趙磊，萬磊，劉健，黃傳兵，馬熙檬，朱子衡，李舒，李方澤，葛瑤，劉天陽，劉磊，李明

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種復(fù)雜的慢性炎癥性自身免疫性疾病，常累及小關(guān)節(jié)，病變呈對稱性、侵襲性和致殘性，其特征是明顯的滑膜增生和關(guān)節(jié)滑膜炎，是炎癥細(xì)胞因子顯著過度生產(chǎn)導(dǎo)致骨和軟骨破壞的結(jié)果[1-2]。RA患者的滑膜中存在著大量巨噬細(xì)胞，參與RA炎性反應(yīng)的多個階段和環(huán)節(jié)，在RA發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，與RA疾病活動密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞極化可分泌大量促炎性細(xì)胞因子、趨化因子，激活成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞，加速機體炎癥反應(yīng)，造成關(guān)節(jié)破壞[3-4]。Notch信號通路出現(xiàn)在大多數(shù)生物中，參與調(diào)節(jié)分化、增殖、黏附、凋亡等各種細(xì)胞過程，在包括免疫反應(yīng)、炎癥性疾病等在內(nèi)的疾病中起著關(guān)鍵作用[5-6]。研究表明，Notch1在滑膜組織和活化的巨噬細(xì)胞中過表達(dá)[7]。

中醫(yī)藥通過整體調(diào)節(jié)作用在治療RA時發(fā)揮療效好、價格便宜、副作用少等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于臨床。新風(fēng)膠囊為新安醫(yī)家劉健教授據(jù)多年臨床經(jīng)驗所創(chuàng)，由雷公藤、黃芪、薏苡仁、蜈蚣配伍組成，具有健脾化濕通絡(luò)之功效。前期臨床及動物實驗表明，新風(fēng)膠囊能明顯改善RA患者關(guān)節(jié)腫脹、晨僵、滑膜炎癥反應(yīng)等，降低關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥極化狀態(tài)，還可通過調(diào)節(jié)Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)Notch1、Hes1蛋白的表達(dá)，降低致炎介質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，延緩RA發(fā)病進(jìn)程[8-9]。本研究通過考察新風(fēng)膠囊對RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響探討其治療RA的作用機制。

1 材料

1.1 動物清潔級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量 (190±20) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：Lscxk (皖) 2017-001。標(biāo)準(zhǔn)清潔級動物房飼養(yǎng)，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%，保持通風(fēng)排氣10～20次·h-1。本實驗通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)，動物倫理編號：AHUCM-rats-2021022。

1.2 藥物與試劑新風(fēng)膠囊(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，批號：191015)；甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：191213)。弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，貨號MB9887)；白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-10、IL-23、TGF-β 試劑盒(武漢基因美公司，貨號：JYM0419Ra、JYM0651Ra、JYM0297Ra、JYM0636Ra)；CD68-FITC、CD80-PE、CD163-AF647、兔Notch1抗體(美國santa cruz生物技術(shù)公司，貨號：SC-20060FITC、SC-18866 PE、SC-20066 AF647、SC-32745)；兔Hes1抗體(美國abcam公司，貨號：ab108937)。

1.3 儀器流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：navios)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CKX31)；離心機(上海和欣科教設(shè)備有限公司，型號：80-2)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥按照隨機對照表將32只大鼠隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組和新風(fēng)膠囊組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(每只0.1 mL)以致炎，構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型[10-11]。致炎后第12天開始給藥，將新風(fēng)膠囊粉末溶于0.9%氯化鈉溶液制成0.34 g·L-1混懸液；甲氨蝶呤研成細(xì)粉后，將細(xì)末溶于0.9%氯化鈉溶液制成0.95 mg·L-1混懸液。按10 mL·kg-1灌胃給藥，新風(fēng)膠囊組每天1次，甲氨蝶呤組每周1次，正常組及模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1灌胃，每天1次，給藥周期30 d。

