范修琦，高穩(wěn)東，陳玉龍，韓懿存，孟偉，樊李妍，高啟龍

1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

肺癌是當(dāng)今世界上最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球肺癌發(fā)生率和死亡率分別占全部惡性腫瘤的11.4%和18.0%[1]。隨著免疫療法的發(fā)展，肺癌的治療手段已經(jīng)非常多樣化，但其死亡率仍然很高。因此，探究肺癌的發(fā)生機(jī)制，尋求新的治療靶點，對于肺癌的治療非常重要。鐵死亡(ferroptosis)是近年發(fā)現(xiàn)的一種鐵離子依賴性的非凋亡性細(xì)胞死亡形式，主要由細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物(lipid reactive oxygen species，lipid ROS)積累引起[2]。鐵死亡作為非凋亡性細(xì)胞死亡形式，已逐漸成為清除抵抗凋亡腫瘤細(xì)胞的新策略。腫瘤細(xì)胞的生長和分裂需要大量能量，而產(chǎn)能過程中伴隨著氧化應(yīng)激和活性氧的積累，此外，腫瘤細(xì)胞中存在著應(yīng)對氧化應(yīng)激的基因突變，賦予腫瘤細(xì)胞生長優(yōu)勢，使其對鐵死亡的抵抗力增強(qiáng)[3]。

中醫(yī)藥在癌癥的輔助治療中發(fā)揮著重要作用，鐵死亡這一新型的死亡方式為中醫(yī)藥抗腫瘤的研究提供了新的靶點。麥冬是一味傳統(tǒng)中藥，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效。多項研究證實，麥冬及其有效成分可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬、凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。此外，麥冬皂苷D(ophiopogonin D，OP-D)能通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝對抗心肌細(xì)胞氧化作用[6]，并能通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和鐵死亡途徑降低麥冬皂苷D′的心臟毒性[7]。本課題組前期通過水煎提取、醇浸提取、水提醇沉等多種提取工藝提取麥冬的有效成分，發(fā)現(xiàn)麥冬水提物及水提醇沉物對A549細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用，而麥冬乙醇提取物能抑制A549細(xì)胞活性，具有明顯的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，麥冬水提及水提醇沉法所得到的多糖成分居多[8]，而經(jīng)醇提所得的化合物則以皂苷類為主[9]。麥冬乙醇提取物能抑制A549細(xì)胞活性，但具體分子機(jī)制并不明確，對于其是否能調(diào)控細(xì)胞鐵死亡尚未有研究。本文將通過考察麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞的毒性作用，研究其抑制A549細(xì)胞活性與鐵死亡的關(guān)系，進(jìn)一步探討麥冬乙醇提取物抗腫瘤的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞人肺腺癌A549細(xì)胞株由河南中醫(yī)藥大學(xué)方證信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗室饋贈。

1.2 藥物與試劑麥冬[中國北京同仁堂(集團(tuán))有限公司，批號：20101004]。無水乙醇(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：21061223)；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)、胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量檢測試劑盒、ECL Plus超敏發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：12100、P1020、T1320、M1020、D8370、BC1175、PE0010)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，上海雙洳生物科技有限公司，貨號：S711-001S)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0146)，蛋白Marker(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：26616)；Anti-Keap1抗體、Anti-Nrf2抗體、Anti-NOX1抗體、Anti-COX2抗體、Anti-FHC、Anti-FACL4抗體(英國abcam公司，貨號：ab139729、ab62352、ab131088、ab179800、ab75972、ab155282)；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體(美國CST公司，貨號：2118S、7074S)；ReverTra Ace qPCR RT Kit[東洋紡(上海)生物科技有限公司，貨號：FSQ-101]；2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix(武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號：RM21203)。

1.3 儀器超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：37997)；CO2培養(yǎng)箱(德國Eppendorf 公司，型號：170R)；倒置顯微鏡(德國LEICA公司，型號：DFC450C)；電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司，型號：XB120A)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52AA)；真空泵(河南鞏義市英峪華中儀器廠，型號：SHZ-D)；冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)起航科技有限公司，型號：LGJ-12A)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號：FACSCalibur)；酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司，型號：ELx-800)；凝膠成像掃描儀(美國BIO-RAD公司，型號：ChemiDoc XRS+)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：QuantStudio 6)。

