劉 晶，杜晶輝，劉瑞巖，鮑志軍，賀 鑫，趙 巖，王 俊，雷曜榮，劉 旭

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科/國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193

新型冠狀病毒核酸檢測是我國常態(tài)化疫情防控的技術(shù)保障，已在全國二、三級醫(yī)療機構(gòu)廣泛開展，是切斷病毒傳播的重要防線。實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)具有高靈敏度、高效高通量的優(yōu)勢，可在疾病早期或潛伏期內(nèi)識別微量的病毒核酸片段[1]，是《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》推薦的常規(guī)檢測方法[2]。為確保核酸檢測結(jié)果的準確性，各實驗室需具備完善的實驗室質(zhì)量控制體系。2021年5月國家衛(wèi)生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒肺炎防控方案》(第八版)文件指出[3]，實驗室應(yīng)規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)控，每批檢測至少有1 份弱陽性質(zhì)控品、3 份陰性質(zhì)控品，室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。新型冠狀病毒RT-PCR檢測方法屬于定性分析，僅簡單判斷陰陽性質(zhì)控是否在控，無法評價核酸提取效率是否達標、檢測過程是否存在系統(tǒng)誤差或偶然誤差。本文在陰陽性質(zhì)控在控的基礎(chǔ)上，將定性PCR結(jié)果進行計量資料轉(zhuǎn)換，統(tǒng)計弱陽性質(zhì)控靶基因循環(huán)閾值(Ct值)，繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖，回顧性分析檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全自動核酸提取儀BG-Flex-96，配套核酸提取及純化試劑TQ-BG-003-96D-96，新冠病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)，以上均購自上海伯杰公司。實時定量PCR儀QuantStudio 5，購自美國Thermofisher公司。

1.2質(zhì)控物來源 本實驗質(zhì)控物來自第三方噬菌體假病毒顆粒，批號2021005，濃度范圍：5.35×103+3～5.24×104+4 copy/mL，購自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1新冠病毒核酸檢測 新冠病毒的核酸檢測嚴格按照伯杰試劑說明書和按本實驗室標準操作規(guī)程文件進行操作。使用伯杰核酸提取試劑96孔板吸取200 μL樣本，首先樣本與裂解液和磁珠結(jié)合，經(jīng)過兩次洗滌去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，洗脫出核酸。將5 μL核酸加入20 μL擴增反應(yīng)液，形成25 μL反應(yīng)體系，在PCR儀進行擴增反應(yīng)，應(yīng)用QuantStudioDesign & Analysis軟件進行擴增曲線分析進行結(jié)果判讀。每批次檢測均設(shè)置3個陰性質(zhì)控、1個弱陽性質(zhì)控。

1.3.2弱陽性質(zhì)控稀釋倍數(shù)的選擇 使用無菌生理鹽水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40對第三方質(zhì)控物進行倍比稀釋，每個稀釋倍數(shù)分裝8支，每支200 μL，分裝至1.5 mL離心管。配制完成后，5個濃度水平的40支質(zhì)控物立即進行RT-PCR核酸檢測。

1.3.3繪制定性檢測散點圖 記錄每批次陰性質(zhì)控和弱陽性質(zhì)控的結(jié)果并按照自定義數(shù)值繪制定性結(jié)果散點圖：將弱陽性質(zhì)控定義為數(shù)值“1”，檢測為陽性時定義數(shù)值為“2”，檢測為陰性時定義數(shù)值為“-2”；將陰性質(zhì)控定義為“-1”，檢測為陰性時定義數(shù)值為“-2”，檢測為陽性時定義數(shù)值為“2”；將質(zhì)控品定義數(shù)值與檢測結(jié)果定義值相加，等于“3”或“-3”為在控，等于“1”為假陽性反應(yīng)，等于“-1”為假陰性反應(yīng)[4]。

1.3.4弱陽性質(zhì)控的配制與數(shù)據(jù)采集 (1)弱陽性質(zhì)控的配制：首先使用生理鹽水將第三方質(zhì)控物按1∶3稀釋分裝至1.5 mL離心管(無RNase)，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。每批檢測時取一支配制好的質(zhì)控物，室溫平衡，充分混勻并瞬離。進行核酸提取時，弱陽性質(zhì)控位置加入20 μL配制陽性質(zhì)控+180 μL生理鹽水，共200 μL，即再進行10倍稀釋。(2)收集本實驗室2022年1-2月每批次實驗的原始數(shù)據(jù)；統(tǒng)計所有實驗批次弱陽性質(zhì)控的靶基因Ct值，建立Excel 2010數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù)。分別對N基因和ORF1ab基因兩組Ct值進行正態(tài)分布檢驗，當(dāng)P>0.05表示服從正態(tài)分布，當(dāng)P<0.05表示不服從正態(tài)分布。

