馬韻翼，鈕紅麗，范宏芳，馬志賓，翟俊英*，姜李樂

1.南陽市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南陽 473000；2.河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000

卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)指女性在40歲之前出現(xiàn)因卵巢功能減退而導(dǎo)致的一系列臨床表現(xiàn)，包括月經(jīng)紊亂(月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng))、促性腺激素升高、雌激素降低等卵巢功能不足等[1]。當(dāng)歸為我國傳統(tǒng)中藥，味辛、甘，歸肝、心、脾經(jīng)，有補(bǔ)血活血、養(yǎng)血滋補(bǔ)及活血化瘀等功效[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸提取物可在一定程度上促進(jìn)卵泡發(fā)育[4]，改善性激素水平[5]。本研究旨在通過構(gòu)建POI大鼠模型，探討當(dāng)歸提取物是否通過調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1(nuclear factor erythroid-2-related factor 2/heme oxygenase 1, Nrf 2/HO-1)通路改善POI，為當(dāng)歸提取物的藥物研發(fā)及POI的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Bio-rad 1658001型垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020422)；當(dāng)歸提取物(陜西瑞康生物工程有限公司，批號18016761)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)；E2、FSH、LH和AMH的ELISA試劑盒(美國Ominm Abs公司)；腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-4和白細(xì)胞介素-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司)；兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗Nrf 2和HO-1單克隆抗體，HRP-Linked Antibody均購自Cell Signaling Technology。

1.3 實驗動物

65只8周齡SPF級雌性SD大鼠，浙江省維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(浙)2019-0001，體質(zhì)量(220±20) g。于SPF級飼養(yǎng)室適應(yīng)6 d，再連續(xù)進(jìn)行7 d陰道涂片判斷動情周期，選取有規(guī)律動情周期的大鼠60只作為實驗動物。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為(22±2) ℃，相對濕度為50%～70%，晝夜各12 h。研究過程中對動物的處置符合動物委員會的準(zhǔn)則。

2 方法

2.1 POI大鼠模型建立

隨機(jī)選取48只SD雌性大鼠給予配制好的雷公藤多苷片(40 mg·kg-1·d-1)懸浮液灌胃，連續(xù)給藥30 d進(jìn)行造模[6]。每天上午同一時間給藥，下午同一時間進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片，觀察、記錄動情周期，動情周期平均為90～120 h，不在此范圍的則為動情周期紊亂，當(dāng)大鼠動情周期全部紊亂，則表明建模成功。

2.2 分組與給藥

將48只建模成功的SD大鼠隨機(jī)分為模型組、當(dāng)歸提取物低、高劑量組和西藥組，各12只，其余為對照組(12只)。參照文獻(xiàn)方法[7-8]，當(dāng)歸提取物高、低劑量組分別給予100、25 mg·kg-1當(dāng)歸提取物懸浮液(生理鹽水配制)灌胃；西藥組給予0.12 mg·kg-1戊酸雌二醇懸浮液灌胃；對照組及模型組按照10 mg·kg-1給予生理鹽水灌胃；各組給藥每天1次，連續(xù)3周。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1樣本采集 給藥3周后，將大鼠麻醉，開腹，腹主動脈取血。靜置4 h，以3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，-80 ℃保存。采血完畢，處死大鼠，分離出雙側(cè)卵巢組織，一側(cè)置于質(zhì)量濃度為4 g·mL-1的多聚甲醛液中固定24 h備用，一側(cè)置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2E2、FSH、LH和AMH測定 ELISA按照E2、FSH、LH和AMH試劑盒說明書操作，加入對照品工作液100 μL，加入待測樣品100 μL至其他孔，覆膜孵育90 min。棄去液體甩干，加入生物素化抗體工作液100 μL，覆膜孵育60 min。加入洗滌液350 μL，重復(fù)洗板3次。加入酶結(jié)合物工作液100 μL，覆膜溫育30 min，洗板5次。加入底物溶液90 μL，覆膜避光孵育15 min，加入終止液50 μL。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的吸光度值(A)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本的質(zhì)量濃度。

2.3.3IL-4、IL-6和TNF-α的測定 ELISA按照IL-4、IL-6和TNF-α試劑盒說明書操作，取EP管加入對照品稀釋液100 μL，制備6個梯度質(zhì)量濃度對照品。樣品孔中加入樣本40 μL，再加工作液10 μL。各孔依次加酶標(biāo)試劑50 μL(空白孔除外)，密封后置于37 ℃水浴鍋中孵育30 min。加入洗滌液，洗滌5次并拍干。加顯色劑A和B 50 μL，避光顯色10 min，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處依序測量各孔吸光度值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本的質(zhì)量濃度。

