付淑鳳，馬麗霞

1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,咸陽(yáng) 712000; 2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西安 710000

阿可拉定(icaritin, Ica)是從朝鮮淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿等的干燥莖葉中提取并經(jīng)酶轉(zhuǎn)化而得到的一種8-異戊烯基黃酮苷類化合物單體，其性狀為淡黃色針狀結(jié)晶[1]。早期研究發(fā)現(xiàn)，阿可拉定具有促進(jìn)心腦供血、提高造血功能、調(diào)節(jié)免疫以及抑制骨質(zhì)疏松等藥理活性[2]，隨著研究的深入，目前已證實(shí)阿可拉定對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[3]。由于阿可拉定在水中溶解度較低、體內(nèi)半衰期較短、口服吸收性較差[4]，故不利于藥效作用充分發(fā)揮。為了提高阿可拉定的水溶性，改善生物利用度，學(xué)者已將其開(kāi)發(fā)成環(huán)膠束[5]、固體分散體[6]、納米混懸劑[7]等藥物新劑型。長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(PEGylated liposomes)能夠增大難溶性藥物的溶解度[8]，延長(zhǎng)藥物在血液系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間[9]，提高藥物在肝臟組織部位蓄積，使藥物具有被動(dòng)靶向特性[10]，近年來(lái)已成為研究熱點(diǎn)。為此，本研究基于阿可拉定的藥理作用及理化性質(zhì)，并結(jié)合長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的自身優(yōu)勢(shì)，將阿可拉定制備成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，以增強(qiáng)藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性，達(dá)到高效、特異性的治療目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；FD-1B-50真空冷凍干燥機(jī)(上海繼譜電子科技有限公司)；LF-100脂質(zhì)體擠出器(Avestin公司)；Sigma低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；7500型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90 納米粒徑電位分析儀(英國(guó)馬爾文公司)。

1.2 試藥

阿可拉定(四川萃益潤(rùn)生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%)；氫化大豆磷脂、膽固醇、聚乙二醇2000-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)均購(gòu)自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；叔丁醇(羅輔醫(yī)藥科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 Ica-Lips的制備

通過(guò)冷凍干燥-水化法[11]制備Ica-Lips。精密稱取氫化大豆磷脂7.0 g、膽固醇2.0 g、PEG2000-DSPE 0.15 g和阿可拉定1.0 g，加入100 mL叔丁醇中，攪拌溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到淡黃色粉末，密閉保存。稱取上述冷凍干燥粉末1.0 g，置于燒杯中，加入生理鹽水80 mL，并以1 500 r·min-1磁力攪拌30 min，使含藥粉末充分水化，形成淡黃色混濁液；將上述藥物溶液經(jīng)脂質(zhì)體擠出器(帶有0.1 μm聚偏氟乙烯膜)連續(xù)擠出5次，補(bǔ)加生理鹽水定容至100 mL，得到淡黃色帶有微弱乳光的液體；最后將藥物溶液經(jīng)0.22 μm聚偏氟乙烯膜過(guò)濾除菌，灌裝、充氮、密封，得到Ica-Lips，低溫冷藏，備用。

2.2 Ica-Lips表征

2.2.1微觀形態(tài) 取Ica-Lips 100 μL，用蒸餾水稀釋25倍，混合均勻，取1滴樣品溶液滴加到涂有碳膜的銅網(wǎng)格上，風(fēng)干；在樣品上滴加1滴質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的磷鎢酸對(duì)其進(jìn)行染色30 s，風(fēng)干后，將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察Ica-Lips的微觀形態(tài)，并拍攝電鏡照片，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，Ica-Lips呈類球狀分布，大小均勻，大部分粒徑在50～150 nm范圍內(nèi)，其磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。

圖1 Ica-Lips的透射電子顯微鏡照片

2.2.2粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 使用Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測(cè)定Ica-Lips的粒徑分布與Zeta電位。取Ica-Lips 100 μL置于聚苯乙烯樣品池中，用蒸餾水稀釋25倍，混合均勻，根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射原理測(cè)定Ica-Lips的粒徑分布，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為633 nm，散射角為90°，溫度為25 ℃，折射率為1.330；另取Ica-Lips置于聚苯乙烯樣品池中，根據(jù)電泳光散射原理測(cè)量Ica-Lips的表面電荷(即Zeta電位)。所有樣品均測(cè)定3次，取平均值。見(jiàn)圖2。

