李得萍，何遠(yuǎn)秦，許丁帆，易元慧，董洪雨，劉艷軍

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392)

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)又稱黑節(jié)草，是一種重要的藥用草本植物，具有生津、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，近年愈發(fā)受保健品市場的喜歡[1-3]。鐵皮石斛種子細(xì)小，沒有胚乳，必須與真菌共生才能萌發(fā)，因此，自然繁殖率低[4-5]。早期一般通過扦插、分株的繁殖方式進(jìn)行鐵皮石斛的生產(chǎn)繁殖[6]，這些常規(guī)方式存在繁殖周期長、速度慢等問題，不能滿足生產(chǎn)中對(duì)鐵皮石斛種苗的大量需求。而通過組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行組培快繁可以極大的縮短繁殖時(shí)間，故使用組織培養(yǎng)技術(shù)來進(jìn)行工廠化育苗是解決繁殖率低的理想手段[7]。同時(shí)也可通過人工種子技術(shù)進(jìn)行鐵皮石斛的繁殖[8-9]。

鐵皮石斛組培中多采用種子播種[10-11]誘導(dǎo)原球莖進(jìn)行組培快繁，而本研究采用了誘導(dǎo)鐵皮石斛腋芽萌發(fā)的方法，通過不斷剪切帶芽莖段來進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根。與傳統(tǒng)的無菌播種快繁相比，本研究采用的方法有以下三點(diǎn)優(yōu)勢：首先是成苗的生長勢較強(qiáng)，腋芽直接再生要比從原球莖長出的芽生長勢強(qiáng)，可以直接用于生根，從而縮短了組培的時(shí)間；其次，腋芽萌發(fā)出來的芽的自然變異率要明顯低于原球莖，從而保障了再生苗的遺傳穩(wěn)定性，使得組培體系更穩(wěn)定；最后，此方式的成苗質(zhì)量高，獲得的再生苗在形態(tài)上與母本一樣，高度保持了母本的特性。而通過傳統(tǒng)方法以原球莖進(jìn)行再生的苗中畸形苗較多，需要長時(shí)間的培養(yǎng)才能變成正常苗，進(jìn)而影響鐵皮石斛的商品價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鐵皮石斛盆栽苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛外植體消毒

剪取長度為2～3 cm的鐵皮石斛嫩芽，用70%乙醇溶液浸泡30 s，無菌水沖洗30 s，再分別使用20%、30%、40%的次氯酸鈉水溶液消毒，消毒時(shí)間設(shè)置為5、10、15、20 min，消毒后無菌水沖洗3次，每次沖洗10 min。最后用無菌濾紙吸干外植體表面水分，將外植體接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS)上。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理接10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體。10 d后觀察并統(tǒng)計(jì)不同處理的外植體污染率、死亡率。

1.2.2 鐵皮石斛腋芽的誘導(dǎo)

將消毒處理后沒有污染、生長健壯的鐵皮石斛莖段外植體接種到含有不同激素的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)莖段腋芽萌發(fā)。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度細(xì)胞分裂素(BA)、激動(dòng)素(KT)和萘乙酸(NAA)，6種培養(yǎng)基分別為：①1.0 mg·L-1BA；②1.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；③2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA；④1.0 mg·L-1KT；⑤1.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA；⑥2.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1NAA。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次。接種后每3 d觀察1次，40 d后統(tǒng)計(jì)平均每個(gè)側(cè)芽誘導(dǎo)系數(shù)與再生芽生長情況。

1.2.3 鐵皮石斛腋芽增殖培養(yǎng)

將鐵皮石斛莖段上誘導(dǎo)出的腋芽接種到含不同激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度分裂素BA和生長素NAA、吲哚丁酸(IBA)，6種培養(yǎng)基分別為：①0.5 mg·L-1IBA；②0.5 mg·L-1IBA+1 mg·L-1BA；③1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA；④0.5 mg·L-1NAA；⑤0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA；⑥1 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1BA。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后每3 d觀察1次，經(jīng)過40 d后觀察并統(tǒng)計(jì)平均每個(gè)側(cè)芽增殖系數(shù)與叢生芽生長情況。

