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        verubulin衍生物的設(shè)計(jì)合成及活性評(píng)價(jià)

        2023-01-16 13:15:26楊善鵬任童童尹東鋒王曉鋒
        西北藥學(xué)雜志 2023年1期
        關(guān)鍵詞:微管苯胺甲氧基

        楊善鵬, 任童童,王 明, 尹東鋒, 王曉鋒*

        1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科,烏魯木齊 830000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院,烏魯木齊 830011

        verubulin(MPC-6827,Azixa,EP128495,化合物1,見圖1)化學(xué)名稱為N-甲基-2-甲基-4-甲氧基苯胺基喹唑啉,是一種作用于微管蛋白上秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)的新型微管聚集抑制劑,通過抑制微管的形成,使腫瘤細(xì)胞生長停滯在G2/M期并誘發(fā)凋亡,體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的增殖抑制活性[1-6]?;衔?(見圖1)為1的結(jié)構(gòu)衍生物,在體外也表現(xiàn)出良好的生物活性,尤其是解析了2與微管蛋白的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼:6BR1),為該類化合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾奠定了基礎(chǔ)[7]?;衔?(見圖1)是DOHLE等[8]報(bào)道的另一類作用于秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)的新型微管聚集抑制劑,同時(shí)也解析了其與微管蛋白的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼:5OSK)。通過將6BR1和5OSK進(jìn)行疊合,并對(duì)復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象及與微管蛋白相互作用方式進(jìn)行分析,我們?cè)O(shè)想在1的結(jié)構(gòu)中引入類似3中氨基磺酸酯基的基團(tuán),由此設(shè)計(jì)了化合物4a和4b。見圖1,對(duì)其分別進(jìn)行了分子對(duì)接、化學(xué)合成和體外活性評(píng)價(jià)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        磁力攪拌器(德國IKA公司);RY-Ⅰ型熔點(diǎn)儀(天津市天分分析儀器廠);JNM-ECA-400型超導(dǎo)核磁共振儀(日本電子株式會(huì)社);Xevo G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜儀(沃特世公司);分子模擬軟件Discovery Studio 3.0(Accelrys,San Diego,USA)。

        1.2 試藥

        2-甲基-4-氯喹唑啉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),3-硝基-4-甲氧基苯胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),3-芐氧基-4-甲氧基苯胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%),碘甲烷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%),氫化鈉(分散在礦物油中,含量為60%),鈀碳(10% Pd, 還原型, 含水約55%),氨基磺酰氯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%),二異丙基乙基胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%),均購自上海泰坦科技有限公司;無水硫酸鈉,氯化鈉,N,N-二甲基乙酰胺,四氫呋喃,異丙醇,乙酸乙酯,石油醚,乙醚,硅藻土均為分析純,均購自新疆安譜實(shí)驗(yàn)器材有限公司;GF254硅膠板和柱層析硅膠(200目),購自青島海洋化工有限公司。

        圖1 化合物1~4的結(jié)構(gòu)

        1.3 細(xì)胞株

        人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 4a和4b的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)

        本文所選用的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)均來源于Protein Data Bank(www.rcsb.org),編號(hào)分別為5OSK和6BR1。蛋白結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備和分子對(duì)接所使用的軟件為Discovery Studio 3.0(DS3.0)。

        2.1.1蛋白結(jié)構(gòu)5OSK和6BR1的準(zhǔn)備和疊合 蛋白結(jié)構(gòu)5OSK和6BR1的預(yù)處理[9]:保留晶體結(jié)構(gòu)中1個(gè)α、β二聚體及配體小分子和金屬離子,并保留5OSK中的水分子615和6BR1中的水分子675,將其余部分刪除;利用Prepare Protein模塊進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備,程序設(shè)置中除保留水分子外,其余默認(rèn);利用Molecular Overlay模塊對(duì)準(zhǔn)備好的蛋白進(jìn)行一致性疊合,立體因素和靜電因素各按50%概率計(jì)算。

        疊合發(fā)現(xiàn),二者相似度為0.895,2和3中B環(huán)上的甲氧基幾近重合,而3中的氨基磺酸酯基誘導(dǎo)氨基酸殘基βN349、βK352向其靠近并分別與之形成氫鍵,顯示出額外的相互作用見圖2,提示在1中引入類似基團(tuán)可能會(huì)增加其與微管蛋白的相互作用,由此設(shè)計(jì)了4a和4b,并進(jìn)行了分子對(duì)接。

