張迪，王應輝，薛瑾，陳應強

1 貴州醫(yī)科大學感染科教研室，貴陽 550004；2 黔南州人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科；3 貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院感染科

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，其主要病理改變是細胞外基質（ECM）大量形成并在肝臟內沉積［1-2］。肝星狀細胞是ECM的主要來源。正常情況下，肝星狀細胞處于靜止狀態(tài)，不合成或合成少量ECM。當肝星狀細胞被激活后可轉化為肌成纖維細胞樣細胞，從而大量合成ECM［3］。目前，肝纖維化的具體發(fā)病機制尚未完全闡明。NF-κB信號通路是一條至關重要的炎癥信號通路。有研究表明，阻斷NF-κB 信號通路可減少下游炎癥因子釋放，抑制肝星狀細胞激活，減少ECM合成和沉積，從而抑制肝纖維化［4］。都勻毛尖茶是我國的十大名茶之一，含有豐富的蛋白質、氨基酸、生物堿、茶多酚等物質。其中，茶多酚的含量約占17%［5］。有研究報道，茶多酚可降低血漿和肝臟組織炎癥因子水平，提高肝臟的抗炎能力［6］。2021年1月—2022年1月，本研究探討了都勻毛尖茶浸提液對人肝星狀細胞增殖的影響及其機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細胞株LX-2，購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。特級都勻毛尖茶，購自貴州省黔南州梅淵商貿有限公司。水飛薊賓，購自北京索萊寶科技有限公司。所有引物序列購自美國Thermo Fisher Scientific公司。iMARKTM酶標儀，購自美國Bio-Rad 公司；Veriti PCR 儀，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)，購自上海勤翔科學儀器有限公司。CCK-8 試劑盒，購自北京博奧森生物技術有限公司；總RNA 提取試劑盒，購自美國OMEGA 公司；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，購自上海翊圣生物科技有限公司；Western 一抗、二抗稀釋液，購自上海碧云天生物科技有限公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα 一抗，購自美國CST 公司；IL-6、COX-2 一抗，購自武漢三鷹生物技術有限公司；TNF-α 一抗，購自美國Affinity公司；GAPDH 單克隆抗體，購自杭州賢至生物科技有限公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗，購自武漢普美克生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將LX-2 細胞接種于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞貼壁生長達80%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取傳6代、對數生長期、生長狀態(tài)良好的LX-2細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 都勻毛尖茶浸提液制備 取特級都勻毛尖茶10 g，研磨后加入無水乙醇和去離子水混合液（體積比2∶1）150 mL，63 ℃水浴超聲30 min，過濾去渣，獲得都勻毛尖茶浸提液原液。將都勻毛尖茶浸提液原液置于旋轉蒸發(fā)儀真空泵中，50 ℃蒸發(fā)無水乙醇，65 ℃蒸發(fā)剩余水分，獲得都勻毛尖茶干粉約5 g，用時經0.22 μm微孔過濾器過濾除菌后稀釋至相應濃度。1.4 LX-2 細胞活性檢測 采用CCK-8 法。取傳6代、對數生長期、生長狀態(tài)良好的LX-2細胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁生長至80%融合時，分別加入5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL都勻毛尖茶浸提液10 μL，另設空白對照孔和陰性對照孔，每個濃度設6 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，按公式計算細胞活性。細胞活性=（實驗孔OD450值-空白對照孔OD450值）/（陰性對照孔OD450值-空白對照孔OD450值）×100%。計算LX-2 細胞半數抑制活性（IC50）時都勻毛尖茶浸提液濃度，選擇低于LX-2 細胞IC50時都勻毛尖茶浸提液濃度進行后續(xù)實驗。

1.5 細胞分組干預 取傳6 代、對數生長期、生長狀態(tài)良好的LX-2 細胞，隨機分為空白對照組、模型組以及茶浸提液低、中、高濃度組和陽性對照組。空白對照組不予任何處理，常規(guī)培養(yǎng)26 h；模型組予0.5 μg/mL 脂多糖（LPS）預處理2 h 后常規(guī)培養(yǎng)24 h；茶浸提液低、中、高濃度組予0.5 μg/mL LPS 預處理2 h 后分別加入低、中、高濃度都勻毛尖茶浸提液處理24 h；陽性對照組予0.5 μg/mL LPS 預處理2 h 后加入5 μmol/L 水飛薊賓處理24 h。

