劉汝蘭，毛漢瀟，何淵民，譚自敏，熊霞，譚小琦

長波紫外線(ultraviolet A, UVA)是誘發(fā)多形性日光疹、慢性光化性皮炎、皮膚基底細胞癌等多種皮膚疾病的重要原因[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)UVA照射皮膚后可以引起表皮細胞和真皮細胞的一系列復雜反應。有學者[2-4]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)UVA可以通過上調胞內活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等誘導成纖維細胞凋亡，但具體環(huán)節(jié)及調控機制尚不完全清楚。細胞自噬是真核生物細胞一種保守的自我降解方式，對實現(xiàn)細胞代謝、更新細胞成分、維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要的意義。細胞自噬可以抑制細胞凋亡，促進細胞存活；也有研究表明細胞自噬也可以導致細胞凋亡[5]。目前細胞自噬在UVA誘導人真皮成纖維細胞凋亡過程中的作用尚不清楚，ROS與自噬之間的相互作用機制也未厘清。因此，本研究擬明確UVA誘導人皮膚成纖維細胞凋亡中細胞自噬及胞內ROS的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料 人皮膚成纖維細胞(human dermal fibroblasts, HDF)：來自健康男性包皮環(huán)切術時的包皮組織。主要試劑：胎牛血清購于巴西Bovogen公司；50 μmol/L3-甲基嘌呤(3-MA)、100 nmol/L雷帕霉素(RAPA)購于中國MCE公司；高糖DMEM、GlutaMAX、NEAA、0.25%胰酶購于美國Gibco公司；DMSO 購于中國碧云天生物技術公司；FITC Annexin V /PI Apoptosis Detection Kit購于美國BD公司；兔抗人p62多克隆抗體及兔抗人LC3多克隆抗體購于美國CST公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取健康男性包皮環(huán)切術時的包皮，參照文獻[6]分離培養(yǎng)HDF，培養(yǎng)至第3代凍存，根據(jù)實驗進程需求對HDF解凍復蘇，培養(yǎng)細胞至第6～8代用于實驗。

1.2.2建立不同劑量UVA照射人皮膚成纖維細胞的模型 顯微鏡下觀察到人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)至重懸細胞。調節(jié)重懸液的細胞密度約為1.5×105個/mL，均勻接種于6孔板中。待細胞鋪滿板底約80%時，6孔板盡快轉移至紫外線模擬器行UVA照射處理，照射結束后立即返回細胞培養(yǎng)工作臺，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。本實驗小組通過前期探索已成功構建出UVA誘導人皮膚成纖維細胞凋亡的適宜模型。設置階梯性變化不同的UVA照射劑量和照射后繼續(xù)培養(yǎng)時間，通過檢測細胞形態(tài)學變化、細胞活性和細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)UVA劑量增加至8 J/cm2時可同時滿足細胞凋亡率增加且細胞活性和細胞狀態(tài)良好。就繼續(xù)培養(yǎng)時間而言，當光照后繼續(xù)培養(yǎng)4 h時，細胞形態(tài)變化最大，4 h后形態(tài)趨于穩(wěn)定不變。故最終確定最佳照射劑量和時間，即細胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。

1.2.3細胞生長狀態(tài)檢測 細胞隨機分為對照組、UVA組、雷帕霉素(RAPA)組和3-甲基嘌呤(3-MA)組。RAPA組和3-MA組分別加入稀釋后的母液100 nmol/L和50 μmmol/L。除對照組外，其余各組以不同試劑預處理2 h后按UVA造模步驟用紫外線模擬器以8 J/cm2的UVA進行照光處理。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察RAPA組、3-MA組、UVA組和對照組的成纖維細胞生長狀態(tài)情況，并拍照做好記錄。

1.2.4細胞增殖活性檢測 加入MTT和DMSO在全自動酶標儀波長490 nm下測定各孔吸光度(OD值)。

1.2.5細胞凋亡率檢測 加入Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后在流式細胞儀上檢測經(jīng)過處理后細胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測 細胞按步驟接種于6孔板中。按實驗目的和實驗分組不同，分別予不同條件干預。干預后分別檢測p62、LC3蛋白的表達水平。