        2.1.24a和4b與蛋白結(jié)構(gòu)5OSK的分子對(duì)接 以2.1.1中準(zhǔn)備好的5OSK為目標(biāo)對(duì)接蛋白,結(jié)合位點(diǎn)是以3為中心、10 ?為半徑的球形區(qū)域。配體小分子利用Full Minimization模塊進(jìn)行了能量最小化,并添加了Chemistry at Harvard Macromolecular Mechamics(CHARMM)力場。對(duì)接利用CDOCKER模塊進(jìn)行,參數(shù)按程序默認(rèn)設(shè)置,主要包括隨機(jī)構(gòu)象產(chǎn)生、構(gòu)象優(yōu)化和模擬退火等。對(duì)接結(jié)果采用Generalized Born with Molecular Volume(GBMV)溶劑模型計(jì)算結(jié)合能[9-10]。

        注:6BR1和5OSK結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基分別用灰色、青色線狀圖表示,化合物2、3分別用灰色、青色棍狀圖表示。

        首先使用3對(duì)對(duì)接方法進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示最優(yōu)構(gòu)象與蛋白結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象的走向基本一致,RMSD值為0.746 ?,結(jié)合能為-44.03 kcal·mol-1,提示對(duì)接方法效果較好。4a和4b的對(duì)接結(jié)果提示其與微管蛋白也有較好的結(jié)合,結(jié)合能分別為-39.08、-33.33 kcal·mol-1。其中4a的結(jié)合能更低,新引入的氨基磺酰胺基與原配體中的氨基磺酸酯基走向較為一致,分別與氨基酸殘基βN349形成1根氫鍵、與βK352形成2根氫鍵,但未像3可另外與αV181、βN349及作為氫鍵傳遞的水分子615形成氫鍵。見圖3。

        注:氨基酸殘基用淺灰色線狀圖表示;化合物3和4a分別用青色和橙色棍狀圖表示;氫鍵用綠色虛線表示,氫鍵的距離<3 ?。

        2.2 化學(xué)合成

        2.2.1化合物的合成及表征 以5和6為原料,通過4步反應(yīng)合成了目標(biāo)化合物4。合成路線見圖4。

        2.2.1.1化合物7a的合成 室溫下,將2-甲基-4-氯喹唑啉(5,179 mg,1 mmol)和3-硝基-4-甲氧基苯胺(6a,168 mg,1 mmol)溶于5 mL異丙醇中,加入1滴濃鹽酸,然后升溫至50 ℃攪拌12 h[11]。冷卻至室溫,析出固體物,抽濾,用5 mL預(yù)先冷至4 ℃的異丙醇洗,真空干燥,得到土黃色固體258 mg,即化合物7a。收率:83%;熔點(diǎn):246~248 ℃;1H NMR(400 MHz,d-DMSO)δ(ppm)9.91(s, 1H),8.60(d,J=2.4 Hz,1H),8.48(d,J=8.0 Hz,1H),8.22(dd,J=9.1, 2.6 Hz, 1H),7.82(dd,J=11.0, 4.0 Hz,1H),7.71(d,J=8.2 Hz, 1H),7.58(dd,J=11.2, 4.0 Hz,1H),7.43(d,J=9.2 Hz, 1H),3.94(s, 3H),2.53(s, 3H);HR-ESI-MS m/z 311.114 1 [M+H]+(計(jì)算值311.113 9, C16H14N4O3)。

        2.2.1.2化合物7b的合成 室溫下,將2-甲基-4-氯喹唑啉(5,178 mg,1 mmol)和3-芐氧基-4-甲氧基苯胺(6b,229 mg,1 mmol)溶于5 mL異丙醇中,加入1滴濃鹽酸,然后升溫至50 ℃攪拌12 h。將反應(yīng)液倒入50 mL冰水中,調(diào)pH值至7,析出固體物,抽濾,干燥,得到黃色固體324 mg,即化合物7b。收率:87%;熔點(diǎn):233~235 ℃;1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)11.37(brs, 1H),8.78(d,J=9.2 Hz, 1H),8.06(t,J=7.6 Hz, 1H),7.88(d,J=8.0 Hz, 1H),7.81(t,J=8.0 Hz,1H),7.54(d,J=2.0 Hz, 1H),7.47(d,J=7.1 Hz, 2H),7.41(t,J=7.4 Hz, 2H),7.36(d,J=7.1 Hz, 1H),7.31(dd,J=8.7,2.2 Hz,1H),7.09(d,J=8.7 Hz, 1H),5.11(s, 2H),3.83(s, 3H),2.59(s,3H);HR-ESI-MS m/z 372.1711[M+H]+(計(jì)算值372.170 7,C23H21N3O2)。

        注:試劑及條件:a.cHCl, i-PrOH,50 ℃,12 h; b.CH3I, NaH (60% in oil),THF, 0 ℃~rt, 2 h; c.i.Pd/C,H2, AcOEt, rt, 12 h; ii. ClSO2NH2, DIPEA (for 4a), DMAc, 0 ℃~rt, 24 h。