1.6 炎癥因子基因表達檢測 采用RT-qPCR 法。收集各組干預后LX-2 細胞，按總RNA 提取試劑盒說明提取細胞總RNA，經NanoDrop 2000 超微量分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，按Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 說明進行PCR 擴增。引物序列：IL-6 上游引物5′-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3′、下游引物5′-GGCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3′，TNF-α 上游引物5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物5′-GCTTGAGGGTTTGCTACAACA-3′，COX-2 上游引物5′-TTCCAATCCATGTCAAAACCGT-3′、下游引物5′-AGTCCGGGTACAGTCACACTT-3′，GAPDH 上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′、下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR 反應體系共20 μL：Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O 5.2 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共40 個循環(huán)。PCR 反應結束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.7 炎癥因子及NF-κB信號通路蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集各組干預后LX-2 細胞，加入含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。然后加入蛋白上樣緩沖液，置于金屬恒溫孵育器100 ℃加熱變性10 min。取部分變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、顯影。采用一體式化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料經正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 都勻毛尖茶浸提液濃度篩選 0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預24 h，LX-2 細胞活性分別為0.854 ± 0.112、0.839 ±0.075、0.803 ± 0.072、0.762 ± 0.049、0.727 ±0.016、0.673 ± 0.016、0.603 ± 0.041、0.501 ±0.009、0.306 ± 0.025。都勻毛尖茶浸提液呈濃度依賴性抑制LX-2 細胞活性（F=60.160，P＜0.01）。5、10、20 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預時LX-2 細胞活性雖然呈下降趨勢，但與0 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預時比較P均＞0.05；而40、80、160、320、640 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預時LX-2 細胞活性明顯下降，與0 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液干預時比較P均＜0.05。通過GraphPad Prism 8.0 軟件計算，LX-2 細胞IC50時都勻毛尖茶浸提液濃度為170.9 μg/mL。因此，選擇40、80、160 μg/mL 都勻毛尖茶浸提液分別作為茶浸提液低、中、高濃度組進行后續(xù)實驗。

2.2 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達比較 見表1。

表1 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達比較（±s）

表1 各組IL-6、TNF-α、COX-2表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茶浸提液低濃度組比較，△P＜0.05；與茶浸提液中濃度組比較，▲P＜0.05；與茶浸提液高濃度組比較，▽P＜0.05。

組別空白對照組模型組茶浸提液低濃度組茶浸提液中濃度組茶浸提液高濃度組陽性對照組IL-6 mRNA 1.00 ± 0.00 3.16 ± 0.10*2.73 ± 0.11*#2.02 ± 0.10*#△1.68 ± 0.11*#△▲0.86 ± 0.08#△▲▽蛋白0.79 ± 0.14 1.05 ± 0.09*0.74 ± 0.04#0.51 ± 0.02*#△0.29 ± 0.02*#△▲0.29 ± 0.02*#△▲TNF-α mRNA 1.00 ± 0.03 3.74 ± 0.43*2.60 ± 0.13*#2.30 ± 0.12*#1.28 ± 0.09#△▲0.75 ± 0.12#△▲蛋白0.50 ± 0.05 1.42 ± 0.06*1.00 ± 0.05*#0.44 ± 0.03#△0.23 ± 0.05*#△▲0.19 ± 0.02*#△▲COX-2 mRNA 1.00 ± 0.19 6.46 ± 0.23*4.64 ± 0.56*#3.71 ± 0.30*#2.80 ± 0.15*#△2.81 ± 0.48*#△蛋白0.71 ± 0.07 1.08 ± 0.05*0.66 ± 0.05#0.46 ± 0.06*#△0.27 ± 0.04*#△▲0.32 ± 0.02*#△▲

2.3 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較 見表2。

表2 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較（±s）

表2 各組NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茶浸提液低濃度組比較，△P＜0.05；與茶浸提液中濃度組比較，▲P＜0.05；與茶浸提液高濃度組比較，▽P＜0.05。

p-IκBα 1.18 ± 0.02 1.32 ± 0.03*0.98 ± 0.06*#0.89 ± 0.03*#0.74 ± 0.04*#△▲0.65 ± 0.04*#△▲組別空白對照組模型組茶浸提液低濃度組茶浸提液中濃度組茶浸提液高濃度組陽性對照組NF-κB p65 1.12 ± 0.01 1.03 ± 0.01*1.00 ± 0.01*1.02 ± 0.01*1.05 ± 0.03*1.03 ± 0.02*p-NF-κB p65 0.87 ± 0.10 1.20 ± 0.01*0.97 ± 0.06#0.87 ± 0.07#0.64 ± 0.02*#△▲0.50 ± 0.02*#△▲IκBα 0.76 ± 0.02 0.82 ± 0.04 0.73 ± 0.01 0.76 ± 0.03 0.77 ± 0.03 0.82 ± 0.05

