(jìn)行外源轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，篩選出無(wú)外源轉(zhuǎn)基因成分的突變植株。為了便于篩選純合突變體植株，我們針對(duì)各T0突變株中目標(biāo)基因的突變信息，分別開(kāi)發(fā)了dCAPS（derived Cleaved Amplification Polymorphism Sequence）和/或InDel標(biāo)記進(jìn)行不同突變信息的特異檢測(cè)[40]。對(duì)野生型和敲除系基因突變區(qū)段進(jìn)行序列分析，結(jié)合Primier Premier 5.0 軟件，在堿基變異處雙側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物；對(duì)于InDel變異，獲得的一對(duì)PCR引物即為相應(yīng)變異的InDel標(biāo)記；對(duì)于dCAP標(biāo)記，還將進(jìn)一步利用網(wǎng)站dCAPS Finder 2.0，在變異位點(diǎn)處的前引物中引入1～2個(gè)錯(cuò)配堿基，使得該錯(cuò)配堿基與變異位點(diǎn)處的特定堿基間組建為一個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，擴(kuò)增產(chǎn)物即可用該限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，而不具有該切點(diǎn)的則切割不開(kāi)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定變異位點(diǎn)的分子標(biāo)記檢測(cè)。

1.4 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為盆栽和田間試驗(yàn)兩部分，均于揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)校內(nèi)試驗(yàn)田進(jìn)行。

1.4.1 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)于2021年5月3日浸種、5月8日播種，6月11日栽秧于盆缽中。盆栽采用長(zhǎng)方形長(zhǎng)條盆，每盆裝入土壤15 kg。盆栽試驗(yàn)中設(shè)計(jì)三種外源鎘濃度，即C0為對(duì)照，C1為每1 kg土添加1.2 mg外源鎘（1.2 mg/kg），C2為每1 kg土添加2.0 mg外源鎘（2.0 mg/kg）。在栽秧前15 d將配置好的CdCl2溶液加入到土壤中，加水浸潤(rùn)土壤并混勻，7 d后再次攪拌。栽秧后將盆栽移入大田中，正常水肥管理。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，完全隨機(jī)排列。其中C0盆栽苗設(shè)置更多重復(fù)，以便用于其他試驗(yàn)處理。噴施錳肥試驗(yàn)采用10 mmol/L MnSO4對(duì)C0盆栽中水稻進(jìn)行葉片噴施，具體方法為：在分蘗末期的晴朗午后，噴至葉面有水珠滴落，3 d后重復(fù)噴施一次。高低溫逆境脅迫試驗(yàn)始于8月31日，將進(jìn)入孕穗期的盆栽苗轉(zhuǎn)入玻璃溫室，其中低溫處理下的最高溫度為25℃，最低溫度為20℃；高溫處理下的最高溫度為38℃，最低溫度為28℃（圖1），濕度維持80%，處理時(shí)間為7 d。在處理期間將抽出的穗上掛上標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，處理結(jié)束后，將盆栽搬回大田原位置，最終收獲時(shí)調(diào)查這些穗的結(jié)實(shí)率。紋枯病菌接種鑒定采用離體莖稈接種法進(jìn)行，紋枯病菌菌株為本實(shí)驗(yàn)室一直保存使用的YN-7[41]。待各材料生長(zhǎng)至孕穗期時(shí)，從基部剪取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康莖稈，在倒2葉葉鞘基部莖節(jié)以下1 cm處剪斷，剪去莖稈上葉片后在溫室中浸水培養(yǎng)24 h，以消除應(yīng)激反應(yīng)。將培養(yǎng)攜帶紋枯病菌絲的木皮插入至倒2葉鞘內(nèi)，距離葉枕1 cm；接種后將接種莖稈基部插入浸潤(rùn)了營(yíng)養(yǎng)液的花泥并將花泥放置于盛有營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中；將周轉(zhuǎn)箱轉(zhuǎn)移至專門的紋枯病菌離體莖稈保濕裝置中，并放置在人工氣候室中；氣候室設(shè)置30℃/14 h光照、24℃/10 h黑暗，相對(duì)濕度75%～95%；1周后測(cè)量病斑擴(kuò)展情況。

圖1 極端溫度條件的溫度變化曲線Fig. 1. Temperature curves for extreme temperature conditions.