        2.2.1.3化合物8a的合成 室溫下,將2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7a,156 mg,0.5 mmol)溶于5 mL無水四氫呋喃中,冰浴冷卻至0 ℃后加入氫化鈉(61 mg, 分散在礦物油中,含量為60%,1.5 mmol),攪拌5 min后,加入碘甲烷(143 mg,1 mmol),繼續(xù)在該溫度下攪拌30 min后,升溫至室溫反應(yīng)2 h。將反應(yīng)物倒入50 mL冰水中,析出固體物,抽濾,干燥。粗品經(jīng)柱色譜分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1),得到土黃色固體135 mg,即化合物8a。收率:83%;熔點(diǎn):98~201 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ(ppm)7.83(d,J=8.4 Hz,1H), 7.75(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.64~7.57(m,1H),7.23(dd,J=9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.08~7.09(m,J=4.7,2H),7.03(d,J=8.8 Hz, 1H),3.98(s, 3H),3.62(s, 3H),2.76(s,3H);HR-ESI-MS m/z 325.130 2[M+H]+(計(jì)算值325.129 5, C17H16N4O3)。

        2.2.1.4化合物8b的合成 室溫下,將2-甲基-4-(3-芐氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7b,188 mg,0.5 mmol)溶于5 mL無水四氫呋喃中,冰浴冷卻至0 ℃后加入氫化鈉(63 mg,分散在礦物油中,含量為60%,1.6 mmol),攪拌5 min后,加入碘甲烷(145 mg,1.0 mmol),繼續(xù)在該溫度下攪拌30 min后,升溫至室溫反應(yīng)2 h。將反應(yīng)物倒入50 mL冰水中,析出固體物,抽濾,干燥。粗品經(jīng)柱色譜分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶2),得到白色固體176 mg,即化合物8b。收率:91%;熔點(diǎn):136~138℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ(ppm)7.78(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.57~7.50(m, 1H), 7.39~7.22(m, 5H), 6.91~6.93(m, 2H), 6.86(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71~6.75(m, 2H), 5.06(s, 2H), 3.92(s, 3H), 3.55(s, 3H), 2.73(s, 3H);HR-ESI-MS m/z 386.186 8[M+H]+(計(jì)算值 386.186 3,C24H23N3O2)。

        2.2.1.5化合物4a的合成 室溫下,將N-甲基2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8a,98 mg,0.3 mmol)溶于15 mL乙酸乙酯中,在氫氣氛下加入鈀碳(40 mg,10%),攪拌反應(yīng)12 h。通過硅藻土濾除鈀碳,濾液減壓蒸干得到固體,即N-甲基-2-甲基-4-(3-氨基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室溫下,取上述固體(85 mg,0.29 mmol)溶于3 mLN,N-二甲基乙酰胺中,冰浴冷卻至0 ℃,依次加入二異丙基乙基胺(101 μL,0.58 mmol)和氨基磺酰氯(67 mg,0.58 mmol),在該溫度下攪拌30 min后,升溫至室溫反應(yīng)24 h。將反應(yīng)液倒入40 mL冰水中,用乙酸乙酯萃取3次,每次30 mL,合并有機(jī)相,用飽和氯化鈉溶液洗,加入無水硫酸鈉干燥過夜,減壓除去乙酸乙酯,向其中加入10 mL乙醚,劇烈攪拌10 min,傾沘出乙醚后,得到黃色固體物61 mg,即化合物4a[12]。收率:54 %;熔點(diǎn):199~201 ℃;1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.28(s, 1H), 7.64(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.62~7.54(m, 1H), 7.36(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.22(s, 2H), 7.02~7.09(m, 2H), 6.98(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.79(dd,J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.51(s, 3H), 2.59(s, 3H);HR-ESI-MS m/z 374.128 8[M+H]+(計(jì)算值 374.128 1, C17H19N5O3S)。

