王亞麗,賈旭旭

(寧夏師范學院 化學化工學院，寧夏 固原 756000)

手性R-2，3-二氯-1-丙醇(R-2，3-dichloro-1-Propanol 或R-2，3-DCP)是重要的藥物中間體.常被用于合成二氯丙酮、乙酸纖維、水處理劑等多種化工產品，還可用于合成抗病毒藥物“更昔洛韋”(用于治療艾滋病、器官移植病毒感染等)[1-3]，也是合成離子交換樹脂、環(huán)氧氯丙烷(ECH)和環(huán)氧樹脂等物質的中間體.但是由于R-2，3-二氯-1-丙醇合成過程受催化劑選擇性的限制，目前報道的合成方法中其產率并不高.而催化劑氯過氧化物酶(CPO)由于其特殊的卟啉環(huán)結構，具有對底物手性識別的功能，能進行一些特殊的手性催化，選擇性很高，近年來引起了藥學界和商業(yè)界的廣泛關注.目前的研究結果表明其被用作催化小分子烯烴環(huán)氧化、小分子炔烴羥基化以及有機硫化物磺化氧化等[4-6]方面催化效果顯著.

目前甘油合成二氯丙醇都是在羧酸等化學催化劑作用下實現(xiàn)的，在酸性反應環(huán)境中，甘油和羧酸首先進行酯化反應，生成羧酸甘油酯[7-8].然后，氯離子與羧酸甘油酯生成3-氯-1，2-丙二醇和2-氯-1，3-丙二醇，繼續(xù)反應則可生成2，3-二氯-1-丙醇和1，3-二氯-2-丙醇，但是該生產方法得到的都是外消旋體，還需通過拆分才能得到R-2，3-二氯-1-丙醇，而拆分后產率并不好.怎樣直接合成手性的二氯丙醇仍是一個需要解決的問題，而且目前已知的合成方法產率都不高[9].基于此本文嘗試以氯過氧化物酶作催化劑，利用其對底物的手性識別功能，催化氧化甘油氯化一步反應制備R-2，3-DCP.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

氯過氧化物酶(Rz= 1.05，Sigma-Aldrich公司)，甘油(國藥試劑)，叔丁基過氧化氫(國藥試劑)，30% 過氧化氫(國藥試劑)，四甲基溴化銨(阿拉丁試劑)，四乙基溴化銨(阿拉丁試劑)，四丙基溴化(銨阿拉丁試劑)，四丁基溴化銨(阿拉丁試劑)，無水乙醇(國藥試劑)，無水亞硫酸鈉(國藥試劑)，磷酸二氫鉀(國藥試劑)，磷酸氫二鉀(國藥試劑)，乙酸乙酯(國藥試劑).

主要儀器為GC2014氣相色譜儀(日本島津)，UV-1700 型紫外分光光度計(日本島津)，Chirascan圓二色光譜儀(英國應用光物理公司)，氣相色譜-質譜聯(lián)用儀HP6890/5973N(美國安捷倫)，WZZ-2B自動旋光儀(上海精科)，超導傅立葉數字化核磁共振譜儀(Bruker)，YS-10A型元素型超純水儀(上海摩科).

1.2 實驗方法

1.2.1 CPO 酶催化TBHP/H2O2氧化甘油的反應

在50 mL的燒瓶中加入15 mL一定pH的0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)，加入0.001 mol甘油和0.05 mol的NaCl溶液攪拌30 min后，加入0.20 μmol CPO攪拌10 min，再加入0.002 mol過氧化氫(H2O2)，其中H2O2采取分次加入的方式，每隔10 min加一次.在25 ℃及固定轉速下避光攪拌反應一定時間后，加入無水Na2SO3停止反應.用乙酸乙酯萃取三次，合并有機相后采用無水Na2SO4干燥，干燥后的產物用于氣相色譜分析表征，計算產率及選擇性.