2.2 大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測定給藥后30 d測量各組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)[12]。足跖腫脹度=(造模后足趾容積-造模前足趾容積)/造模前足趾容積。關(guān)節(jié)炎病變指數(shù)按5級評分法評價，無紅腫現(xiàn)象為0分，小趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫為1分，趾關(guān)節(jié)和足跖出現(xiàn)腫脹為2分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪發(fā)生腫脹為3分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪發(fā)生腫脹為4分。

2.3 關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察各組大鼠取右后足遠(yuǎn)端趾間關(guān)節(jié)，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，切片(修、切、展、貼、烤片)，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察大鼠關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織病理形態(tài)變化。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血炎癥極化標(biāo)志物CD80+細(xì)胞、CD163+細(xì)胞的表達(dá)取大鼠新鮮血液100 μL，按1×106個細(xì)胞/管分別加入 CD80-PE、CD163-AF647抗體。按照說明書操作，采用EPICS型流式細(xì)胞儀檢測。用flowJoV10軟件對流式細(xì)胞圖像進(jìn)行分析，統(tǒng)計CD80+細(xì)胞、CD163+細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值作為M1、M2型巨噬細(xì)胞相對表達(dá)量。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清細(xì)胞因子IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的表達(dá)腹主動脈采血，離心取上清液，依照ELISA試劑盒說明操作檢測IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的OD值，繪制IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β標(biāo)準(zhǔn)曲線，測算出大鼠血清 IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β濃度。

2.6 Western Blot檢測Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平用蛋白提取試劑盒提取滑膜總蛋白，電泳分離，采用半干法轉(zhuǎn)膜使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至膜上，用室溫5%的脫脂奶粉封閉膜2 h。免疫反應(yīng)：將Notch1、Hes1抗體1：2 000稀釋后和膜一起室溫下孵育 2 h，加入二抗(稀釋比例為1：8 000)室溫孵育1 h。采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照。計算各組Notch1、Hes1條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參β-actin灰度值的比值做為滑膜Notch1、Hes1蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 新風(fēng)膠囊對RA大鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響與正常組比較，模型組RA大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，新風(fēng)膠囊組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

3.2 新風(fēng)膠囊對關(guān)節(jié)滑膜病理變化的影響HE染色顯示，正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，滑膜無肥大、突起，無炎性細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞分界清楚，分層較少；模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜可見大量炎性細(xì)胞浸潤，多為嗜酸性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，滑膜血管增多，血管壁及其周圍附屬組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜襯細(xì)胞分層增多；新風(fēng)膠囊組大鼠的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較為完整，滑膜細(xì)胞排列比較整齊，關(guān)節(jié)滑膜、血管壁出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)面整體結(jié)構(gòu)較為規(guī)整；甲氨蝶呤組大鼠關(guān)節(jié)面滑膜細(xì)胞排列較整齊，關(guān)節(jié)面較模糊，部分關(guān)節(jié)軟骨處可見血管翳形成。見圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠足趾關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化(×200)

3.3 新風(fēng)膠囊對RA大鼠M1、M2表面標(biāo)志物的影響與正常組比較，模型組RA大鼠CD80+細(xì)胞表達(dá)明顯升高(P<0.01)，CD163+細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，新風(fēng)膠囊組CD80+細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0.01)，CD163+細(xì)胞表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表2，圖2，圖3。

圖2 大鼠外周血M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD80+細(xì)胞表達(dá)

圖3 大鼠外周血M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163+細(xì)胞表達(dá)

表2 各組大鼠M1、M2表面標(biāo)志物的比較

3.4 新風(fēng)膠囊對RA大鼠IL-1、IL-23、IL-10、 TGF-β水平的影響與正常組比較，模型組大鼠IL-1、IL-23、TGF-β表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IL-10表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，新風(fēng)膠囊組IL-1、IL-23、TGF-β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IL-10表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1、IL-23、IL-10及TGF-β水平比較