1.2.4 鐵皮石斛的生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)中萌發(fā)的腋芽長到3～5 cm高時(shí)剪下，一部分繼續(xù)用于增殖培養(yǎng)，另一部分進(jìn)行生根培養(yǎng)。將用于生根培養(yǎng)的小苗接種到含有不同生長素的生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同種類和不同濃度的生長素IAA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)和NAA(0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)6次。接種后每5 d觀察1次，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)植株平均生根數(shù)、平均根長和生根質(zhì)量以及植株生長情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均采用5.5 g·L-1瓊脂粉，30 g·L-1蔗糖，pH 5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，連續(xù)照明。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方法

腋芽誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)形成的腋芽數(shù)/接種莖段數(shù)；

增殖系數(shù)=有效芽數(shù)/接種外植體數(shù)(有效芽為芽高≥1 cm的芽)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理方法對(duì)外植體消毒效果的影響

由表1可知，不同濃度的消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果不同。在20%次氯酸鈉消毒液作用下，外植體污染率一直是處于很高的水平，說明在低濃度消毒液下微生物基本不受影響，即使延長作用時(shí)間，也不能殺死植株體內(nèi)的微生物。從外植體生長來看，在低濃度的消毒液作用下除了被微生物侵染造成的生長影響外，外植體沒有出現(xiàn)受消毒液影響而褐變死亡的現(xiàn)象；在高濃度40%的次氯酸鈉作用下，微生物幾乎全被殺死，只有在消毒時(shí)間為5 min時(shí)有少數(shù)外植體出現(xiàn)污染現(xiàn)象，可能是由于消毒時(shí)間過短引起的，這說明在此濃度下，微生物不能夠生存，但同時(shí)在這種較高濃度的消毒液水平下，幾乎所有外植體都出現(xiàn)了褐變死亡現(xiàn)象，說明在高濃度的消毒液作用下植物材料不能夠正常生長；當(dāng)采用30%次氯酸鈉消毒時(shí)間為10 min時(shí)，外植體污染率6%，死亡率0，在外植體污染率較低的前提下也能保證外植體的存活，消毒效果較好。綜合考慮，最適的鐵皮石斛莖段外植體消毒方法為：使用30%次氯酸鈉水溶液，消毒10 min。

表1 不同消毒處理方法對(duì)鐵皮石斛外植體消毒效果的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

由表2可知，采用不同激素的培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛莖段腋芽誘導(dǎo)的情況差異明顯。在單獨(dú)使用BA或KT時(shí)，雖然都能誘導(dǎo)出腋芽，但芽細(xì)弱、顏色淡綠，說明再生芽內(nèi)源生長素含量較低，需要在培養(yǎng)基中添加外源激素；當(dāng)添加NAA后，再生芽健壯，且誘導(dǎo)率高于單獨(dú)添加分裂素BA或KT；當(dāng)使用KT作為分裂素時(shí)，誘導(dǎo)出的芽細(xì)弱，誘導(dǎo)率不高，同時(shí)隨著KT濃度的增加，再生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，說明KT不適宜鐵皮石斛的生長。使用BA作為分裂素時(shí)，誘導(dǎo)出的再生芽生長正常，生長速度快，隨著BA濃度的增加，誘導(dǎo)率也增大，當(dāng)BA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，再生芽生長快且健壯，誘導(dǎo)率5.6。因此，選擇MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA作為鐵皮石斛莖段誘導(dǎo)腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛莖段腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

由表3可知，不同激素的培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖情況差異明顯。在單獨(dú)使用生長素IBA或NAA時(shí)，雖然都有一定的增殖，但增殖率不高，且叢生芽生長緩慢，說明叢生芽內(nèi)源激素含量較低，需要在培養(yǎng)基中添加外源激素；添加BA后增殖系數(shù)高于單獨(dú)使用IBA或NAA；當(dāng)使用IBA作為分裂素時(shí)，增殖出的芽生長緩慢，再生芽長勢弱，同時(shí)加入BA后再生芽的長勢稍好，但生長也緩慢，說明IBA不適宜鐵皮石斛生長；當(dāng)使用NAA作為分裂素時(shí)，再生芽芽勢正常，且生長快，生長素與分裂素比例為1/2時(shí)更利于鐵皮石斛的生長，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg·L-1、BA濃度為1 mg·L-1時(shí)再生芽長勢健壯、生長快，增殖系數(shù)3.8。因此，最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1NAA+1 mg·L-1BA。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