        2.2.1.6化合物4b的合成 室溫下,將N-甲基2-甲基-4-(3-芐氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8b,135 mg,0.35 mmol)溶于20 mL乙酸乙酯中,然后在氫氣氛下加入鈀碳(105 mg,10%),攪拌反應(yīng)12 h。通過硅藻土濾除鈀碳,濾液減壓蒸干得到固體,即N-甲基-2-甲基-4-(3-羥基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室溫下,取上述固體(104 mg,0.35 mmol)溶于4 mLN,N-二甲基乙酰胺中,加入氨基磺酰氯(122 mg,1.05 mmol),攪拌,反應(yīng)24 h。將反應(yīng)液倒入40 mL冰水中,用乙酸乙酯萃取3次,每次30 mL,合并有機(jī)相,用飽和氯化鈉溶液洗,加入無水硫酸鈉干燥過夜,減壓除去乙酸乙酯,向其中加入10 mL乙醚,劇烈攪拌10 min,傾沘出乙醚后,得到白色固體物73 mg,即化合物4b[8]。收率:56%;熔點(diǎn):183~185℃;1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.00(s, 2H), 7.74~7.55(m, 2H), 7.23(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.09~7.18(m, 3H), 7.03(d,J=8.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.52(s, 3H), 2.60(s, 3H);HR-ESI-MS m/z 375.112 8 [M+H]+(計(jì)算值 375.112 2, C17H18N4O4S)。

        2.3 體外MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性篩選

        取處于對(duì)數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中,密度為1×104cells·孔-1,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,空白組不加細(xì)胞培養(yǎng)基,四周邊孔中加入PBS防止邊緣效應(yīng)。37 ℃下培養(yǎng)24 h后棄去上清液,空白組和對(duì)照組各加入100 μL不含藥物的培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入質(zhì)量濃度100 μg·mL-1倍比濃度梯度稀釋的100 μL含陽性藥、4a和4b的培養(yǎng)基,每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,棄去上清液,每孔加入10 μL的CCK8溶液,培養(yǎng)4 h后,除去上清液,用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。根據(jù)藥物濃度與抑制率作圖,計(jì)算GI50值,實(shí)驗(yàn)平行3次[13-16]。陽性藥為1。

        經(jīng)測定,4a和4b均有較好的體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,其中4a的活性略強(qiáng)于4b,但均較1有所降低,見表1。

        2.4 體外微管蛋白聚集抑制活性篩選

        利用循環(huán)離心法制備的豬腦微管蛋白進(jìn)行活性測試[17-18]。將不同濃度的藥物與微管蛋白孵化后,在冰浴下加入GDP,然后轉(zhuǎn)移到0 ℃的比色杯中,隨后升溫至37 ℃,測定該過程中340 nm下的吸光度值。與對(duì)照組比較,計(jì)算出不同藥物濃度下的抑制率。然后根據(jù)藥物濃度與抑制率作圖,計(jì)算IC50值,實(shí)驗(yàn)平行2次。陽性藥為CA-4。

        經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定,4a和4b都表現(xiàn)出了一定的微管聚集抑制活性,其中4a的活性是4b的6倍多,但顯著低于1和CA-4,見表1。

        表1 4a、4b抑制MCF-7細(xì)胞增殖的GI50值、抑制微管聚集的IC50值和ClgP值

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)通過將2、3與微管蛋白的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合,利用“拼合”策略設(shè)計(jì)了1的結(jié)構(gòu)衍生物4a和4b,并通過親核取代、甲基化、還原和磺?;?步反應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了合成,總收率分別為37%、44%,目標(biāo)化合物及中間體結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR和HR-ESI-MS確證。

        在MCF-7細(xì)胞增殖抑制活性評(píng)價(jià)中,4a和4b顯示出較強(qiáng)的活性,僅略弱于1,達(dá)到了次納摩爾水平。但是,在微管聚集抑制實(shí)驗(yàn)中,4a和4b均未顯示出預(yù)期的活性,尤其是4b僅表現(xiàn)出非常弱的微管聚集抑制活性。分析靶標(biāo)活性和細(xì)胞活性不一致的可能原因[19]:一是新引入的基團(tuán)可能改變了化合物與微管蛋白的結(jié)合方式,降低了與微管蛋白的親和力,從而導(dǎo)致微管聚集抑制活性下降,但是仍不能排除化合物作用于微管蛋白后會(huì)導(dǎo)致的其他效應(yīng);二是化合物可能作用于其他未知靶標(biāo),需要進(jìn)行細(xì)胞周期阻滯、腫瘤信號(hào)通路阻滯方面的研究。4a和4b表現(xiàn)出較好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性,可能與化合物類藥性改變有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道的1及其衍生物多表現(xiàn)出脂溶性較強(qiáng)的特點(diǎn)[5],通過在結(jié)構(gòu)中引入新的基團(tuán),降低了化合物的脂溶性使lgP值位于“理想”區(qū)間(見表1)[20],促使化合物更易進(jìn)入細(xì)胞或在細(xì)胞中積聚。

        總之,本研究在1的結(jié)構(gòu)中引入氨基磺?;虬被撬狨セ?,盡管會(huì)降低化合物的微管聚集抑制活性,但是腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性得到基本保持,并改善了類藥性,可為相關(guān)微管聚集抑制劑的結(jié)構(gòu)修飾提供借鑒。

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