李東偉，依馬木買買提江·阿布拉，李海軍，周婧博，張 波

(1.深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)羅湖區(qū)人民醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，新疆 烏魯木齊 830006)

胰腺癌的發(fā)病率在全球范圍呈逐年上升趨勢(shì)[1]，但早期診斷困難，確診時(shí)往往已到中晚期，手術(shù)切除術(shù)率很低，放化療后仍容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。而隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3]。Mazur等[4]發(fā)現(xiàn)，選擇性阻斷Notch2而非Notch1可以使胰腺癌演變進(jìn)程停止，延長(zhǎng)生存期。因此，本研究從轉(zhuǎn)錄、翻譯兩個(gè)水平檢測(cè)Notch2的表達(dá)情況及其與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，以期探索胰腺癌發(fā)生發(fā)展新的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2015年2月～2017年2月胰十二指腸手術(shù)標(biāo)本48例，術(shù)后經(jīng)病理確診全部為胰腺導(dǎo)管腺癌患者，手術(shù)后即刻切取胰腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織(距癌3 cm組織)，置液氮貯存。48例患者術(shù)前均未經(jīng)放化療，33～80歲，平均58.3歲，其中男28例，女20例。病理檢查：其中中高分化癌21例，低分化癌27例；腫瘤直徑≤2 cm 23例，>2 cm 25例；胰腺癌分期(AJCC，第8版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期和Ⅱ期20例，Ⅲ期和Ⅳ期28例；浸潤(rùn)深度T1～T2期22例，T3～T4期26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；CA19-9>34 U/ml 25例,CA19-9≤34 U/ml23例。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Sufu表達(dá)：按30 mg新鮮胰腺組織加入1 ml的Trizol試劑提取組織總RNA，然后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA樣品的純度和濃度，按照兩步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。Notch2引物：上游5′-CAACCCCAGATAGGAAGCAG-3′，下游5′-GAGCCTTTTCCCCATATTCC-3′，擴(kuò)增片段102 bp；β-actin引物，上游5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′,下游5′-CGTCATAC TCCTGCTTGCTG-3′，擴(kuò)增片段543 bp。引物均由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，接著94℃變性30 s、退火30 s，然后72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸2 min。退火溫度分別為57℃、56℃。所得PCR終產(chǎn)物10 μl用2%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，后用Image Lab 4.0軟件分析結(jié)果。測(cè)定目的基因Notch2擴(kuò)增條帶與內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增條帶的光密度比值，以此作為Notch2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2采用Western印跡檢測(cè)Notch2蛋白表達(dá)：新鮮胰腺組織加入蛋白質(zhì)裂解液后冰上研磨提取組織總蛋白，所用一抗、二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品，用100 V恒壓SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液室溫下封閉PVDF膜1 h，分別加入Notch2兔抗人抗體(1∶300)、β-actin兔抗人抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，用1×TBST漂洗，分別于相應(yīng)的二抗孵育30 min后洗膜。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，用Bio-Rad Chemi DOC MP全能型成像系統(tǒng)拍照，并用Image Lab 4.0軟件分析。測(cè)定目的基因Notch2蛋白條帶與內(nèi)參基因β-actin蛋白條帶的光密度比值，以此作為Notch2基因蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：胰腺癌組織中Notch2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.713±0.032，胰腺癌旁組織中Notch2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.312±0.026，胰腺癌組織中Notch2 mRNA的表達(dá)量是胰腺癌旁組織的(2.285±0.294)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

注：1,2,3為胰腺癌組織;4,5,6為胰腺癌旁組織

2.2Western印跡檢測(cè)結(jié)果：胰腺癌組織中Notch2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.621±0.047，胰腺癌旁組織中Notch2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.297±0.052，胰腺癌組織中Notch2蛋白的表達(dá)量是胰腺癌旁組織的(2.091±0.169)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 Notch2 mRNA和蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織平均表達(dá)水平差異

注：1,2為胰腺癌組織;3,4為胰腺癌旁組織

2.3胰腺癌組織中Notch2 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：低分化胰腺癌Notch2 mRNA平均表達(dá)水平(0.853±0.061)高于中高分化胰腺癌(0.578±0.029)，Notch2 mRNA在Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌組平均表達(dá)水平(0.876±0.043)高于Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌組(0.532±0.037)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Notch2 mRNA表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度和TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA19-9無(wú)明顯相關(guān)。見表2。

2.4胰腺癌組織中Notch2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：低分化胰腺癌Notch2 蛋白平均表達(dá)水平(0.738±0.038)高于中高分化胰腺癌(0.509±0.052)，Notch2 蛋白在Ⅲ期、Ⅳ期胰腺癌組平均表達(dá)水平(0.783±0.054)高于Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌組(0.413±0.035)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Notch2 蛋白表達(dá)水平與胰腺癌的分化程度和TNM分期明顯相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA19-9無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 胰腺癌組織 Notch2 mRNA和蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Notch信號(hào)通路普遍存在于各種生命體中，不僅決定細(xì)胞命運(yùn)、胚胎、個(gè)體發(fā)育及成體微環(huán)境穩(wěn)定，而且參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3,6]。在胰腺發(fā)育過(guò)程中有四種Notch基因表達(dá)，其中Notch2在胰芽分支和導(dǎo)管發(fā)生時(shí)，局限表達(dá)于胰腺胚胎導(dǎo)管細(xì)胞，所以推測(cè)Notch2是胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[7-8]。Mazur等[4]研究Kras小鼠發(fā)現(xiàn)，在胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanINs)進(jìn)展過(guò)程中，Notch1在胰腺腺泡細(xì)胞呈高表達(dá)，Notch2在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞呈高表達(dá)，進(jìn)一步采用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)PanINs進(jìn)展延緩，提示Notch信號(hào)通路在調(diào)控PanINs進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

本研究RT-PCR和Western印跡檢測(cè)結(jié)果均顯示：胰腺癌組織中Notch2 mRNA和蛋白表達(dá)均高于癌旁組織。胰腺癌組織中Notch2 mRNA和蛋白表達(dá)與胰腺癌的分化程度和TNM分期明顯相關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA19-9無(wú)明顯相關(guān)。

綜上所述，Notch信號(hào)通路中Notch2基因在胰腺癌組織中高表達(dá)，且該基因表達(dá)量與胰腺癌的分化程度和TNM分期有關(guān)，表明Notch信號(hào)通路參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究Notch2在胰腺癌中如何表達(dá)調(diào)控，將有助于闡明胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。