1.2.2 產物氣相色譜分析

色譜柱參數為β-DEX 120手性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、FID 檢測器、載氣(氮氣、氫氣流速保持在55 mL·min-1、柱頭壓為0.06 MPa、進樣體積為0.3 μL.采用程序升溫，初始溫度50 ℃，以15 ℃·min-1升溫到110 ℃后保持5 min，再以25℃·min-1升到160 ℃后保持2 min).采用與標準品的保留時間進行對照來定性分析；采用標準品做標準曲線對產物進行定量分析，計算產率和光學純度(ee值).

1.2.3 產物表征及分析

(i)產物旋光性的測定

將數顯旋光儀的光學系統(tǒng)以傾斜20°安裝在基座上，溫度設置為25℃，光源采用20瓦鈉光燈，選擇合適長度的旋光管盛裝溶液，準備測量.首先調零，然后測定旋光度，得到實驗數據為16.5°，確定溶液具有旋光性，而且數顯為正，確定其為右旋物質，則產物趨于R型.同時也可讀出物質的比旋光度，確定物質的純度，實驗中發(fā)現(xiàn)溶液的濃度以及旋光管的長度對旋光度均有影響.

(ii)產物核磁共振圖譜測試實驗通過對CPO酶促鹵化甘油反應的產物經提純分離后，溶解于氘代試劑中進行核磁分析，結果如圖1和圖2所示.

化學位移 (1×10-6)

從圖1(1H NMR)可以看出，在以氘代氯仿作溶劑時，300 Hz的核磁圖譜中，除去零點峰外，中間有5個明顯的峰位，為5個不同的氫原子峰，每個峰位數值均不同，第一個化學位移為4.18的氫為手性碳上的氫，緊接著化學位移為4.07和3.95的氫，它們是與氯原子相連的首位碳上的氫，而化學位移為3.82和3.83是與羥基相連的碳上的兩個氫，羥基氫原子由于受多種因素的影響，化學位移范圍一般為2～5，綜合分析可以確定化學位移1.81處為羥基氫的峰位.通過對1H核磁譜圖進行積分，以判斷此物質為 2，3-二氯-1-丙醇.

化學位移 (1×10-6)

圖2為核磁13C圖譜，有三個明顯的碳原子峰,根據化學位移依次為63.45的碳原子峰，為與羥基相連的碳，61.32的碳原子峰為中間與氯相連的碳，也就是手性碳，44.03的碳原子峰，為左邊與氯相連的碳.其實驗測定值與理論值(63.33，61.09，44.38)基本相符，進一步證明所合成的產物是2，3-二氯-1-丙醇.

為了更進一步對產物進行定性分析，實驗還進行了GC-MS表征，通過氣相色譜讓混合物中的組分分離，用質譜鑒定分離出來的組分并確定其含量.與標準圖譜對照，確定同樣出峰位置在2.367 min得到離子流強度最高的峰.此峰經過質譜鑒定得到質荷比(m/z)為62和31兩種明顯的碎片峰，其中m/z=62的質譜峰豐度最高，參考譜庫確定該豐度為2，3- DCP質譜圖，最終確定保留時間在2.367 min的色譜峰確實是2，3- DCP.測試結果進一步定性說明生成物為2，3- DCP.

2 結果與討論

2.1 氧化劑的選擇

在酶作催化劑的反應中，最常用的氧化劑為叔丁基過氧化氫和過氧化氫，但在以過氧化物酶家族為催化劑的部分反應中發(fā)現(xiàn)使用H2O2作催化劑會降低酶的活性，因此一些反應采取叔丁基過氧化氫(TBHP)代替H2O2作氧化劑.本實驗同時開展兩組實驗分別以H2O2和TBHP作為氧化劑，CPO作催化劑催化合成手性二氯丙醇.其他反應條件均相同，反應中分別加入相同量的兩種氧化劑，反應結束后計算產率，分別為46.2%和41.8%，ee%值分別為91.4%和91.3%，可見該反應以H2O2作氧化劑時產率較高，而ee值影響不大.從綠色化學的角度考慮，H2O2在該反應中除了具有良好的氧化性能，還具有對環(huán)境友好性能，所以采用其作催化劑.