圖2 Ica-Lips的粒徑分布圖與Zeta電位圖

本研究制備的Ica-Lips的粒徑為(108.4±3.6) nm，較小的粒徑可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用，能夠延長(zhǎng)藥物在血液系統(tǒng)中的滯留時(shí)間[12]；一般而言，Zeta電位值小于-30 mV或大于30 mV有利于納米膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性[13]，而Ica-Lips的Zeta電位為(-12.9±0.2) mV，該值雖然較低，但是Ica-Lips的物理穩(wěn)定性較好，這是由于脂質(zhì)體中添加的DSPE-PEG2000具有較長(zhǎng)的親水性聚乙二醇長(zhǎng)鏈，包裹在脂質(zhì)體表面，形成空間位阻作用[14]，從而抑制脂質(zhì)體聚集或沉淀。

2.2.3包封率測(cè)定 采用超濾離心法測(cè)定Ica-Lips的包封率[15]，移取Ica-Lips 1.0 mL加入到超濾離心管上端，以4 000 r·min-1離心20 min，收集超濾液，得到游離藥物待測(cè)液，并測(cè)定其質(zhì)量濃度(C游離)；另移取Ica-Lips 1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加入少量甲醇，水浴超聲，加流動(dòng)相定容，得到總藥物待測(cè)液，并測(cè)定其質(zhì)量濃度(C總)。采用HPLC法測(cè)定上述2種樣品中藥物的含量，色譜條件為[16]：Water μPorasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 mm)，流動(dòng)相為乙腈-0.075 mol·L-1磷酸溶液(25∶75，用三乙胺調(diào)pH值至4.5)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。并按照下列公式計(jì)算包封率。包封率=[1-(C游離÷C總)]×100%。經(jīng)測(cè)定Ica-Lips的包封率為96.4%±0.3%，較高的藥物包封率有利于藥物更多地在靶體部位聚集，增強(qiáng)療效，降低毒性和不良反應(yīng)[17]。

2.3 體外釋放考察

采用動(dòng)態(tài)透析法考察Ica-Lips在pH7.4磷酸鹽緩沖液和大鼠血漿中的釋放行為。取Ica-Lips 2.0 mL，置于經(jīng)預(yù)處理的醋酸纖維素透析袋中，再加入pH7.4磷酸鹽緩沖液2.0 mL，扎緊袋口，混勻，固定在攪拌槳底部，平行3份；同上操作，另取Ica-Lips 2.0 mL，置于經(jīng)預(yù)處理的醋酸纖維素透析袋中，再加入大鼠血漿2.0 mL，扎緊袋口，混勻，固定在攪拌槳底部，平行3份。釋放介質(zhì)均為pH7.4磷酸鹽緩沖液(含質(zhì)量濃度5 mg·mL-1的十二烷基硫酸鈉)，體積為250 mL，溫度為(37±0.5) ℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，開(kāi)啟溶出儀，分別在0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h時(shí)間點(diǎn)取出釋放介質(zhì)5 mL(并補(bǔ)加同溫同體積空白介質(zhì)溶液)，稀釋、過(guò)濾，進(jìn)液相色譜儀檢測(cè)藥物含量，繪制藥物釋放曲線。見(jiàn)圖3。

圖3 Ica-Lips在pH7.4磷酸鹽緩沖液和大鼠血漿中的釋放曲線

由圖3可見(jiàn)，Ica-Lips在pH7.4磷酸鹽緩沖液和大鼠血漿中的釋放速率均較慢，但是在大鼠血漿中表現(xiàn)出更快的釋藥速率，這可能是由于血清蛋白吸附到脂質(zhì)體表面，促使磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[18]，藥物泄漏，但是Ica-Lips在血漿中仍表現(xiàn)出良好的緩釋效果。

2.4 穩(wěn)定性考察

取封裝在西林瓶中的Ica-Lips樣品，分別放置在低溫(4 ℃)和室溫(25 ℃)環(huán)境中，定時(shí)取樣，觀察樣品的外觀，并測(cè)定其包封率、粒徑分布和Zeta電位。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 穩(wěn)定性考察結(jié)果

由表1可見(jiàn)，在4 ℃條件下放置3個(gè)月的Ica-Lips樣品，其外觀未發(fā)生顯著變化，均為淡黃色帶有微弱乳光的液體，其包封率、粒徑和Zeta電位也均未發(fā)生顯著變化；而在25 ℃條件下放置3個(gè)月的Ica-Lips樣品，其外觀發(fā)生了明顯改變，其外觀由初始的淡黃色帶有微弱乳光的液體變?yōu)榈S色混濁液體，瓶底部也可見(jiàn)有少量淡黃色藥物晶體析出，經(jīng)測(cè)定該樣品的粒徑明顯增大，表明較高的溫度會(huì)促使Ica-Lips之間發(fā)生融合，粒徑增大，藥物泄露，因此Ica-Lips需在低溫(4 ℃)條件下保存。