2.4 不同生長素對(duì)鐵皮石斛組培苗生根生長的影響

由表4可知，在不同的培養(yǎng)基中鐵皮石斛組培苗生根數(shù)量、長度及生根質(zhì)量明顯不同。在使用IAA作為生根誘導(dǎo)激素時(shí)，生根數(shù)量較少，根長較短，且誘導(dǎo)出的再生根基本都是短粗、生長緩慢的肉質(zhì)根，不具有根的功能，移栽時(shí)不易成活；在使用NAA作為生根誘導(dǎo)激素時(shí)，誘導(dǎo)出的根生長迅速，平均根長明顯長于IAA誘導(dǎo)出的根長，同時(shí)誘導(dǎo)出的均為生長正常的根，具有主動(dòng)吸收功能，可以進(jìn)行直接移栽。當(dāng)NAA的用量為0.5 mg·L-1時(shí)，平均生根數(shù)為7.3條，平均根長達(dá)5.8 cm，且都為生長快的正常根。當(dāng)繼續(xù)增加NAA的用量時(shí)，再生出的根生長速度有一定的下降，且在個(gè)別植株上出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象，說明高濃度的NAA開始對(duì)組培苗產(chǎn)生毒害作用。綜上所述，最佳的鐵皮石斛組培苗生根培養(yǎng)基配方是：MS+0.5 mg·L-1NAA。

表4 不同激素對(duì)鐵皮石斛組培苗生根的影響

3 討論

鐵皮石斛再生植株具有多種獲取途徑，常用的方式是使用鐵皮石斛種子進(jìn)行無菌播種形成原球莖，再通過原球莖增殖分化發(fā)育成完整再生植株[12]；也可以通過誘導(dǎo)莖段、莖尖、幼芽或葉片等外植體形成叢生芽來獲取再生植株[13]。本試驗(yàn)采用后者，以莖段為外植體，建立了一套完整的誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)、增殖、生根培養(yǎng)快繁體系。

鐵皮石斛使用工廠化生產(chǎn)育苗，可以在一定時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量整齊度良好的瓶苗[14]。在工廠化育苗中，使用種子擴(kuò)繁要優(yōu)于莖段，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在起始階段的種子外植體感染率較低，且種子的增殖系數(shù)顯著高于莖段等。但誘導(dǎo)種子萌發(fā)、誘導(dǎo)原球莖所需的周期較長，且因種子是通過雜交授粉得到的，其遺傳性不穩(wěn)定，由種子再生的植株經(jīng)過多次繼代受環(huán)境以及添加的外源激素的影響易改變其原有的性狀，進(jìn)而出現(xiàn)性狀分離的現(xiàn)象。以莖段為外植體進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)增殖出來的植株其遺傳穩(wěn)定性高，能較好地保持原有親本植株的性狀[15]。

本試驗(yàn)選用30%次氯酸鈉來對(duì)莖段進(jìn)行外植體消毒，消毒10 min外植體污染率為6%，死亡率為0，消毒效果高于其他濃度的次氯酸鈉以及HgCl2等常用消毒液[16-17]；誘導(dǎo)莖段腋芽萌發(fā)階段可以通過采用添加一些外源激素來加快其增殖和生長，本試驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA，誘導(dǎo)系數(shù)5.6，再生芽生長快且健壯，增殖階段采用生長素與分裂數(shù)比例為1/2時(shí)更適宜鐵皮石斛的生長，叢生芽生長健壯、增殖率高，本試驗(yàn)增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA，增殖率3.8。綜上所述，本研究以莖段為外植體，優(yōu)化了鐵皮石斛組培快繁體系，使用莖段誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)增殖的方法可以成為一種穩(wěn)定繁殖優(yōu)株的途徑，為鐵皮石斛繁育和優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。