1.4.2 田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于5月13日浸種、5月17日播種，6月16日栽秧，單株栽秧，行株距為30 cm×11 cm。每個(gè)小區(qū)8行，每行25株?；?、返青肥和穗肥分別為300 kg/hm2復(fù)合肥（N∶P∶K為26∶10∶12）、112.5 kg/hm2尿素和225 kg/hm2復(fù)合肥（N∶P∶K為26∶10∶12），分蘗肥施用尿素，分設(shè)3種施用量，即187.5 kg/hm2（高肥）、為112.5 kg/hm2（常規(guī)）和37.5 kg/hm2（低肥）。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行。

在穗肥常規(guī)用量小區(qū)，分別在小區(qū)兩側(cè)各8行進(jìn)行鋅肥和硒肥噴施試驗(yàn)，其中鋅肥使用量為1.5 kg/hm2、質(zhì)量濃度為1∶1000，硒肥使用量為200 mL/hm2、體積濃度1∶100。于抽穗期的下午5點(diǎn)，采用噴壺進(jìn)行葉面人工噴施，3 d后重復(fù)噴施一次。

1.5 測(cè)量?jī)?nèi)容與方法

1.5.1 農(nóng)藝性狀的測(cè)定

按照常規(guī)方法測(cè)定株高和有效分蘗個(gè)數(shù)，測(cè)定時(shí)避開(kāi)小區(qū)邊緣，連續(xù)測(cè)量10株，測(cè)定3次。收獲上述水稻的所有穗，每株選3個(gè)主穗測(cè)量穗粒數(shù)和實(shí)粒數(shù)，計(jì)算結(jié)實(shí)率。測(cè)量完畢后人工脫粒，曬干（含水量12%左右），用風(fēng)選機(jī)去除空癟粒，使用自動(dòng)數(shù)粒儀測(cè)量千粒重。

1.5.2 元素的測(cè)定

樣品制備：在成熟期收獲稻谷樣品，盆栽中為每盆內(nèi)混取，大田中為小區(qū)內(nèi)五點(diǎn)取樣。將收獲后的稻谷放入烘箱70℃烘干（含水量12%左右），干燥后脫粒去糠，再使用高速破碎機(jī)粉碎，隨后過(guò)100目篩，裝袋備用。

樣品消解：取0.5 g樣品，裝入微波消解儀（Mars）配套的消解罐中，再加入5 mL濃硝酸（GR）、3 mL超純水和0.2 mL過(guò)氧化氫。消解程序?yàn)椋?5 min內(nèi)升溫至180℃，180℃保持10 min，15 min降溫至80℃。消解結(jié)束后，打開(kāi)消解罐，放入通風(fēng)櫥中冷卻趕酸，結(jié)束后過(guò)濾到50 mL容量瓶中定容?；靹蚝笕?0 mL溶液裝入離心管保存，送測(cè)ICP-MS（電感耦合等離子體質(zhì)譜）。

1.5.3 稻米品質(zhì)的測(cè)定

在田間試驗(yàn)的不同處理的各小區(qū)中，分別隨機(jī)選取30個(gè)稻株，收獲所有稻穗進(jìn)行人工脫粒。稻谷曬干、風(fēng)選后，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T17891-2017優(yōu)質(zhì)稻谷》測(cè)定糙米率、精米率、整精米率、堊白率、堊白粒率、直鏈淀粉和蛋白質(zhì)含量等。采用日本佐竹公司的STA1A米飯食味機(jī)測(cè)定米飯的硬度、黏度、平衡度及綜合食味值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初級(jí)整理，采用SPSS 26.0進(jìn)行相關(guān)性狀值間的統(tǒng)計(jì)分析，其中盆栽試驗(yàn)中的相關(guān)性狀采用完全隨機(jī)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性測(cè)定，田間試驗(yàn)中的相關(guān)性狀采用隨機(jī)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性測(cè)定。采用GraphPad 8.0.2進(jìn)行相關(guān)圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsNramp5敲除系創(chuàng)制