1.3.5繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖 根據(jù)前20次檢測結(jié)果分別計算N基因和ORF1ab基因的靶值X和標準差s，上下限為X±3s，警告限為X±2s。以檢測次數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 使用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、分析、制圖。應(yīng)用IBM SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗。

2 結(jié) 果

表1 5個稀釋倍數(shù)的弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值比較(n=8)

2.2RT-PCR定性室內(nèi)質(zhì)控散點圖 根據(jù)自定義數(shù)值繪制定性檢測結(jié)果散點圖，如圖1所示。在97個批次檢測結(jié)果中出現(xiàn)1次失控，即第85次(即2月2日第3批次)弱陽性質(zhì)控檢出陰性結(jié)果出現(xiàn)了“假陰性”反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)失控后，立即采取糾正措施并復(fù)檢。

圖1 熒光PCR定性室內(nèi)質(zhì)控散點圖

2.3弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值的正態(tài)性檢驗 2021年1-2月份弱陽性質(zhì)控靶標N基因、ORF1ab基因Ct值進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)。見圖2。

注：N基因Ct值正態(tài)分布(P=0.574)ORF1ab基因Ct值正態(tài)分布(P=0.08)。

2.42022年1-2月弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值Levey-Jennings質(zhì)控圖 弱陽性質(zhì)控N 基因靶值X為34.13，標準差s為0.652，變異系數(shù)CV為1.91%。結(jié)果如圖3所示，所有Ct值均在X±3s以內(nèi)，5次出現(xiàn)±2s警告，根據(jù)Westgard多規(guī)則法分析，符合質(zhì)控規(guī)則。弱陽性質(zhì)控ORF1ab基因靶值X為35.30，標準差s為0.910，CV為2.58%。第73次檢測(2月20日)Ct值超過+3s，見圖4。經(jīng)原始曲線分析，該次檢測ORF1ab曲線第1～10個循環(huán)基線波動較大，整體信號強度較低。5次出現(xiàn)±2s警告，根據(jù)Westgard多規(guī)則法分析，第31～41批次檢測違反了10x規(guī)則，第73～80批次違反了R 4s規(guī)則。

圖3 2022年1-2月弱陽性質(zhì)控N基因Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖4 2022年1-2月弱陽性質(zhì)控ORF1ab 基因Levey-Jennings質(zhì)控圖

3 討 論

目前RT-PCR法是臨床上廣泛應(yīng)用的新冠病毒核酸檢測方法，是確診COVID-19的直接證據(jù)[3]，因此準確的核酸檢測結(jié)果在疾病診斷和疫情防控中承擔(dān)重要作用?！缎滦凸跔畈《緦嶒炇覚z測專家共識》指出[5]，實驗室應(yīng)從試劑質(zhì)量控制、操作質(zhì)量控制、設(shè)置對照、多指標診斷等多方面避免假陰性、假陽性結(jié)果出現(xiàn)。因此做好全過程質(zhì)量控制，特別是室內(nèi)質(zhì)量控制尤為重要，它是連續(xù)評價實驗室工作可靠性程度的方法，是確定檢測結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。

首先，本研究選用第三方假病毒技術(shù)的陽性質(zhì)控品，原因是假病毒技術(shù)以MS2噬菌體外殼蛋白為載體，包裹核酸檢測的靶標RNA，具有真實病毒相似的物理結(jié)構(gòu)，可參與核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴增全過程，實現(xiàn)核酸檢測的全過程質(zhì)量控制[7-8]。第三方邦德盛的陽性質(zhì)控品(濃度范圍：5.35×103+3～ 5.24×104+4 copy/mL)，為確定弱陽性質(zhì)控的稀釋倍數(shù)，進行5個稀釋倍數(shù)的平行試驗，結(jié)果表明，確定最接近檢出限且穩(wěn)定性高的稀釋倍數(shù)為1∶30，平均濃度為556.7 copy/mL(濃度范圍：178.3～1 746.7 copy/mL)，是核酸檢測試劑檢出限(500 copy/mL)的1.2倍左右，符合弱陽性質(zhì)控品的濃度要求。