2.3.4HE染色和卵泡計數(shù) 將用質(zhì)量濃度為4 g·mL-1的甲醛固定24 h的卵巢組織用梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，蘇木素染色5～8 min，清水沖洗1～2 min，鹽酸酒精分化1～5 s，伊紅染色3～5 min，清水沖洗1～2 min，梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇脫水，蒸餾水沖洗，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于陰涼處晾干，將組織切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)變化及卵泡結(jié)構(gòu)，計算各級卵泡的數(shù)量。

2.3.5Nrf 2/HO-1 mRNA表達(dá)量檢測 取卵巢組織180 mg，液氮研磨冰上勻漿，Trizol法提取總RNA并測定RNA質(zhì)量濃度。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)體系(20 μL)：Taq酶10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，重復(fù)40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT為目的基因相對表達(dá)強(qiáng)度，所有實驗重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.6Nrf 2/HO-1蛋白表達(dá)量檢測 取卵巢組織加入適量RIPA裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，蛋白變性后進(jìn)行凝膠電泳分離，80 V電轉(zhuǎn)1.5 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，質(zhì)量濃度50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h(室溫)，分別加入1∶1 000稀釋Nrf 2、HO-1和β-actin抗體，置于搖床孵育過夜(4 ℃)，次日用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，加入1∶2 000稀釋HRP標(biāo)記二抗，搖床孵育2 h(室溫)，再次用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，于暗室中滴加ECL發(fā)光試劑孵育1～2 min，凝膠分析系統(tǒng)曝光分析。用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白Nrf 2、HO-1與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血清性激素含量

與對照組比較，模型組E2和AMH水平降低，LH和FSH水平升高(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸低、高劑量組和西藥組E2、AMH水平升高，F(xiàn)SH和LH水平降低(P<0.05)。與當(dāng)歸低劑量組比較，當(dāng)歸高劑量組和西藥組E2、AMH水平升高，F(xiàn)SH和LH水平降低(P<0.05)。當(dāng)歸高劑量組E2、AMH、LH和FSH水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較

3.2 炎癥因子含量

與對照組比較，模型組IL-4、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸低、高劑量組和西藥組IL-4、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。與當(dāng)歸提取物低劑量組比較，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組IL-4、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。當(dāng)歸提取物高劑量組IL-4、IL-6和TNF-α水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3.3 HE染色與卵泡計數(shù)

對照組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰，各級卵泡數(shù)量較多，發(fā)育正常。模型組大鼠卵巢組織萎縮明顯，各級卵泡數(shù)量減少，卵泡結(jié)構(gòu)破壞。與模型組比較，當(dāng)歸提取物低、高劑量組和西藥組卵巢組織發(fā)育情況改善，可見各級生長卵泡數(shù)量增加，閉鎖卵泡數(shù)量減少。與當(dāng)歸提取物低劑量組比較，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組原始卵泡和竇狀卵泡的數(shù)量顯著增加，閉鎖卵泡的數(shù)量減少。見圖1。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

注：A.對照組；B.模型組；C.當(dāng)歸低劑量組；D.當(dāng)歸高劑量組；E.西藥組。

3.4 卵泡計數(shù)

與對照組比較，模型組各級卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸提取物低、高劑量組和西藥組各級數(shù)量增加，閉鎖卵泡數(shù)量減少(P<0.05)。與當(dāng)歸提取物低劑量組比較，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組各級卵泡數(shù)量增加，閉鎖卵泡數(shù)量減少(P<0.05)。當(dāng)歸提取物高劑量組卵巢組織中各級卵泡的數(shù)量與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠各級卵泡計數(shù)比較

3.5 Nrf 2/HO-1 mRNA表達(dá)水平

與對照組比較，模型組卵巢組織Nrf 2和HO-1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸提取物低、高劑量組和西藥組Nrf 2和HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。與當(dāng)歸提取物低劑量組比較，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組Nrf 2和HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。當(dāng)歸提取物高劑量組Nrf 2和HO-1 mRNA表達(dá)水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

3.6 Nrf 2/HO-1蛋白水平

與對照組比較，模型組卵巢組織Nrf 2和HO-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組比較，當(dāng)歸提取物低、高劑量組和西藥組Nrf 2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與當(dāng)歸提取物低劑量組比較，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組Nrf 2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。當(dāng)歸提取物高劑量組Nrf 2和HO-1蛋白表達(dá)水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6和圖2。