通過(guò)搜索分析，我們?cè)贠sNramp5基因第9外顯子區(qū)域中的一個(gè)PAM位點(diǎn)處設(shè)計(jì)sgRNA（圖2-A），將合成的sgRNA片段與pC1300-Cas9載體進(jìn)行酶切和連接，最終獲得OsNramp5基因敲除載體pC1300-Cas9-OsNramp5-sgRNA（圖2-B）。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，最終在南粳46背景中獲得了多個(gè)T0轉(zhuǎn)基因植株，測(cè)序分析顯示有5株在目標(biāo)區(qū)域分別存在不同的序列變異，其中3個(gè)分別插入了1個(gè)不同的堿基（bp），另兩個(gè)分別缺失了2 bp和21 bp（圖2-C）。將敲除變異后的序列均轉(zhuǎn)換成氨基酸序列并與野生型（wild type,WT）序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)敲除系中的OsNramp5蛋白質(zhì)中的氨基酸均發(fā)生突變，表明均已失去原有功能（圖2-D）。為了后續(xù)能夠?qū)@些突變體基因型進(jìn)行快速鑒定與選擇，我們針對(duì)其中的3個(gè)敲除變異分別成功開(kāi)發(fā)了特異分子標(biāo)記。對(duì)于#1和#2，分別開(kāi)發(fā)了dCAPS標(biāo)記OsNramp5-G (F：CGGGTGCAGGTTCTTCCTGTACCAG；R：TTGT CGGCGTCCTCTTGG)和OsNramp5-T (F：CGGGT GCAGGTTCTTCCTGTACTAG；R：TTGTCGGCG TCCTCTTGG）。OsNramp5-G標(biāo)記前引物末端引入了一個(gè)錯(cuò)配堿基“C”，利用其擴(kuò)增#1系時(shí)，因?yàn)樵撉贸儺愊抵写嬖谝粋€(gè)“G”的插入變異而導(dǎo)致PCR產(chǎn)物中具有一個(gè)EcoRⅡ（^CCWGG）限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，相反在WT中PCR產(chǎn)物中由于不存在該插入變異而不能被EcoRⅡ酶切割，因此，在PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)EcoRⅡ酶切后，純合突變型的PCR產(chǎn)物可被切掉21 bp，電泳檢測(cè)后的片段大小明顯小于WT（圖2-E，泳道1和6），雜合型則呈現(xiàn)雙帶（圖2-E，泳道3、5、7和8）。類似原理設(shè)計(jì)了OsNramp5-T標(biāo)記，其前引物末端引入了一個(gè)錯(cuò)配堿基“T”，在#2系上該標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被限制性內(nèi)切酶SpeI（A^CTAGT）切掉21 bp，使得其片段明顯小于WT（圖2-E，泳道1、4和8），雜合型則呈現(xiàn)為雙帶（圖2-E，泳道5和6）。對(duì)于#5系，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)InDel標(biāo)記OsNramp5-CY（F：TTCGGGCTCCAGTACCAC；R：GAGACGACGGC GATGTTT），在#5系上的擴(kuò)增片段比WT對(duì)照小21 bp（圖2-E），因此可以特異鑒別其后代群體中的純合突變型（圖2-E）。

利用3個(gè)敲除變異系的特異分子標(biāo)記及潮霉素和Cas9編碼基因特異分子標(biāo)記，我們?cè)谄涓鲉沃曜越缓蟠后w中連續(xù)進(jìn)行了2個(gè)世代的標(biāo)記輔助選擇及驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行了表型篩選，最終在#1、#2和#5系的各T2群體中分別獲得了相應(yīng)突變型的純合型敲除系（命名為nramp5ko-1、-2、-3），通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)，我們證實(shí)這3個(gè)株系均不攜帶Hpt和Cas9蛋白編碼基因（圖2-F）。

圖2 OsNramp5敲除系的構(gòu)建和基因型檢測(cè)Fig. 2. Construction and genotyping of OsNramp5 knockout lines.

2.2 OsNra mp5敲除系中鎘和錳等元素的積累分析

通過(guò)初步觀測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)敲除系nramp5ko-3的株高和分蘗力明顯低于WT（圖3-A、B），生育期也明顯延遲，而另外兩個(gè)系則與WT總體相近，因此在后續(xù)試驗(yàn)中，僅對(duì)nramp5ko-1和nramp5ko-2兩個(gè)敲除系開(kāi)展了相關(guān)性狀分析。