2 結果

2.1UVA照射對人皮膚成纖維細胞凋亡的影響 結果顯示：對照組(未予以UVA照射)、4、8、12、16 J/cm2組細胞凋亡的百分率分別為(5.22±0.4)%、(6.91±0.37)%、(14.43±3.01)%、(27.93±1.35)%和(32.12±1.65)%。除對照組與4 J/cm2組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余各組之間差異均有統(tǒng)計學意義 (F=106.61，P<0.01)。與對照組相比，當照射劑量≥8 J/cm2，隨著UVA劑量的增加，人皮膚成纖維細胞的增殖活性顯著下降，細胞凋亡率顯著增加，見圖1。隨著UVA劑量的增大，胞內顆粒增多，細胞碎裂更多，細胞回縮變圓，突起變短，細胞排列間隙增大，胞質折光性下降；當UVA的劑量為8 J/cm2時，細胞增殖活性>85%且細胞狀態(tài)良好；當UVA的劑量<8 J/cm2，細胞形態(tài)及數(shù)量變化不明顯；40 J/cm2已經(jīng)完全看不清細胞輪廓。成纖維細胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后的細胞形態(tài)變化較大；4 h之后，細胞維持一定形態(tài)，本實驗不同劑量UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后觀察相關指標，見圖2。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry;The activity of each group of fibroblasts by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate group圖1 UVA照射對人皮膚成纖維細胞凋亡的影響Fig.1 The effect of UVA irradiation on human fibroblasts apoptosis

2.2UVA致人皮膚成纖維細胞凋亡中細胞自噬的作用 采用RAPA、3-MA分別孵育細胞2 h，進行8 J/cm2UVA照射后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后在倒置相差顯微鏡下觀察到：RAPA組和UVA組細胞輪廓清晰，RAPA組細胞排列較UVA組更緊密，呈火焰狀，細胞形態(tài)變化不明顯，UVA組漂浮細胞較RAPA組多。3-MA組細胞內顆粒增多，漂浮細胞較UVA組多。細胞活性從高到低的順序依次是對照組、RAPA組、UVA組、3-MA組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=23.86，P<0.01)。細胞凋亡率從高到低的順序依次是3-MA組(20.45±2.14)%、UVA組(15.42±0.77)%、RAPA組(8.62±1.12)%、對照組(5.39±0.74)%，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=83.356，P<0.01)，見圖3～4。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The apoptosis of fibroblasts was detected by flow cytometry; The activity of HSF by MTT assay; Comparison of fibroblasts apoptosis rate圖3 UVA致人皮膚成纖維細胞凋亡中細胞自噬的作用Fig.3 The role of autophagy in UVA-induced human fibroblasts apoptosis

Control; UVA; RAPA; 3-MA圖4 改變自噬水平后成纖維細胞形態(tài)學的觀察 (×200)Fig.4 After UVA irradiation, the morphology of fibroblasts in control group,UVA group,RAPA group and 3-MA group (×200)

2.3UVA照射后人皮膚成纖維細胞內ROS水平變化 細胞經(jīng)8 J/cm2UVA照射后分別于1、2、3、4 h用流式細胞術檢測胞內ROS水平。與未經(jīng)光照組(即0 h組)相比，光照后繼續(xù)培養(yǎng)1 h檢測到的胞內ROS水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P=0.152)，2、3、4 h組的胞內ROS水平均升高，各組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=54.724，P<0.01)。且細胞在4 h內隨著繼續(xù)孵育時間的延長，ROS水平逐漸升高，見圖5。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.～ The level of ROS in fibroblasts was detected by flow cytometry; Changes of ROS level in fibroblasts at different time points after UVA irradiation圖5 UVA誘導人皮膚成纖維細胞內ROS水平的變化Fig.5 UVA-induced changes of intracellular ROS in fibroblasts

2.4UVA照射人皮膚成纖維細胞后ROS對細胞自噬的調控作用 Western blot檢測對照組、UVA組和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)處理組的LC3和p62的表達情況，結果顯示：LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62在三組中的相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=260.976、1 922.181，P<0.01)。與對照組相比，細胞經(jīng)UVA照射后LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高，p62表達降低。給予5 mmol/L抗氧化劑NAC預處理組的胞內LC3Ⅱ/Ⅰ比值雖較對照組高，但低于UVA處理組，且其p62的表達雖低于對照組但高于UVA處理組，見圖6。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01.The expression of p62 and LC3 in fibroblasts after different treatments;The expression of intracellular LC3Ⅱ/Ⅰ differences after different treatments; The expression of intracellular p62 differences after different treatments圖6 氧化應激對人皮膚成纖維細胞自噬的影響Fig.6 The effect of oxidative stress on human fibroblasts autophagy