2 方法

2.1 藥物制備稱量麥冬50 g并粉碎，按質(zhì)量體積比1：10的比例加入70%乙醇500 mL，避光冷浸1周，每天攪拌1次，1周后過濾，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，濃縮并干燥成膏狀，稱量收集藥物的質(zhì)量，計算出膏率。出膏率=提取物質(zhì)量/生藥質(zhì)量×100%=0.090 8 g/50 g=0.181 6%。使用時先用DMSO配置藥物母液250 g·L-1，再用培養(yǎng)基配置成濃度為50 g·L-1的中間工作液，給藥時用培養(yǎng)基分別配置成濃度為400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的溶液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)10% FBS與90% DMEM高糖培養(yǎng)基混勻，配制成完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2濃度及飽和濕度下培養(yǎng)A549細(xì)胞，每3～4 d傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2.3 MTT檢測麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞活性的影響調(diào)整A549細(xì)胞密度至4.0×104mL-1，接種于96孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為400 mg·L-1、200 mg·L-1、100 mg·L-1、50 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，對照組加入完全培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔，周圍用PBS封邊，設(shè)為空白孔；培養(yǎng) 48 h 后，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g·L-1)的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻，孔內(nèi)甲臜結(jié)晶完全溶解后，測定570 nm波長處光吸收值。

細(xì)胞活性=(OD給藥孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)×100%

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡調(diào)整A549細(xì)胞密度至1.5×105mL-1，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后分別加入濃度200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基上清，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集，PBS清洗并收集孔內(nèi)殘留細(xì)胞，做好標(biāo)記，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS清洗兩遍后加入稀釋好的1×Buffer，于避光處每管加入 10 μL Annexin V和5 μL PI染色液染色，輕微震蕩混勻后，避光孵育10 min，上機(jī)檢測。

2.5 A549細(xì)胞中GSH含量變化檢測調(diào)整A549細(xì)胞密度至1.25×105mL-1，接種于培養(yǎng)皿中，每皿8 mL，培養(yǎng)24 h后分別加入濃度為200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化細(xì)胞并收集，600×g離心10 min，棄上清，用PBS清洗兩遍后，加入3倍細(xì)胞沉淀體積的試劑重懸細(xì)胞，于液氮中速凍，并用37 ℃水浴溶解，反復(fù)凍融3次后，8 000×g離心10 min，收集上清。按照試劑盒說明書操作配置標(biāo)準(zhǔn)曲線并測量GSH的含量，實驗重復(fù)3次。

2.6 Western Blot檢測A549細(xì)胞FHC、COX2、FACL4、Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)水平調(diào)整A549細(xì)胞密度至1.25×105mL-1，接種于培養(yǎng)皿中，每皿 8 mL，培養(yǎng)24 h后分別加入濃度為200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，BSA提取細(xì)胞總蛋白后采用BCA法檢測蛋白濃度，然后進(jìn)行蛋白變性，配膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗采用5%脫脂牛奶稀釋(GAPDH、Keap1、Nrf2、FHC按照1：1 000的比例稀釋，COX2稀釋比例為1：2 000，F(xiàn)ACL4稀釋比例為1：20 000)，孵育2 h，二抗采用5%脫脂牛奶稀釋(稀釋比例為1：1 000)，孵育1 h，ECL超敏發(fā)光液顯色。用BIO-RAD全能型凝膠成像分析系統(tǒng)顯影，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/內(nèi)參表達(dá)量，分析目標(biāo)條帶的光密度值。實驗重復(fù)3次。

2.7 RT-PCR法檢測A549細(xì)胞FHC、COX2、FACL4、Keap1及Nrf2的mRNA表達(dá)水平調(diào)整A549細(xì)胞密度至1.5×105mL-1，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后分別加入濃度為 200 mg·L-1、100 mg·L-1、0 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA濃度，將RNA在65 ℃條件下進(jìn)行5 min的預(yù)變性，再按照如下反應(yīng)體系(表1)，在37 ℃條件下進(jìn)行 15 min 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在98 ℃條件下進(jìn)行 5 min 的酶失活反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后冰上配置如下PCR反應(yīng)體系，添加完畢后小心震蕩混勻并瞬時離心，將配好的反應(yīng)體系(表1)轉(zhuǎn)移至PCR板內(nèi)，光學(xué)密封薄膜密封，PCR板2 500 r·min-1離心 60 s，上機(jī)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，1個循環(huán)，循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對定量分析，考察相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。引物由河南點睛生物科技有限公司合成，引物序列見表2。

表1 逆轉(zhuǎn)錄體系及PCR擴(kuò)增體系

表2 引物序列

3 結(jié)果

3.1 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞活性的影響采用MTT法檢測麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示：麥冬乙醇提取物能明顯抑制A549細(xì)胞活性，且抑制作用與濃度成正比。利用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件計算出麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞的IC30為93.660 mg·L-1，IC50為208.853 mg·L-1。為方便計算，分別選取100 mg·L-1和200 mg·L-1代表IC30和IC50進(jìn)行后續(xù)試驗。見圖1。

圖1 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞活性的影響(n=5)