為了明確敲除系對(duì)鎘的吸收情況，我們將nramp5ko-1、nramp5ko-2和WT分別種植于鎘含量不同的盆栽土壤中。在水稻成熟后，分別收獲不同處理下的各材料稻根、地上部和籽粒，測(cè)定它們的鎘含量。結(jié)果顯示（圖3-C），無(wú)論是根部、地上部還是籽粒中，nramp5ko-1和nramp5ko-2中的鎘含量均極顯著低于WT；當(dāng)土壤中鎘濃度提高時(shí)，WT不同部位中的鎘含量均迅速上升，而兩個(gè)敲除系中僅有根部鎘含量明顯提高，且均明顯低于WT。除此之外，無(wú)論在C1還是C2鎘濃度土壤中，敲除系籽粒中的鎘含量均低于0.02 mg/kg，而WT中則均超過(guò)國(guó)家規(guī)定的大米鎘含量限制標(biāo)準(zhǔn)0.2 mg/kg。這表明在粳稻中OsNramp5基因同樣是負(fù)責(zé)地上部和籽粒中鎘吸收的最關(guān)鍵基因，但在根中似乎還有其他基因參與，敲除該基因可以創(chuàng)制低鎘粳稻品種。

圖3 OsNramp5敲除系植株的株型及鎘和錳的含量分析Fig. 3. Whole plant and analysis of cadmium and manganese contents in OsNramp5 knockout lines.

由于OsNramp5在水稻中也參與對(duì)錳的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此我們測(cè)量了敲除系及WT地上部錳的含量，同時(shí)分析了葉面噴施錳肥是否有利于補(bǔ)充地上部的錳含量。結(jié)果顯示（圖3-D），敲除系地上部中的錳含量分別為70.08和68.27 mg/kg，極顯著低于WT中的392.69 mg/kg；在葉面噴施錳肥后，WT中的錳含量得到了明顯提高，達(dá)到了743.81 mg/kg，敲除系中的錳含量也得到了顯著提高，分別達(dá)到98.39 mg/kg和98.56 mg/kg，上升幅度明顯低于WT。這些結(jié)果表明，OsNramp5確實(shí)也是粳稻中對(duì)錳的主要吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)基因，但是葉面噴施錳肥可以在一定程度上提高OsNramp5-ko敲除系中的錳含量。

2.3 OsNramp5敲除系的產(chǎn)量性狀分析

進(jìn)一步在大田條件下比較了敲除系nramp5ko-1、nramp5ko-2及WT間的產(chǎn)量相關(guān)性狀差異，同時(shí)設(shè)置了三種分蘗肥用量處理。由表1可知，隨著分蘗肥用量的增加，水稻的分蘗數(shù)和穗粒數(shù)均呈上升趨勢(shì)。有意思的是，在低分蘗肥處理中，WT的分蘗數(shù)明顯少于敲除系，但在正常和高肥處理下，兩個(gè)敲除系與WT間的分蘗數(shù)均無(wú)顯著差異。無(wú)論在何種分蘗肥用量下，兩個(gè)敲除系中的穗粒數(shù)都少于WT，減少量為25.4～32.8（粒），差異均達(dá)到了顯著水平。在理論產(chǎn)量上，低分蘗肥用量處理中的兩個(gè)敲除系與WT間無(wú)顯著差異，但在正常和高濃度分蘗肥施用處理中，兩個(gè)敲除系的理論產(chǎn)量均顯著低于WT，且主要與穗粒數(shù)下降有關(guān)。以上結(jié)果顯示，敲除OsNramp5基因會(huì)影響到NJ46的穗粒數(shù)并最終造成減產(chǎn)，但在低分蘗肥處理中，未發(fā)現(xiàn)明顯影響。

表1 OsNramp5敲除系與對(duì)照在不同分蘗肥處理間的理論產(chǎn)量及其構(gòu)成因素比較Table 1. Comparison of theoretical yield and its components between OsNramp5 knockout lines and control at different tillering fertilizer levels.