3 討論

UVA照射可深達皮膚真皮層，給位于真皮層的成纖維細胞造成不同程度的損傷并可誘發(fā)細胞的自我防御與修復[7]。細胞自噬是真核生物細胞內一種關鍵的自我防御與修復過程。研究UVA對成纖維細胞凋亡和自噬的調節(jié)對減緩成纖維細胞的光損傷甚至逆轉細胞結局有重要價值。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)不同劑量UVA照射人皮膚成纖維細胞后，隨著UVA劑量的增加，對人皮膚成纖維細胞的損傷呈時間依賴性加重，UVA照射成纖維細胞后4 h的細胞形態(tài)變化較大，4 h之后，細胞卻維持一定形態(tài)。既往有研究[8]發(fā)現(xiàn)UVA誘導成纖維細胞凋亡是通過下調Bcl-2的表達和損傷DNA來實現(xiàn)的，此過程主要發(fā)生在紫外線照射后的4 h內[2]。Godar[9]將紫外線誘導細胞凋亡的機制分為立即或延遲，發(fā)現(xiàn)UVA致細胞凋亡為立即凋亡，UVB引起的是延遲凋亡。本課題在研究UVA致成纖維細胞凋亡的過程中，發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)變化明顯的時間也是4 h，選擇UVA處理后的時間和以往研究發(fā)現(xiàn)的UVA致細胞凋亡時間一致。

細胞自噬對細胞存在的“雙面效應”[10]。正常情況下細胞自噬維持在低水平，當胞外營養(yǎng)成分變化[11]、缺血缺氧[12]、生長因子濃度變化和胞內出現(xiàn)代謝壓力、細胞器損害和蛋白質折疊錯誤等情況時，自噬水平被上調以完成對錯誤的修正和適應環(huán)境的變化。當損傷超出細胞修正范圍時細胞自噬則對細胞起到促凋亡作用。在本研究中，從細胞形態(tài)學及凋亡檢測結果中，筆者發(fā)現(xiàn)RAPA組細胞排列較UVA組更緊密，呈火焰狀，細胞形態(tài)變化不明顯，UVA組漂浮細胞較RAPA組多。3-MA組細胞皺縮變圓，細胞間隙增寬，細胞折光性降低，漂浮細胞較UVA組多。UVA照射人皮膚成纖維細胞后細胞的凋亡率，RAPA組低，UVA組次之，3-MA組最高。由此可見，采用RAPA誘導細胞自噬水平上調可抑制UVA致人皮膚成纖維細胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬過程與胞內氧化應激之間關系十分密切。一方面，氧化應激是影響細胞自噬的重要因素。許多條件比如饑餓處理[13]或者細胞外營養(yǎng)物質(如葡萄糖、谷氨酰胺、丙氨酸和血清等)被剝奪[11]誘導的ROS升高可以上調細胞自噬水平[14-15]。另一方面，細胞自噬通過直接清除體內的受損線粒體并恢復部分抗氧化酶活性，或者通過間接調控多條抗氧化信號通路來降低胞內氧化水平。如Kim等[16]研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼可通過上調細胞自噬來減少過氧化氫誘導的角質形成細胞的氧化損害。盡管眾多研究[17-19]證實抗氧化劑的預處理的確可降低由刺激因子引起的細胞自噬，細胞自噬也通過去除氧化損傷分子和受損細胞器等途徑來降低細胞毒性[20]，但氧化應激與自噬之間的相互作用機制仍需進一步完善。本研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞經(jīng)UVA照射后，細胞內ROS的水平增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大，p62表達降低。給予5 mmol/L 抗氧化劑NAC處理成纖維細胞后，可顯著降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值，增加p62的表達。LC3Ⅱ/Ⅰ的比值變化及p62的表達情況常用以評估細胞自噬水平的變化，表明細胞內ROS水平的上調可促進細胞自噬產生。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)UVA照射人皮膚成纖維細胞可以促進細胞凋亡，同時UVA照射可以通過上調細胞內ROS水平誘導細胞自噬的產生，從而發(fā)揮其抗凋亡效應。