胡重九，程麗敏，沈志浩，朱波*

(1.杭州茉鋇特生物科技有限公司，浙江 臨安 311300；2.杭州市臨安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 臨安 311399；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)為菊科蒼術(shù)屬植物，根莖入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主風(fēng)寒濕痹，死肌痙疸[1]。白術(shù)是浙江省道地藥材，為“浙八味”之一，作為補(bǔ)脾益氣藥被廣泛使用，有“十方九用”之稱(chēng)。白術(shù)性溫、味甘、苦，有健脾益氣、止汗、安胎、燥濕利水等功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)具有抗衰老、抗菌、利尿、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[3]，并對(duì)肝臟、食管、直腸等消化系統(tǒng)癌癥也有一定程度的療效[4-5]。

根腐病是白術(shù)等根莖類(lèi)藥材大田栽培主要的病害之一，為土傳性病害，通常是多種致病菌復(fù)合侵染引起的真菌性病害。現(xiàn)有研究表明，白術(shù)根腐病主要的致病菌有尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、燕麥鐮孢菌(Fusariumorenaceum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)、半裸鐮孢菌(Fusariumincaruatum)以及立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等。作為一種維管束系統(tǒng)的病害，白術(shù)根腐病發(fā)病時(shí)受害根部首先呈黃褐色，隨時(shí)間推移逐漸變黑而干枯。當(dāng)病害進(jìn)一步發(fā)展蔓延到根莖部位后，橫切根莖可看見(jiàn)維管束呈點(diǎn)狀褐色病斑，并繼續(xù)向上部莖稈蔓延，隨后根莖部的須狀根逐漸干枯脫落，根莖變軟失去藥用價(jià)值，外皮皺縮呈干腐狀，最終導(dǎo)致植株死亡，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[6]。

白術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中多采用無(wú)性繁殖，但是無(wú)性繁殖具有種芽退化、育種障礙等問(wèn)題，我們以白術(shù)種子為試驗(yàn)材料，探討了不同基質(zhì)對(duì)白術(shù)種子發(fā)芽率的影響。針對(duì)鮮有對(duì)白術(shù)根腐病模型構(gòu)建的報(bào)道，本文以腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌為白術(shù)病原菌，考察不同創(chuàng)傷方式(劃傷、刺傷)、菌種類(lèi)型(單一菌種、混合菌種)、接種方式(灌根、浸根)等對(duì)白術(shù)根腐病模型的影響，擬探討穩(wěn)定的白術(shù)發(fā)芽技術(shù)與根腐病模型，為白術(shù)優(yōu)良品種選育及根腐病防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白術(shù)種子

從浙江磐安的成熟健康白術(shù)植株上采集成熟種子，將種子曬干裝袋后在陰涼干燥避光的玻璃干燥器內(nèi)保存，挑選顆粒飽滿(mǎn)且無(wú)發(fā)黑霉變的白術(shù)種子，備用。

1.2 種子催芽試驗(yàn)

選取120枚種子，用純水洗凈，經(jīng)75%乙醇浸泡5 min后，隨機(jī)均分為4組，每組30枚。分別放入4個(gè)同樣大小的玻璃皿內(nèi)，分別用泥土、營(yíng)養(yǎng)土、濾紙、紗布包裹種子，噴適量無(wú)菌水保濕，27 ℃條件下暗培養(yǎng)。觀察記錄種子發(fā)芽生長(zhǎng)情況，以胚根生長(zhǎng)超過(guò)2 cm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，持續(xù)觀察10 d。

1.3 白術(shù)幼苗的培養(yǎng)

當(dāng)白術(shù)種子發(fā)芽生根至3～5 cm時(shí)，用鑷子將種子淺播在鋪滿(mǎn)營(yíng)養(yǎng)土的塑料盆穴中，噴灑少量純水，保持基質(zhì)濕潤(rùn)。將播種好的白術(shù)苗盆穴四周用支架撐起，套以滅菌袋并封口，保持袋內(nèi)空間，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，培養(yǎng)7～10 d。

1.4 病原菌孢子懸浮液的制備

從保存試管中挑取3種白術(shù)根腐病病原菌(腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌，分別依次簡(jiǎn)稱(chēng)為FS、FO、FI)，分別接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，在培養(yǎng)基表面滴加無(wú)菌水，用刮刀刮下表面菌絲，紗布過(guò)濾。顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板確認(rèn)孢子濃度，用無(wú)菌水稀釋調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1×107個(gè)·mL-1，即得FO、FI、FS病原菌的孢子懸浮液。取3種病原菌的孢子懸浮液適量且等體積混合，加無(wú)菌水稀釋調(diào)節(jié)同等濃度，得混合菌液。