表5 各組大鼠卵巢組織Nrf 2/HO-1 mRNA表達(dá)水平比較

表6 各組大鼠卵巢組織Nrf 2/HO-1蛋白水平比較

注：A.對照組；B.模型組；C.當(dāng)歸提取物低劑量組；D.當(dāng)歸提取物高劑量組；E.西藥組。

4 討論

POI主要由于卵巢過早衰退，引起卵巢功能不全及排卵障礙，臨床癥狀包括卵泡缺乏、提前耗竭、生長發(fā)育異常及卵巢功能破壞等[9]。POI可引發(fā)E2水平和生育能力下降，對育齡婦女生殖健康和生活質(zhì)量造成極大影響，己成為導(dǎo)致女性不孕癥的主要原因之一。POI的病理本質(zhì)是卵巢內(nèi)可用卵泡數(shù)量減少，由于原始卵泡數(shù)量固定、卵母細(xì)胞不可再生特點(diǎn)，故現(xiàn)對卵巢功能不全所采用的激素療法僅是替代療法，無法逆轉(zhuǎn)卵巢功能[10]，尋找不良反應(yīng)小、安全、高效的藥物對該病的治療有重要意義。

當(dāng)歸富含黃酮、揮發(fā)油和多糖等多種有效成分[11-13]，具有清除機(jī)體自由基、提高免疫力、抗輻射、抗腫瘤和抗炎等作用[14-15]，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸提取物對卵巢功能的保護(hù)作用是通過減輕卵巢炎癥和修復(fù)免疫系統(tǒng)損傷來實現(xiàn)的[16-17]，故本研究選取當(dāng)歸提取物，建立POI大鼠模型，從分子機(jī)制上探討當(dāng)歸提取物對POI大鼠卵巢功能的改善并探究其可能的作用機(jī)制。本研究用雷公藤多苷片建立POI大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中E2水平較對照組降低，LH、FSH水平上升，出現(xiàn)動情周期紊亂、卵巢形態(tài)受損、卵泡數(shù)量減少和閉鎖卵泡數(shù)量增多等癥狀，與POI的癥狀一致。在給予當(dāng)歸提取物與戊酸雌二醇片干預(yù)后均表現(xiàn)出E2、AMH水平上升而LH、FSH水平降低，卵巢形態(tài)受損情況得到改善、各級卵泡數(shù)量增加且閉鎖卵泡數(shù)量減少，表明當(dāng)歸提取物與戊酸雌二醇片都能在一定程度上提高POI大鼠的性激素水平。

卵巢功能衰退是一個漸進(jìn)性過程，相關(guān)研究表明，機(jī)體炎性反應(yīng)是POI的重要機(jī)制之一，動物研究在POI大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了炎性細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化[18]，臨床研究也得到了相似結(jié)果[19]。越來越多的研究人員建議將炎性因子水平作為篩查卵巢功能不全的生物學(xué)標(biāo)志物，可提高該病預(yù)測效率和診斷價值。研究表明，Nrf 2/HO-1信號通路不僅是機(jī)體氧化還原反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路之一，也是炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)通路[20]。激活Nrf 2信號通路可協(xié)調(diào)炎癥細(xì)胞募集、調(diào)控抗炎基因表達(dá)，在氧化還原反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間提供一個接口，發(fā)揮抗氧化損傷、抗炎反應(yīng)等作用[21]。HO-1是調(diào)節(jié)先天免疫和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是Nrf 2上調(diào)抗炎調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞保護(hù)酶。本研究中，當(dāng)歸提取物高劑量組和西藥組血清中炎性因子IL-4、IL-6和TNF-α水平均降低，而Nrf 2和HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較模型組明顯升高，可見激活Nrf 2/HO-1信號通路，改善炎性因子水平，對POI大鼠卵巢功能有積極影響，結(jié)合大鼠血清中性激素與卵巢組織形態(tài)變化，表明當(dāng)歸提取物對POI大鼠卵巢的保護(hù)作用與Nrf 2/HO-1信號通路介導(dǎo)的炎性調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，當(dāng)歸提取物能夠調(diào)整血清中性激素的水平，改善大鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)，增加卵泡數(shù)量，可能是通過調(diào)節(jié)大鼠卵巢Nrf 2、HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用的，為臨床治療POI提供實驗依據(jù)。