2.4 OsNramp5基因敲除系對(duì)硒、鋅等元素的積累分析

為了評(píng)估敲除系是否影響籽粒對(duì)人體健康關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素鋅和硒的吸收，我們分別在田間正常分蘗肥用量處理中，增設(shè)了鋅肥和硒肥葉面噴施實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示（圖4），在未噴施兩種肥料的WT處理中，敲除系籽粒中的銅、錳和硒的含量均顯著低于對(duì)照，其中錳含量只有對(duì)照一半左右，這與上述盆栽結(jié)果一致；鎘的含量雖有降低但差異不顯著，可能與試驗(yàn)田土壤中的鎘含量較低有關(guān)；在鐵和鋅的含量上，敲除系與WT間均無(wú)明顯差異。在鋅肥噴施處理中，敲除系與WT籽粒中的鋅含量均顯著上升，雖然nramp5ko-1中的含量略高于nramp5ko-2和WT，但是三個(gè)材料的總體提升水平相當(dāng)，敲除系籽粒中的鋅平均含量從11.75 mg/kg提高至18.47 mg/kg，WT從11.68 mg/kg提高至18.22 mg/kg；敲除系中的錳和鐵含量還是顯著低于WT，其他元素含量間均無(wú)顯著差異。在硒肥處理中，發(fā)現(xiàn)敲除系和WT籽粒中硒含量均明顯高于未噴施對(duì)照，但是敲除系與WT間還是存在極顯著差異，敲除系籽粒硒平均含量從對(duì)照處理中的0.032 mg/kg升高至0.08 mg/kg，WT從0.046 mg/kg提高至0.12 mg/kg；在其他元素含量上，除了錳之外，敲除系和WT間均無(wú)顯著差異，如銅含量在未施鋅硒肥處理的敲除系與WT間存在顯著差異，但在施硒處理中則無(wú)差異，這可能與硒肥中含有一定量的銅元素有關(guān)。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)施用鋅肥和硒肥后，無(wú)論敲除系還是WT其籽粒中的鎘含量均有所下降，其中施用硒肥下降的更為明顯，分別比對(duì)照下降了38.3%和46.8%。

圖4 三種施肥處理下OsNramp5敲除系和野生型籽粒中的元素含量Fig. 4. Element contents in grains of OsNramp5 knockout lines and wild type under three fertilization treatments.

2.5 OsNramp5基因敲除系稻米品質(zhì)分析

為了進(jìn)一步分析敲除OsNramp5基因是否影響稻米品質(zhì)，我們分別收集并測(cè)定了正常分蘗肥處理及在此基礎(chǔ)上增施鋅肥和硒肥處理中的相關(guān)材料的稻米品質(zhì)（表2）。就加工品質(zhì)而言，不同處理內(nèi)，兩個(gè)敲除系與WT之間在糙米率和精米率上均無(wú)顯著差異；整精米率上，施用硒肥和鋅肥處理中，兩個(gè)敲除系的整精米率均顯著低于WT，分別降低了2.2%和2.18%。外觀品質(zhì)上，除了硒肥處理的堊白度在敲除系與WT間無(wú)顯著差異外，其他處理中敲除系堊白粒率和堊白度均顯著低于WT，說(shuō)明敲除系的稻米外觀品質(zhì)總體優(yōu)于WT。另外，值得注意的是，鋅肥處理的所有材料堊白粒率和堊白度均顯著高于對(duì)照，而施用硒肥則恰恰相反，說(shuō)明施硒可以改善稻米外觀，而施鋅則有損外觀（圖5）。

表2 OsNramp5-ko敲除系在不同施肥處理中的稻米加工和品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)差異比較Table 2. Comparison of rice processing and quality related indexes of OsNramp5-ko knockout lines under different fertilization treatments.

圖5 不同肥料處理下OsNramp5-KO及對(duì)照的精米外觀Fig. 5. Milled rice appearance of OsNramp5-KO lines and control under different fertilizer treatments.

進(jìn)一步對(duì)以上材料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定（表3）。結(jié)果顯示，在正常施肥處理中，兩個(gè)敲除系的蛋白質(zhì)含量和硬度均顯著高于WT，而直鏈淀粉含量、黏度、平衡度和食味質(zhì)均顯著低于WT，其他指標(biāo)無(wú)明顯差異。在硒肥處理中，發(fā)現(xiàn)與正常施肥對(duì)照相比，WT的蛋白質(zhì)含量得到了顯著提高，從6.82%提高至7.25%，但敲除系中無(wú)明顯影響；各材料的膠稠度均得到了顯著降低，黏度尤其對(duì)于WT材料也明顯降低；WT的食味值顯著降低，但是敲除系變化不大。在鋅肥處理中，發(fā)現(xiàn)正常施肥對(duì)照相比，施用鋅肥中的各材料直鏈淀粉含量均顯著提高，但在黏度值和食味值上僅有WT明顯降低，其他性狀均無(wú)明顯變化。

表3 OsNramp5-ko敲除系在不同施肥處理中的稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)差異比較Table 3. Comparison of OsNramp5-ko knockout lines in rice nutritional quality and food quality indexes under different fertilization treatments.