1.5 創(chuàng)傷處理

選取24株生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)一致(株高為4～5 cm)的白術(shù)幼苗，隨機(jī)均分為2組，每組12株。分別對(duì)其進(jìn)行針刺(用針刺穿根部)與劃傷(用手術(shù)刀劃出深約0.2 mm的傷口)處理，栽種于穴盆后，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，每隔2 d觀察1次，記錄幼苗死亡率，觀察10 d。

1.6 病原菌侵染

選取120株白術(shù)幼苗隨機(jī)均分為12組，每組10株，進(jìn)行侵染試驗(yàn)：分別為浸根處理(4組)，將4組幼苗用手術(shù)刀劃傷根莖后，分別在200 mL尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、半裸鐮刀菌以及混合菌的孢子懸浮液中浸泡5 min；灌根處理(4組)，將幼苗劃傷后，分別用5 mL尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、半裸鐮刀菌、混合菌的孢子懸浮液澆灌根部；劃傷對(duì)照(2組)，第1組將幼苗手術(shù)刀劃傷根莖后，在無(wú)菌水中浸泡5 min，第2組將幼苗手術(shù)刀劃傷根莖后，用5 mL無(wú)菌水澆灌根部；不劃傷對(duì)照(2組)，第1組將健康幼苗在無(wú)菌水中浸泡5 min，第2組將健康幼苗用5 mL無(wú)菌水澆灌根部。以上所有幼苗處理后，均栽種于營(yíng)養(yǎng)土穴盆，置于生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為27 ℃，光照10 h·d-1，觀察25 d。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 23.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對(duì)白術(shù)種子發(fā)芽率的影響

不同基質(zhì)顯著影響白術(shù)種子發(fā)芽率，其中紗布條件下發(fā)芽率最高，10 d發(fā)芽率可達(dá)96.3%，營(yíng)養(yǎng)土與濾紙發(fā)芽率其次，10 d發(fā)芽率分別為40.0%與33.3%，而白術(shù)在泥土中不能發(fā)芽(表1)。可能是因?yàn)榧啿纪笟庑院?，保濕能力?qiáng)且比較柔軟，能與種子充分接觸，所以發(fā)芽率明顯提高且發(fā)芽時(shí)間短；營(yíng)養(yǎng)土透氣性較好但是保濕能力不佳，濾紙保濕效果差，濕度不易控制，導(dǎo)致白術(shù)發(fā)芽率較低；泥土可能由于透氣性差，易結(jié)塊，導(dǎo)致白術(shù)種子無(wú)法發(fā)芽。因此，紗布保濕培養(yǎng)催芽是白術(shù)種子萌芽的最佳方式。

表1 不同基質(zhì)條件下白術(shù)種子發(fā)芽率

2.2 創(chuàng)傷處理對(duì)白術(shù)幼苗死亡率的影響

單一劃傷與刺傷處理對(duì)白術(shù)幼苗均有一定影響，針刺處理影響大于劃傷處理，6 d時(shí)劃傷與針刺均出現(xiàn)幼苗死亡，劃傷處理的白術(shù)幼苗死亡率為8.3%，針刺處理的白術(shù)幼苗死亡率為22.2%。結(jié)果表明，劃傷較針刺死亡率低，可用于白術(shù)根腐病模型構(gòu)建。

2.3 不同菌液與施用方式對(duì)白術(shù)幼苗死亡率的影響

不同菌液與施用方式影響白術(shù)幼苗死亡率。從施用方式看，F(xiàn)O、FI以及混合菌處理下，灌根處理較浸根處理發(fā)病率高，而腐皮鐮刀菌FS菌液處理下，7 d后浸根處理發(fā)病率高于灌根處理(表2)。從不同菌液處理看，腐皮鐮刀菌FS孢子懸浮液浸根處理下，白術(shù)幼苗發(fā)病最快，死亡率最高，7 d死亡率達(dá)90%，10 d幼苗全部死亡；混合菌浸根處理白術(shù)幼苗發(fā)病最慢，接種25 d，發(fā)病率僅為60%。