確定氧化劑H2O2后，考察其用量對反應收率的影響，確定當底物甘油與H2O2的物質的量比為1∶2時，R-2，3-二氯-1-丙醇的收率達到最高44.5 %，其ee值為90.8%.當增加氧化劑用量時，R-2，3-二氯-1-丙醇的收率反而降低，這是因為隨著氧化劑用量的增加使整個體系中氧化劑量比例增多，而CPO具有活性，在氧化劑濃度較高時，其分子結構發(fā)生變化，導致活性位點暴露程度降低，催化性能減小.另外反應過程中隨著反應的進行，部分H2O2發(fā)生分解生成水，不利于有機反應的進行.

2.2 pH對反應的影響

在堿性環(huán)境中產率極低，根據實驗測定酶已失活，因此,后續(xù)確定實驗pH范圍3～7.結果如圖3所示，從圖中可以看出，反應最佳pH為5，當pH低于5時，手性二氯丙醇的產率隨pH增大而增大，當pH為5時R-2，3-DCP產率達到最大值45.3%，當pH為6時，產物產率下降很快，當pH為7時產率仍降低較快.實驗證明該反應最適pH為5，這也跟CPO的本性有關，CPO在偏酸或偏堿環(huán)境中其結構會發(fā)生改變，活性中心卟啉環(huán)受到影響，導致其整個結構失活[10]，而在中性條件下，溶液中的底物溶解降低，也會導致產率下降，同時通過旋光儀測定證實在中性條件下會生成部分外消旋體，從而影響產率.

2.3 酶用量對合成反應的影響

在確定pH條件后，考察氯過氧化物酶(CPO)用量對反應產率的影響，結果如圖4所示，產物R-2，3-二氯-1-丙醇的產率隨酶濃度變化而不同，當CPO用量逐漸增大時，產率逐漸提高，當酶用量大于0.20 μmol時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產率基本保持不變，其最高產率達到47.5% ，結合產率并從酶用量方面考慮確定最佳CPO用量為0.20 μmol.可見以CPO作催化劑合成該反應體系，酶的用量極少，其具有潛在的產業(yè)化應用價值.

504030201034567pHyield/%504030201004812time/hyield/%圖3 pH對反應產率的影響圖4 CPO用量對反應產率的影響

2.4 反應時間的影響

確定pH和酶用量后，考察反應時間對CPO催化甘油合成R-2，3-二氯-1-丙醇的影響，結果如圖5所示.反應開始，隨著時間的延續(xù)產率逐漸增大，當反應進行的時間為10 h時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產率達到了最大值48.8%.其后隨反應時間繼續(xù)延長，產物產率會逐漸降低.這是因為隨著時間的延長導致產物發(fā)生聚合，從而降低了產率.因此為了保證獲得較高的產率，本體系確定最佳的反應時間是10 h.該反應與合成手性二氯丙醇的其他反應相比，在反應時間上還是有一定的優(yōu)勢.

2.5 溫度對反應的影響

為了提高產率，應用前面得到的條件，考察溫度對CPO催化甘油合成R-2，3-二氯-1-丙醇的影響，對實驗數據作圖，結果如圖6.CPO在30℃時的活性最好，產物產率達到50.3%.隨著溫度的升高，酶活性逐漸下降，導致產率降低，溫度的變化對該反應產率影響較大.所以確定最佳反應溫度為30℃.