2.6 OsNramp5基因敲除系的耐逆性分析

水稻減數(shù)分裂期是對(duì)溫度最敏感的時(shí)期，過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)顯著影響花粉育性并最終造成減產(chǎn)。紋枯病一直是威脅水稻安全生產(chǎn)的重要病害之一，為此，我們?cè)u(píng)價(jià)了敲除OsNramp5基因是否影響水稻對(duì)高低溫和紋枯病的抗性。在高溫處理下，我們發(fā)現(xiàn)各材料的結(jié)實(shí)率均顯著降低，分別降至45.84%、52.09%和50.16%，彼此間無(wú)顯著差異；

低溫處理下，各材料間的結(jié)實(shí)率也均受到了顯著影響，分別降至79.89%、78.16%和78.94%，敲除系與WT間也無(wú)顯著差異（圖6-A）。在紋枯病接種鑒定中，我們發(fā)現(xiàn)敲除系nramp5ko-1和nramp5ko-2的病斑長(zhǎng)度分別為10.6 cm和11.5 cm，顯著長(zhǎng)于WT（7.2 cm）（圖6-B）。同時(shí)測(cè)量了莖稈長(zhǎng)度，進(jìn)而計(jì)算獲得相對(duì)病斑長(zhǎng)度，敲除系的相對(duì)病斑長(zhǎng)度也顯著長(zhǎng)于WT，結(jié)果表明，敲除OsNramp5基因?qū)λ驹诟叩蜏丨h(huán)境下的結(jié)實(shí)率影響不顯著，但顯著降低水稻對(duì)紋枯病的抗性。

圖6 OsNramp5敲除系在極端溫度及紋枯病菌接種處理下與野生型的抗逆性差異Fig 6. Stress resistance difference between OsNramp5 knockout lines and wild-type under extreme high and low temperature and rice sheath blight inoculation.

3 討論

3.1 OsNramp5基因在粳稻對(duì)鎘、錳、銅和硒的吸收和/或轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用

前人研究表明，OsNramp5在水稻中主要負(fù)責(zé)錳、鐵和鎘的吸收，敲除該基因會(huì)顯著影響水稻對(duì)三種元素的吸收，尤其是鎘和錳[18]。本研究通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)在高產(chǎn)優(yōu)良食味粳稻品種南粳46背景下對(duì)該基因進(jìn)行了敲除，通過(guò)測(cè)序及標(biāo)記輔助選項(xiàng)，獲得2個(gè)不同點(diǎn)突變純合敲除系。表型鑒定發(fā)現(xiàn)敲除該基因可極顯著降低粳稻米中的鎘含量，尤其在土壤鎘含量超標(biāo)情況下，可確保籽粒中鎘積累量遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的優(yōu)質(zhì)大米中鎘含量限值。另外，敲除該基因也確實(shí)顯著影響了水稻對(duì)錳、銅和硒的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)，但是未發(fā)現(xiàn)鐵和鋅元素的積累受到顯著影響。因此，在粳稻對(duì)鎘和錳的吸收和/或轉(zhuǎn)運(yùn)上，OsNramp5仍然是最主要的基因，同時(shí)也參與對(duì)銅和硒的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)。為了防止錳的積累量下降會(huì)影響到水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，我們開(kāi)展了葉面噴施錳肥試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)噴施錳肥可以顯著增加敲除系中錳的含量?？紤]到水稻對(duì)錳的依賴性總體較低，在正常生長(zhǎng)條件下，對(duì)錳的吸收適當(dāng)減少基本不會(huì)影響水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育[42]。本研究發(fā)現(xiàn)敲除系中的錳含量?jī)H為WT的一半左右，但在整個(gè)生長(zhǎng)周期，敲除系未出現(xiàn)異常表現(xiàn)或缺錳的表型癥狀。當(dāng)然，如果在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)OsNramp5敲除系中存在缺錳現(xiàn)象，那么也是可以通過(guò)葉面噴施錳肥進(jìn)行補(bǔ)充。

