顧 煒，祝劍平，吳品雯

復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院 麻醉科，上海 201199

缺氧會(huì)引起腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致能量剝奪和功能障礙，伴隨神經(jīng)元凋亡[1]。丙泊酚(propofol)是一種高脂溶性麻醉藥，廣泛用于接受手術(shù)或重癥監(jiān)護(hù)的患者的麻醉和鎮(zhèn)靜。既往研究表明，丙泊酚具有抗氧化、抗炎等特性，可以改善缺血低氧/再灌注誘導(dǎo)的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12的損傷[2]，此外，丙泊酚通過(guò)上調(diào)微小RNA(microRNA，miRNA/miR)-153，減輕低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的神經(jīng)凋亡[3]。然而丙泊酚對(duì)低氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)的影響即調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。MiRNA指長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA。在所有這些已鑒定的miRNA中，miR-141-3p被證明在缺血性卒中隔離后顯著增加，抗miR-141-3p可能用于卒中治療[4]。miR-141-3p在帕金森病體外細(xì)胞模型中誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[5]。此外，miR-141-3p的下調(diào)是淫羊藿次苷Ⅱ改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的重要途徑之一[6]。但miR-141-3p是否參與丙泊酚影響低氧處理的PC12細(xì)胞的過(guò)程仍未可知。本研究旨在考察丙泊酚對(duì)低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，并通過(guò)miR-141-3p探討丙泊酚的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12(pheochromocytoma cell line， PC12)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))；丙泊酚(Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen公司)；抗miR-141-3p(anti-miR-141-3p)、對(duì)照anti-miR-con、miR-141-3p模擬物和模擬物對(duì)照miR-con(Ribobio公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒和BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Beyotime公司)；抗活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved caspase-3)抗體(Abcam公司)；PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa公司)；SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組和處理：PC12細(xì)胞維持在10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中增殖。PC12細(xì)胞置于94% N2、5% CO2和1% O2的培養(yǎng)箱中保持48 h。

將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、低氧組(刺激PC12細(xì)胞48 h)、(5、10、20 μmol/L)丙泊酚(刺激PC12細(xì)胞48 h)+低氧組、anti-miR-con+低氧組、anti-miR-141-3p+低氧組、miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組、miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組。其中常氧培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為對(duì)照組，低氧培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為低氧組，5、10、20 μmol/L丙泊酚給藥后于低氧條件下孵育，為5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組。利用Lipofectamine 3000試劑在PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-141-3p并進(jìn)行低氧培養(yǎng)，為anti-miR-con+低氧組、anti-miR-141-3p+低氧組。PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-con、miR-141-3p模擬物，并進(jìn)行20 μmol/L丙泊酚和低氧培養(yǎng)，為(miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧)組、(miR-141-3p+20 μmol/L丙泊酚+低氧)組。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收獲PC12細(xì)胞(5×105個(gè))，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后用結(jié)合緩沖液懸浮。按照細(xì)胞凋亡試劑盒操作指示，用膜聯(lián)蛋白Ⅴ(annexin Ⅴ)-FITC和碘化丙啶(propid-ium iodide，PI)溶液處理細(xì)胞。使用Becton Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)：使用RIPA裂解緩沖液從PC12細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，蛋白濃度用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定。蛋白質(zhì)通過(guò)12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后，將膜與一抗cleaved caspase-3、內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(4 ℃，過(guò)夜)和由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(室溫，1 h)按序孵育。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光方法捕獲信號(hào)，并使用Image Lab軟件進(jìn)行cleaved caspase-3定量條帶強(qiáng)度分析。

1.2.4 試劑盒檢測(cè)MDA含量、SOD活性：收獲PC12細(xì)胞上清液，分別使用檢測(cè)試劑盒測(cè)定MDA含量和SOD活性。

1.2.5 活性氧熒光探針DCFH-DA法測(cè)定ROS含量：將PC12細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)接種在6孔板中。進(jìn)行不同處理后，用磷酸鹽緩沖液洗滌PC12細(xì)胞，然后在含有10 μmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基中，37 ℃避光培養(yǎng)30 min。用Becton Dickinson FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.2.6 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6含量：收獲PC12細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒操作步驟，使用ELISA測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá)：使用TRIzol從PC12細(xì)胞中提取總RNA。使用Prime Script RT Master Mix進(jìn)行miR-141-3p的cDNA合成。使用SYBR Green Master Mix在ABI 7500儀器上進(jìn)行基因擴(kuò)增。miR-141-3p的計(jì)算按照2-△△Ct法進(jìn)行。引物序列如下：miR-141-3p F 5′-CGGGCTAACACTGTCTG GTAAAG-3′，miR-141-3p R 5′-GTGCAGGGTCCGAGG TATTC-3′，內(nèi)參U6F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6R 5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，低氧組PC12細(xì)胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高；與低氧組比較，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細(xì)胞的凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(shì)(P<0.05)(表1，圖1)。