504030201004812time/hyield/%555045403530153010202535yield/%Amountofenzyme/μmol4045圖5 反應時間對產率的影響圖6 反應溫度對產率的影響

2.6 季銨鹽對反應的影響

CPO具有親水性，在有機溶劑中很不穩(wěn)定，容易失活.而大多數有機底物一般都難溶于水，導致CPO催化的有機合成反應產率均不高.本實驗通過前面條件優(yōu)化后R-2，3-二氯-1-丙醇的產率也僅達到50.3%.為了提高反應的產率，引入季銨鹽作為反應體系的添加劑.該類添加劑是一種優(yōu)良的相轉移催化劑，與水相中的親核試劑組成離子對進入有機相，從而加快反應速率，減少副反應并提高產率.本體系選用四甲基溴化銨(TMABr)、四乙基溴化銨(TEABr)、四丙基溴化銨(TPABr)和四丁基溴化銨(TBABr)作為添加劑，結果如圖7所示，可以看出加入季銨鹽后產率均提高，其中當在體系中加入0.05 mol · L-1TMABr最高，產率達到了78.6 %，ee值也達到98.4 %.產率提高一方面與CPO本身的結構緊密相關，加入季銨鹽后改變了CPO內部結構上疏水性通道與氨基酸殘基之間的相互作用，使得CPO活性位點周圍產生了大量的疏水性環(huán)境，從而使CPO的活性位點和有機底物更容易鍵合，提高了CPO的催化活性；另一方面底物與季銨鹽端基間的靜電作用降低了反應的活化能，從而更有利于反應的進行[11].從圖7可以看出，添加劑的疏水鏈越短，越容易接近通道，對CPO催化性能的激活度越高，所以當加入TMABr作為添加劑時，R-2，3-二氯-1-丙醇的產率最高.

圖7 季銨鹽對磺化氧化反應的影響

為了對加入添加劑后R-2，3-二氯-1-丙醇的產率提高的原因進一步分析，實驗通過UV-Vis光譜儀對加入添加劑后CPO的構象進行了分析，其結果如圖8所示，CPO在紫外區(qū)的特征吸收峰為398 nm ，這是其結構中血紅素輔基卟啉環(huán)產生的吸收帶，從該實驗測試的結果可以看出，當加入季銨鹽時，卟啉環(huán)的吸收帶強度都增強，而在加入四甲基溴化銨時增強最為明顯，因為當加入季銨鹽時，使CPO結構中的血紅素輔基卟啉環(huán)活性中心更加暴露，從而紫外吸收強度增大，更有利于底物接近活性中心，使催化活性得到提高，從而使R-2，3-二氯-1-丙醇產率得到提高.

為了進一步對CPO在添加劑中的構象進行分析，采用熒光分光光度計進行光譜測試，結果如圖9所示，在不同季銨鹽溶液中CPO熒光光譜發(fā)生了變化，峰位沒有移動，說明此時分子中的肽鏈沒有伸展，氨基酸殘基周圍的極性沒有大的變化.但加入季銨鹽的溶液中的熒光強度都比純緩沖溶液中強，而熒光強度的大小表明CPO側鏈微環(huán)境的暴露程度，該強度增強表明當加入添加劑季銨鹽時CPO結構中的血紅素微環(huán)境發(fā)生了變化，這種變化使得α-螺旋結構加強，從而CPO分子中的鐵卟啉環(huán)活性中心更易暴露在環(huán)境中，內源性熒光活性增強，導致CPO的催化性能提高，從而提高了產率.

3 結論

該合成方法是以CPO為催化劑催化、過氧化氫(H2O2)氧化甘油制備得到R-2，3-二氯-1-丙醇，實驗中通過對工藝條件的優(yōu)化，又采用添加季銨鹽提高產率后，反應體系最終產率和ee值分別可以達到78.6%和98.4%.與目前已有的合成方法相比，大大縮短了反應時間.該方法以NaCl作為氯源，減少了污染，同時CPO酶促制備反應快速又高效，并且酶用量極少，具有一定的產業(yè)化應用前景.