3.2 OsNramp5基因敲除系的產(chǎn)量、食味品質(zhì)和紋枯病抗性下降明顯

為進(jìn)一步評(píng)估該基因敲除材料在生產(chǎn)應(yīng)用中是否存在其他負(fù)面效應(yīng)，我們分別在大田條件下設(shè)置多種處理，詳細(xì)比較了敲除系與野生型在一些重要性狀上是否存在差異。總體而言，我們發(fā)現(xiàn)敲除OsNramp5基因會(huì)導(dǎo)致株高和穗粒數(shù)下降，并最終造成單株產(chǎn)量下降，兩個(gè)系分別比野生型對(duì)照減產(chǎn)21.2%和32.0%。在龍起樟和董家瑜等的研究中也發(fā)現(xiàn)敲除OsNramp5基因會(huì)導(dǎo)致水稻減產(chǎn)[42-43]。在Wang等[21]的研究中，發(fā)現(xiàn)了水稻產(chǎn)量等性狀與OsNramp5基因突變的幅度有關(guān)，越強(qiáng)烈的突變導(dǎo)致了越嚴(yán)重的減產(chǎn)，這可能也是本研究中nramp5ko-3的產(chǎn)量和綜合性狀明顯變劣的可能原因，后續(xù)有待進(jìn)一步的研究。

對(duì)OsNramp5基因敲除系的品質(zhì)性狀研究較少，龍起樟等[43]發(fā)現(xiàn)敲除系的外觀品質(zhì)和蛋白質(zhì)含量有所提高而直鏈淀粉含量略有降低，食味值變化不大。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲除該基因?qū)Φ久准庸て焚|(zhì)基本無(wú)影響，但有利于改進(jìn)外觀品質(zhì)，如降低堊白度和堊白粒率，我們分析這可能與穗粒數(shù)變少后更有利于灌漿和籽粒充實(shí)有關(guān)。敲除系的食味品質(zhì)明顯降低，相關(guān)參數(shù)指標(biāo)中顯示敲除系的蛋白質(zhì)含量和硬度顯著增加，而黏度和平衡度顯著降低，這應(yīng)該是敲除系食味值降低的最主要原因。此外，我們發(fā)現(xiàn)在不同溫度處理下的敲除系與WT間的結(jié)實(shí)率無(wú)差異，但敲除系的紋枯病抗性受到了顯著影響。這表明，雖然敲除OsNramp5有利于獲得低鎘育種材料，但也影響了產(chǎn)量、食味品質(zhì)和抗病性，說(shuō)明OsNramp5也參與了這些性狀的發(fā)育調(diào)控，但是具體機(jī)制是什么，還有待進(jìn)一步研究。生產(chǎn)中如果利用OsNramp5基因敲除系則需要注意紋枯病的防治。

3.3 葉面噴施鋅肥和硒肥會(huì)顯著影響稻米品質(zhì)

考慮到鋅和硒元素是人類四大生命健康元素，但在多數(shù)人日常飲食中的攝入不足，尤其是硒，造成隱性健康問(wèn)題[44]。為了判斷利用OsNramp5基因敲除系在降低鎘的吸收基礎(chǔ)上，是否影響稻米對(duì)鋅和硒的吸收，我們對(duì)相關(guān)材料開(kāi)展了體外噴施兩種肥料試驗(yàn)。雖然發(fā)現(xiàn)敲除OsNramp5基因會(huì)影響籽粒中硒的含量，但是體外噴施硒肥同樣可以顯著增加籽粒中的硒含量，達(dá)到富硒稻米標(biāo)準(zhǔn)。敲除該基因完全不影響籽粒對(duì)鋅的富集，且在施鋅后可以進(jìn)一步增加籽粒中的鋅含量。以上這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明，敲除OsNramp5基因在培育低鎘、富硒、富鋅粳稻品種中具有重要育種價(jià)值。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，為了更好發(fā)揮該基因在培育低鎘、健康、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)粳稻新品種中的價(jià)值，下一步有必要通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行飽和變異，探索是否存在可以兼顧各種性狀平衡的優(yōu)異等位變異。

在增施鋅肥和硒肥中，我們還發(fā)現(xiàn)施用鋅肥后會(huì)導(dǎo)致WT的外觀品質(zhì)和食味值顯著下降，施用硒肥雖然可以提升外觀品質(zhì)但同時(shí)也影響膠稠度和食味值，造成食味值明顯下降。我們懷疑這可能與在抽穗楊花揚(yáng)花期期施用這些元素后會(huì)激活或影響籽粒中的淀粉和蛋白合成或結(jié)構(gòu)變異的基因表達(dá)有關(guān)，具體有待進(jìn)一步分析研究。