3.2 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞形態(tài)變化的影響顯微鏡下觀察顯示，0 mg·L-1組A549細(xì)胞呈梭形；麥冬乙醇提取物作用后，A549細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且 200 mg·L-1組A549細(xì)胞體積明顯縮小，胞質(zhì)固縮。見圖2。

注：A：0 mg·L-1組；B：100 mg·L-1組；C：200 mg·L-1組圖2 A549細(xì)胞形態(tài)改變(×200)

3.3 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著提高A549細(xì)胞凋亡水平(P<0.01)，且200 mg·L-1組細(xì)胞凋亡率顯著高于 100 mg·L-1組(P<0.001)。見圖3及圖4A。

注：A：0 mg·L-1組流式圖；B：100 mg·L-1組流式圖；C：200 mg·L-1流式圖圖3 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞凋亡的影響(n=5)

3.4 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞GSH水平的影響GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，與鐵死亡呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果顯示，與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著降低GSH水平(P<0.01)。見圖4B。

注：0 mg·L-1組比較，**P<0.01；A：麥冬乙醇提取物誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；B：A549細(xì)胞中GSH含量變化圖4 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞的影響(n=5)

3.5 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表達(dá)的影響為了探究麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞的抑制作用與鐵死亡的關(guān)系，檢測了鐵死亡相關(guān)因子FHC、COX2、FACL4蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果顯示：與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著上調(diào)FHC蛋白和mRNA及COX2mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)。見圖5。

注：A：FACL4、COX2、FHC mRNA表達(dá)水平比較；B：FACL4、COX2、FHC蛋白表達(dá)水平比較；C：FACL4、COX2、FHC蛋白條帶圖；與0 mg·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞FACL4、COX2、FHC蛋白和基因表達(dá)的影響(n=3)

3.6 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表達(dá)的影響與0 mg·L-1組相比，麥冬乙醇提取物能顯著降低Keap1和Nrf2蛋白及基因的表達(dá)水平(P<0.05)。見圖6。

注：A：Keap1、Nrf2 mRNA表達(dá)水平比較；B：Keap1、Nrf2蛋白表達(dá)水平比較；C：Keap1、Nrf2蛋白條帶圖片；與0 mg·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖6 麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞Keap1、Nrf2蛋白和基因表達(dá)的影響(n=3)

4 討論

肺癌惡性程度高，治療效果有限，預(yù)后較差，因此尋找新的治療肺癌的途徑至關(guān)重要。鐵死亡是一種有別于凋亡、壞死、自噬等方式的新型細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞中游離鐵經(jīng)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基，或通過參與酶促反應(yīng)誘導(dǎo)膜脂多不飽和脂肪酸氧化[10]。同時，細(xì)胞中存在清除脂質(zhì)過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4，GPX4)、輔酶Q氧化還原酶(CoQ oxidoreductase，F(xiàn)SP1)等抵抗脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)性機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)ROS處于動態(tài)平衡狀態(tài)。而當(dāng)細(xì)胞中ROS積累過多，GPX4等保護(hù)性通路失活時，細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性被ROS破壞，最終誘發(fā)鐵死亡[11]。肺癌組織普遍有著更高的活性氧和脂質(zhì)氧化標(biāo)志物水平，肺癌組織中普遍高表達(dá)鐵蛋白，并使血清鐵蛋白水平升高[12]，此外，鐵死亡誘導(dǎo)能夠增強(qiáng)放療及化療的敏感性[13-16]，也進(jìn)一步說明鐵死亡與肺癌關(guān)系密切。

麥冬具有滋陰潤肺、養(yǎng)陰生津的功效，以麥冬為主藥的抗癌方劑如沙參麥冬湯、麥門冬湯等在肺癌的臨床治療中發(fā)揮著重要作用，能提高患者免疫水平，提高放化療的敏感性，降低放化療的副作用[17-19]。麥冬也是一味抗癌中藥，通過多種途徑發(fā)揮抗癌作用，麥冬中的皂苷D、黃酮類化合物可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，導(dǎo)致A549細(xì)胞自噬[20-21]。

GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，是GPX4重要的合成底物，GPX4通過減少鐵依賴的脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘闹|(zhì)自由基，減少ROS的積累而抑制鐵死亡[22]。GSH與鐵死亡呈負(fù)相關(guān)，常用來衡量鐵死亡的水平。本研究中，麥冬乙醇提取物顯著抑制GSH的水平，提示麥冬乙醇提取物可能促進(jìn)A549細(xì)胞鐵死亡。