表2 不同菌液浸根與灌根處理對(duì)白術(shù)幼苗死亡率的影響 單位：%

3 討論

植物種子的萌發(fā)受諸多因素影響，不僅與種子的成熟度、含水量、種內(nèi)抑制物質(zhì)等內(nèi)部因素有關(guān)，而且與溫度、水分、光照、濕度等外部環(huán)境條件密切相關(guān)[7]。目前，已有諸多學(xué)者對(duì)于植物種子發(fā)芽關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了探討。如蔣菡[8]曾報(bào)道紙床和沙床對(duì)水稻種子形成幼苗的影響，試驗(yàn)表明，紙床上的水稻種子發(fā)芽快，沙床發(fā)出的水稻幼苗壯實(shí)。杜世超等[9]以黑龍江北部麥區(qū)的主栽品種龍麥35為試驗(yàn)材料，分別設(shè)定3個(gè)水平的溫度(15、20、25 ℃)和相對(duì)濕度(80%、85%、90%)，分析了不同溫、濕度處理對(duì)成熟期小麥的穗發(fā)芽開(kāi)始時(shí)間、穗發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、整穗水分變化率和千粒重等指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)15 ℃、濕度90%處理可以顯著加快成熟期春小麥的整穗水分變化、促進(jìn)穗發(fā)芽進(jìn)程，提高穗發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)。姜黎等[10]以荒漠植物野榆錢(qián)菠菜為材料，研究其發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)對(duì)不同溫度下模擬干旱脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)溫度與干旱及其交互作用對(duì)野榆錢(qián)菠菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽速率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均有顯著影響，推斷25 ℃/10 ℃為野榆錢(qián)菠菜種子發(fā)芽最適宜的溫度，與芽長(zhǎng)相比，根長(zhǎng)更適合作為反映野榆錢(qián)菠菜耐旱能力的指標(biāo)。發(fā)芽率是種子質(zhì)量檢驗(yàn)的4項(xiàng)必檢項(xiàng)目之一，是指在規(guī)定的條件和時(shí)間內(nèi)，長(zhǎng)出的正常幼苗數(shù)占供檢種子數(shù)的百分率[11-12]。本試驗(yàn)考察了不同基質(zhì)對(duì)白術(shù)種子發(fā)芽率的影響，發(fā)現(xiàn)泥土透氣性差，澆水后易板結(jié)，不利于白術(shù)種子萌發(fā)；營(yíng)養(yǎng)土和濾紙透氣性較好但保濕能力較弱，影響白術(shù)種子發(fā)芽；紗布透氣性好，有一定吸水性能，能確保體系內(nèi)水分相對(duì)均勻并保持濕度，白術(shù)種子發(fā)芽率較高，發(fā)芽速率較快。

根腐病作為針對(duì)植物維管束系統(tǒng)進(jìn)行破壞的一種土傳性病害，被認(rèn)為是白術(shù)產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的主要制約因素之一，由于其能在土壤中長(zhǎng)期潛伏，且主要為害根莖，嚴(yán)重影響白術(shù)產(chǎn)量與品質(zhì)[13-14]。白術(shù)根腐病的病原菌能以厚垣孢子的形態(tài)在土壤中過(guò)冬并存活較長(zhǎng)時(shí)間，根腐病的防治較為困難。在室內(nèi)條件下，建立白術(shù)根腐病模型，可為白術(shù)根腐病防治研究提供模型平臺(tái)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，將白術(shù)幼苗劃傷后，用20 mL濃度為1×107個(gè)·mL-1的腐皮鐮刀菌孢子懸浮液浸泡根部5 min，取出，用濾紙吸干多余菌液移栽到新的營(yíng)養(yǎng)土塑料盆穴內(nèi)，每日補(bǔ)充水分保證營(yíng)養(yǎng)土濕潤(rùn)，即可得到白術(shù)根腐病模型。

植物病害的生物防治相比農(nóng)業(yè)綜合防治、化學(xué)物理防治，具有高效、綠色、不易復(fù)發(fā)等優(yōu)點(diǎn)。將生物防治技術(shù)合理有效地應(yīng)用到中藥材生產(chǎn)領(lǐng)域中，避免了對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染，減少農(nóng)藥施用量，保證藥材安全。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，微生物農(nóng)藥是一種生物源農(nóng)藥。微生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥最大不同之處就是前者主要基于生物與生物之間的生存關(guān)系來(lái)開(kāi)展病蟲(chóng)害防治，穩(wěn)定性突出，長(zhǎng)期應(yīng)用微生物農(nóng)藥，能夠有效避免害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性。微生物農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染較小，同時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生任何的農(nóng)藥殘留。較為常見(jiàn)的微生物農(nóng)藥為蘇云金芽孢桿菌，此類(lèi)菌為抗蟲(chóng)棉花菌類(lèi)，主要采用人工方式對(duì)此類(lèi)細(xì)菌進(jìn)行提取并轉(zhuǎn)移到普通棉花上，促使普通棉花分泌出可以消滅害蟲(chóng)的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病蟲(chóng)害的有效防治[15-17]。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)對(duì)建立的根腐病模型物理?xiàng)l件，如溫度、土壤濕度、pH等進(jìn)行綜合考量，在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展植物生防菌篩選試驗(yàn)，為白術(shù)根腐病的生物防治提供試驗(yàn)依據(jù)，也為其他藥用植物土傳性病害防治提供借鑒。