3 討論

肝纖維化是由各種致病因素導致肝內結締組織異常增生的病理生理過程，是慢性肝病向肝硬化進展的共同環(huán)節(jié)。迄今為止，肝纖維化的發(fā)病機制仍未完全闡明，臨床尚無有效治療肝纖維化的化學藥物。近年來，隨著國民健康意識不斷加強以及生活水平不斷提高，國內食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)正朝著綠色、天然、無污染方向不斷轉型升級，天然植物及其提取物在疾病防治方面?zhèn)涫荜P注［7-8］。

茶葉是天然的植物飲品，也是全球第二大飲品。都勻毛尖茶是我國的十大名茶之一，含有豐富的蛋白質、氨基酸、生物堿、茶多酚等物質。其中，茶多酚的含量約占17%［5］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯是茶多酚中最有效的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，能夠抑制氧化損傷，通過減少Ⅰ型膠原合成、抑制細胞增殖及基質金屬蛋白酶活化，抑制肝星狀細胞侵襲并誘導肝星狀細胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用［9-10］。本研究結果發(fā)現，都勻毛尖茶浸提液呈濃度依賴性抑制LX-2 細胞活性，提示都勻毛尖茶浸提液能夠抑制肝纖維化。但目前都勻毛尖茶浸提液抑制肝纖維化的機制尚不清楚。

IL-6 是一種重要的炎癥因子，可由活化的肝星狀細胞分泌，而IL-6 增多又可進一步刺激肝星狀細胞增殖，使肝星狀細胞處于持續(xù)活化狀態(tài)。因此，IL-6 是肝星狀細胞活化的重要標志之一［11］。另外，當肝臟存在活動性炎癥時，肝細胞可分泌炎癥因子IL-6、TNF-α、COX-2，這些炎癥因子又可加重肝細胞炎癥反應，進一步加重肝損傷，從而導致肝纖維化發(fā)生［12］。因此，IL-6、TNF-α、COX-2是反映肝細胞炎癥的重要介質。本研究通過GraphPad Prism 8.0軟件計算，LX-2 細胞IC50時都勻毛尖茶浸提液濃度為170.9 μg/mL。因此，選擇40、80、160 μg/mL都勻毛尖茶浸提液分別作為茶浸提液低、中、高濃度組進行后續(xù)實驗。結果發(fā)現，LX-2細胞經40、80、160 μg/mL都勻毛尖茶浸提液干預后，LX-2 細胞活性均顯著降低，這表明都勻毛尖茶浸提液可抑制LX-2 細胞活性，具有一定抗肝纖維化作用。本研究結果發(fā)現，與空白對照組比較，模型組IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表達均顯著升高；與模型組比較，茶浸提液低、中、高濃度組IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA 和蛋白表達均顯著降低，尤其是茶浸提液高濃度組效果甚至與陽性對照組相當。結果提示，都勻毛尖茶浸提液可通過抑制炎癥因子表達來減輕肝臟炎癥反應，從而抑制肝纖維化發(fā)生。

NF-κB是由Rel、p65、RelB、p50、p52五個亞單位聚合形成的同源或異源二聚體。NF-κB可通過與細胞核內特異性κB 序列結合，誘導相關基因轉錄，進而參與肝臟炎癥損傷，促進肝纖維化發(fā)生［13］。IκBα是最具特異性的NF-κB 抑制劑，可通過其錨蛋白重復序列與RHD 結合而掩蓋NF-κB 的核定位信號，阻止NF-κB 轉位進入細胞核內調控基因的轉錄與表達。磷酸化的IκBα 被泛素結合酶識別發(fā)生快速泛素化并迅速被蛋白酶體降解，從而提高NF-κB 的入核效率，導致NF-κB 活化［14］。有研究報道，槲皮素、丹參素等天然黃酮類成分可通過抑制IκBα 磷酸化和降解來抑制NF-κB 活化，下調IL-6、TNF-α、COX-2等炎癥因子表達，從而抑制肝纖維化發(fā)生［15-16］。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組p-NF-κB p65、p-IκBα 蛋白表達顯著升高；與模型組比較，茶浸提液低、中、高濃度組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達顯著降低，尤其是茶浸提液高濃度組效果甚至與陽性對照組相當。結果提示，都勻毛尖茶浸提液能夠抑制NF-κB信號通路活化。

綜上所述，都勻毛尖茶浸提液能夠抑制人肝星狀細胞增殖，其機制可能與抑制NF-κB 信號通路活化而減少炎癥因子產生有關。但本研究僅通過體外細胞實驗進行初步探究，尚需在體內進一步驗證都勻毛尖茶浸提液的抗肝纖維化作用及其機制。