為了探究麥冬乙醇提取物對A549細(xì)胞活性的抑制作用與鐵死亡的相關(guān)性，本文檢測了鐵死亡相關(guān)因子COX2、FACL4、FTH1的表達(dá)。COX2是一種鐵死亡敏感蛋白，在鐵死亡發(fā)生時被顯著上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，在麥冬乙醇提取物作用下，COX2表達(dá)增多。FACL4是脂肪酸代謝的第一步，在體內(nèi)催化合成脂酰CoA，將長鏈多不飽和脂肪酸活化，以參加膜磷脂的合成，但是這些膜上的長鏈不飽和脂肪酸常被氧化，從而誘發(fā)鐵死亡[23]。FACL4表達(dá)與細(xì)胞鐵死亡敏感性正相關(guān)[24]，可通過增加多不飽和脂肪酸比例，降低脂質(zhì)氧化耐受性，易化鐵死亡[25]。在本研究中，麥冬乙醇提取物作用下，F(xiàn)ACL4表達(dá)增多。鐵蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中的主要細(xì)胞內(nèi)儲鐵蛋白，在鐵代謝中起主要作用[26]。鐵蛋白是一種24個亞基的球形和空心蛋白質(zhì)復(fù)合物，細(xì)胞質(zhì)鐵蛋白由兩種不同類型的亞基組成：19 kDa堿性 FLC 亞基和21 kDa酸性FHC亞基。FHC具有亞鐵氧化酶活性，可特異性地將二價鐵 (Fe2+)氧化為三價鐵 (Fe3+)[27-28]。發(fā)生鐵死亡的細(xì)胞中，鐵蛋白重鏈FHC表達(dá)升高[29]。在本研究中，麥冬乙醇提取物能夠促進(jìn)A549細(xì)胞FHC、COX2、FACL4蛋白和基因表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞鐵死亡。

不僅是鐵死亡，脂質(zhì)過氧化在細(xì)胞凋亡中同樣起著重要作用。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與膜受體和轉(zhuǎn)錄因子相互作用可以刺激內(nèi)在和外在的凋亡信號通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。細(xì)胞內(nèi)GSH濃度降低是線粒體凋亡信號傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)的早期事件[31]，GSH耗竭是由包括細(xì)胞毒性藥物刺激、壓力及環(huán)境因素等引發(fā)的凋亡性細(xì)胞死亡的共同特征[32]。本研究中，麥冬乙醇提取物能明顯增加A549細(xì)胞的凋亡程度，可能與抑制GSH相關(guān)。

此外，為了研究麥冬乙醇提取物促進(jìn)A549細(xì)胞鐵死亡的具體機(jī)制，本研究檢測了Keap1、Nrf2分子的表達(dá)。Nrf2主要調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)、氧化還原穩(wěn)態(tài)和代謝平衡，是重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2泛素化后易位至細(xì)胞核，通過與sMAF蛋白的異二聚化作用結(jié)合到靶基因的ARE/EpRE(抗氧化反應(yīng)元件/親電響應(yīng)元件)，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞保護(hù)性基因表達(dá)，如NQO1、GST、HMOX1、GCL、GSH，抑制細(xì)胞鐵攝取、限制 ROS 產(chǎn)生，是鐵死亡的重要抑制劑[33]。Keap1是Nrf2上游的重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子[34]，有研究證實，P62能夠通過Keap1促進(jìn)Nrf2的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞 HCC鐵死亡[35]。在本研究中可以觀察到，麥冬乙醇提取物能顯著抑制A549細(xì)胞活性，抑制強(qiáng)度與藥物濃度成正比，同時，麥冬乙醇提取物能顯著提高A549細(xì)胞凋亡水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，麥冬乙醇提取物能夠在基因和蛋白水平抑制A549細(xì)胞Keap1、Nrf2的表達(dá)，兩者作為鐵死亡的通路抑制分子，能抑制鐵死亡，提示麥冬乙醇提取物促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡作用可能與Keap1/Nrf2通路相關(guān)。

綜上所述，麥冬乙醇提取物可通過抑制A549細(xì)胞GSH水平，促進(jìn)A549細(xì)胞鐵死亡相關(guān)分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制A549細(xì)胞活性，其作用機(jī)制可能與抑制Keap1/Nrf2途徑有關(guān)。后期我們將運(yùn)用鐵死亡抑制劑及Nrf2抑制劑進(jìn)一步實驗，以求它們之間的相關(guān)性；同時在體內(nèi)進(jìn)行驗證對比麥冬乙醇提取物的療效；最后，將通過藥物質(zhì)譜分析進(jìn)一步篩選麥冬乙醇提取物中發(fā)揮主要作用的有效成分并進(jìn)行驗證，為肺癌的中醫(yī)藥治療提供了新的靶點和理論依據(jù)，為其臨床應(yīng)用提供理論支持。