2.2 丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

與對(duì)照組比較，低氧組PC12細(xì)胞的MDA含量增加，SOD活性減弱，ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高；與低氧組比較，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細(xì)胞的MDA含量隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(shì)，SOD活性隨丙泊酚濃度的增加呈升高趨勢(shì)，ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(shì)(P<0.05)(表2)。

表1 不同濃度丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響

2.3 丙泊酚對(duì)miR-141-3p表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，低氧組PC12細(xì)胞的miR-141-3p表達(dá)量升高；與低氧組比較，5、10、20 μmol/L丙泊酚+低氧組PC12細(xì)胞的miR-141-3p表達(dá)量隨丙泊酚濃度的增加呈降低趨勢(shì)(P<0.05)(表3)。

2.4 Anti-miR-141-3p對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

Anti-miR-141-3p+低氧組PC12細(xì)胞的miR-141-3p表達(dá)量、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平、MDA含量均比anti-miR-con+低氧組降低，SOD活性比anti-miR-con+低氧組增加，ROS、 TNF-α、 IL-1β、 IL-6含量和細(xì)胞凋亡率均比anti-miR-con+低氧組減少(P<0.05)(表4，圖2)。

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot detection of cleaved caspase-3 protein expression圖1 不同濃度丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Effect of different concentrations of propofol on the apoptosis of PC12 cells treated with hypoxia

表2 丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

表3 丙泊酚對(duì)miR-141-3p表達(dá)的影響

2.5 miR-141-3p逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12凋亡，氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

miR-141-3p+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組PC12細(xì)胞的miR-141-3p表達(dá)量、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平、MDA含量均高于miR-con+20 μmol/L 丙泊酚+低氧組，SOD活性低于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧組，ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和細(xì)胞凋亡率均高于miR-con+20 μmol/L丙泊酚+低氧組(P<0.05)(表5，圖3)。

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein圖2 Anti-miR-141-3p對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effect of anti-miR-141-3p on the apoptosis of hypoxia-treated PC12 cells

表4 Anti-miR-141-3p對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

表5 miR-141-3p可以逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響

A.flow cytometry to detect apoptosis; B.Western blot to detect the expression of cleaved caspase-3 protein圖3 miR-141-3p可以逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 miR-141-3p could reverse the effects of propofol on hypoxia-treated PC12 cells apoptosis

3 討論

細(xì)胞凋亡與低氧引起的損傷密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)低氧可促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，但5、10、20 μmol/L丙泊酚降低低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，提示丙泊酚保護(hù)PC12細(xì)胞免受低氧誘導(dǎo)的損傷。在腎缺血/再灌注損傷的小鼠模型中，丙泊酚可以減少細(xì)胞凋亡和cleaved caspase-3表達(dá)[7]。丙泊酚通過(guò)MALAT1/miR-182-5p/TLR4軸減少低氧/復(fù)氧的PC12細(xì)胞的凋亡[8]。

已經(jīng)證明氧化應(yīng)激在低氧誘導(dǎo)的損傷中起著至關(guān)重要的作用[9]。有報(bào)道，低氧可增加PC12細(xì)胞的ROS、MDA，但SOD和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)水平降低[10]。本研究結(jié)果與之前報(bào)告的結(jié)果一致，即低氧會(huì)導(dǎo)致PC12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。丙泊酚治療減輕缺血/再灌注導(dǎo)致的腸、肺形態(tài)學(xué)改變，并降低MDA水平和caspase-3表達(dá)，使SOD活性升高[11]。本研究中，5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，降低MDA水平，并恢復(fù)抗氧化酶SOD活性，表明丙泊酚可改善低氧引起的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

炎性反應(yīng)是低氧誘導(dǎo)損傷的另一重要促成因素，在腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中，丙泊酚減輕大鼠神經(jīng)元病理?yè)p傷，并降低IL-6及TNF-α水平[12]。本研究中，5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制低氧誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，表明丙泊酚可以改善低氧引起的PC12細(xì)胞炎性反應(yīng)。

本研究中，低氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-141-3p表達(dá)的增加，而5、10、20 μmol/L丙泊酚抑制miR-141-3p表達(dá)，因此推測(cè)丙泊酚調(diào)節(jié)低氧后的PC細(xì)胞功能可能與抑制miR-141-3p表達(dá)有關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病中，PC12細(xì)胞經(jīng)1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)后，miR-141-3p上調(diào)[13]。miR-141-3p以時(shí)間依賴(lài)性方式在中風(fēng)小鼠中上調(diào)，抑制miR-141-3p可改善死亡率、神經(jīng)功能缺損并減少梗塞體積[14]。以上說(shuō)明miR-141-3p參與神經(jīng)損傷性疾病，但miR-141-3p在低氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-141-3p可以導(dǎo)致MDA、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和細(xì)胞凋亡率增加，SOD活性降低，表明miR-141-3p能加劇低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。進(jìn)一步的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p可以逆轉(zhuǎn)丙泊酚對(duì)低氧處理的PC12凋亡，氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響。提示丙泊酚可以通過(guò)下調(diào)miR-141-3p的表達(dá)抑制低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

總之，丙泊酚可以通過(guò)抑制miR-141-3p的表達(dá)，減輕低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性損傷。