其次，關(guān)于核酸檢測熒光PCR法的室內(nèi)質(zhì)控，文件規(guī)定“每批檢測至少有1份弱陽性質(zhì)控品(第三方質(zhì)控品)、3份陰性質(zhì)控品(生理鹽水)[3]?！薄昂怂釞z測試驗以及其他定性試驗可選擇適當(dāng)濃度的質(zhì)控物，采用定性檢測結(jié)果合格即判為在控的方法[9]?！睋?jù)此本研究采用自定義弱陽性質(zhì)控及陰性質(zhì)控數(shù)值的方法，繪制核酸檢測定性室內(nèi)質(zhì)控散點圖，直觀地反映出質(zhì)控品的檢測結(jié)果與預(yù)期檢測結(jié)果不一致的情況并判定為“失控”，繪制定性質(zhì)控散點圖簡單易行，符合國家相關(guān)規(guī)定。

最后，Ct值是擴增曲線與閾值線的交叉點，是判讀結(jié)果是否為陰(陽)性的重要依據(jù)，是熒光PCR反應(yīng)中靶標濃度的相對測量[10]。為更加精細的進行PCR實驗室質(zhì)控管理，本研究參照定量測定室內(nèi)質(zhì)控的方法，基于靶基因Ct值建立室內(nèi)質(zhì)控的L-J質(zhì)控圖，可分辨檢測過程的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，提高檢測的準確性和精密度。本研究共累積2022年1-2月每批次檢測的弱陽性質(zhì)控Ct值97個，對兩組靶基因Ct值數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗后，均符合正態(tài)分布，適宜采用L-J質(zhì)控圖分析其離散程度和變化趨勢。本研究對上述弱陽性質(zhì)控Ct值進行了L-J圖分析，如圖3、4所示。結(jié)果表明，N基因的CV為1.91%，ORF1ab基因的CV為2.58%，盡管目前沒有明確的病毒核酸可接受的CV范圍，但可以肯定的是長期統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)控CV值是反映實驗室每個檢測環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性，能夠檢測操作中的長期變化趨勢，及時發(fā)現(xiàn)測定過程中存在的問題[11-12]。

如圖4所示，結(jié)果表明ORF1ab基因第73批次超過3s屬于偶然誤差，產(chǎn)生偶然誤差的原因可能是(1)核酸提取過程中靶基因丟失、或存在PCR抑制物的殘留[13];(2)試劑問題，如反轉(zhuǎn)錄酶的失活;(3)人員操作失誤。根據(jù)Westgard多規(guī)則質(zhì)控法，第31～41批次違反了10x規(guī)則屬于系統(tǒng)誤差，第73～80批次違反了R 4s規(guī)則，離散程度較大，同樣屬于系統(tǒng)誤差，通過分析，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的原因是PCR反應(yīng)前10個循環(huán)基線波動較大，擴增曲線不平滑，S型曲線在對數(shù)增長期斜率偏低。查找原因發(fā)現(xiàn)八連排離心管由于質(zhì)量問題與擴增儀小孔不服帖，導(dǎo)致受熱不均勻，影響擴增結(jié)果。因此通過弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值的L-J質(zhì)控圖，可分析出偶然誤差和系統(tǒng)誤差出現(xiàn)的原因，及時采取糾正措施，從而提高核酸檢測結(jié)果的可靠性。

本研究中，定性室內(nèi)質(zhì)控散點圖是判斷該批次檢測是否有效、是否可發(fā)出報告的依據(jù)，L-J質(zhì)控圖用作回顧性分析熒光PCR檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，分析偶然誤差或系統(tǒng)誤差的原因，及時發(fā)現(xiàn)操作過程失誤或試劑耗材質(zhì)量問題。當(dāng)定性室內(nèi)質(zhì)控散點圖和L-J質(zhì)控圖兩種方法結(jié)果不一致時，本實驗室以定性質(zhì)控散點圖“失控”作為質(zhì)控失敗重新復(fù)檢的依據(jù)。

綜上所述，本文創(chuàng)新性的提出將定性質(zhì)控散點圖及L-J質(zhì)控圖聯(lián)合應(yīng)用于熒光PCR檢測新冠病毒的室內(nèi)質(zhì)控，能夠較全面地反映核酸檢測的有效性和穩(wěn)定性，監(jiān)控核酸提取、擴增全過程。這2種方法在本實驗室已應(yīng)用近1年時間，效果優(yōu)于既往的“陰陽性質(zhì)控在控即合格”單一判斷方法，具有很好的預(yù)警功能。