3.5 新風(fēng)膠囊對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白的影響與正常組比較，模型組大鼠滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，新風(fēng)膠囊組滑膜組織中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表4，圖4。

表4 各組大鼠Notch1、Hes1蛋白表達(dá)水平比較

圖4 Notch1、Hes1蛋白條帶圖

4 討論

RA是一種自身免疫性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，可通過巨噬細(xì)胞浸潤、淋巴細(xì)胞聚集及滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖促進(jìn)IL-1、IL-23等炎癥細(xì)胞因子的分泌，造成局部和全身性骨丟失，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕和破壞[13-15]。IL-1是早期關(guān)節(jié)炎的重要觸發(fā)因子，RA患者血液和關(guān)節(jié)滑膜液中均可檢測到IL-1的表達(dá)升高。IL-1還可和TNF-α共刺激滑膜巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，從而導(dǎo)致RA滑膜、軟骨的破壞[16-17]。IL-23能夠通過激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)系統(tǒng)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，導(dǎo)致過度骨吸收，加速RA骨丟失[18-19]。

RA 屬于中醫(yī)“痹證”范疇，多呈現(xiàn)“脾虛濕盛、痰瘀膠著”的證候?qū)W特征。針對RA病機特征，具有健脾益氣、化濕通絡(luò)功效的中藥新風(fēng)膠囊被創(chuàng)制，且臨床療效確切[20-21]。君藥黃芪、薏苡仁及其單體有效成分能抑制促炎因子IL-1β的表達(dá)，提高抗炎因子IL-10水平，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種生理功能，抑制大鼠滑膜細(xì)胞過度增殖，減輕炎癥反應(yīng)[22-24]。臣藥雷公藤及蜈蚣對消除RA炎癥具有重要作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雷公藤甲素可通過降低RA成纖維樣滑膜細(xì)胞中miR-221及炎癥因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和分泌，從而抑制炎癥并緩解RA癥狀[25]；蜈蚣提取物可通過減弱NF-κB信號通路的激活和抑制體內(nèi)外促炎介質(zhì)的產(chǎn)生來發(fā)揮抗炎癥的作用，從而達(dá)到控制病情進(jìn)展的目的[26]。

在體內(nèi)外不同環(huán)境因素的影響下，巨噬細(xì)胞可極化成M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞兩個亞群，M1巨噬細(xì)胞常見的標(biāo)志物有CD80+細(xì)胞，可分泌大量促炎性細(xì)胞因子(如IL-1、IL-23、TGF-β)，激活成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞，加速機體炎癥反應(yīng)，造成關(guān)節(jié)破壞。M2巨噬細(xì)胞常見的標(biāo)志物有CD163+細(xì)胞，通過大量產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子(主要是IL-10)，促進(jìn)血管生成、組織重塑和修復(fù)[27]。在γ分泌蛋白酶的介導(dǎo)下，Notch受體(Notch1到Notch4)與配體(Delta1、Delta3、Delta4及Jagged1-2)相互作用，結(jié)合下游信號蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，影響下游靶基因Hes1的表達(dá)，激活Notch信號通路，致巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，加重RA炎癥反應(yīng)[28-29]。研究表明，當(dāng)Notch1通路被抑制時，巨噬細(xì)胞極化同時被抑制，炎性細(xì)胞因子的水平明顯降低，IL-10水平升高[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)新風(fēng)膠囊治療后，RA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足趾腫脹度癥狀得到顯著改善，M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD80+細(xì)胞及其炎性細(xì)胞因子 IL-1、IL-23等水平顯著降低，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD163+細(xì)胞及其抗炎細(xì)胞因子IL-10等表達(dá)顯著升高，同時Notch1、Hes1的表達(dá)降低，說明新風(fēng)膠囊能通過調(diào)節(jié)Notch1通路、巨噬細(xì)胞極化改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥。

綜上所述，新風(fēng)膠囊可能通過抑制Notch1通路、巨噬細(xì)胞極化，降低關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)，抑制關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善RA關(guān)節(jié)炎癥。