2.5 大鼠藥動(dòng)學(xué)考察

取12只SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為200～240 g，隨機(jī)分成A、B 2組，A組大鼠尾靜脈注射Ica溶液(藥物質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1，用質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的二甲基亞砜作為溶劑)，B組大鼠尾靜脈注射Ica-Lips(藥物質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1)，給藥劑量均為20 mg·kg-1。在給藥后的0.083、0.167、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h用乙醚麻醉大鼠，并用毛細(xì)玻璃管從大鼠眼眶窩采血0.5 mL，置于肝素化的離心管中，以4 500 r·min-1離心15 min，分離的血漿儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中用于進(jìn)一步檢測(cè)；測(cè)定前將血漿在室溫條件下解凍，取血漿樣品200 μL，置于離心管中，再加入β-葡萄糖醛酸酶100 μL，渦旋混合2 min，置于37 ℃水浴中溫孵2 h，加入地塞米松溶液(質(zhì)量濃度100 μg·mL-1)20 μL作為內(nèi)標(biāo)，渦旋混合2 min，加入萃取溶劑乙酸乙酯2.5 mL，渦旋混合5 min，以4 000 r·min-1離心10 min，分離有機(jī)相，置于尖底離心管中，用氮?dú)鈸]干有機(jī)溶劑；向離心管中加入流動(dòng)相100 μL溶解殘留物，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)液相色譜儀檢測(cè)藥物含量，收集上清液，用HPLC法[色譜柱：Zorbax C8柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，Phenomenex C18保護(hù)柱(4 mm×3 mm)，流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol·L-1醋酸(30∶70)，流速：0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，柱溫：30℃]測(cè)定藥物含量[19]。使用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖4。

表2 尾靜脈注射Ica溶液和Ica-Lips的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 尾靜脈注射Ica溶液和Ica-Lips的血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

由表2可見(jiàn)，Ica溶液組的半衰期為(2.1±0.3) h，而Ica-Lips組的半衰期為(6.5±0.4) h，后者是前者的3.1倍，表明Ica-Lips延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間，減緩了藥物被體內(nèi)代謝清除的速度；Ica-Lips組的AUC0-∞為(9 893.3±638.3) μg·L-1·h，是Ica溶液組的2.9倍，表明Ica-Lips顯著提高了藥物的生物利用度，可使藥效充分發(fā)揮。

2.6 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

取BALB/c小鼠(雄性，體質(zhì)量為18～22 g)18只，右腋消毒，在皮下組織注射密度為2.0×105個(gè)·mL-1的人源肝癌細(xì)胞(HepG2)，注射體積為0.5 mL，待接種腫瘤體積達(dá)到約100 mm3后，將小鼠隨機(jī)分為3組(每組6只)，分別股靜脈注射生理鹽水(對(duì)照組)、Ica溶液(Ica溶液組)和Ica-Lips(Ica-Lips組)，給藥劑量為20 mg·kg-1，以后每隔2 d在同一時(shí)間段股靜脈注射給藥1次，在第6次給藥后第3天斷頸處死全部小鼠，解剖取出腫瘤，剝離結(jié)締組織，用生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，記錄每一組腫瘤的質(zhì)量，并計(jì)算平均值，按照下列公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=[(對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量-給藥組平均腫瘤質(zhì)量)÷對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量]×100% ，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Ica溶液和Ica-Lips的抑瘤率結(jié)果比較

由表3可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，Ica溶液組和Ica-Lips組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯變緩(P<0.05)，且Ica-Lips組的腫瘤質(zhì)量明顯小于Ica溶液組(P<0.05)，可以推測(cè)Ica-Lips能夠在腫瘤部位蓄積，提高藥物在腫瘤部位的治療濃度，增強(qiáng)抑瘤效果。

3 討論

大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)結(jié)果顯示，Ica-Lips明顯延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高了抑瘤效果，這是由于長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體中添加的DSPE-PEG2000，一方面在脂質(zhì)體表面呈部分延展?fàn)?，阻礙血液中的大分子或脂蛋白復(fù)合物靠近脂質(zhì)體，形成立體位阻保護(hù)作用[20]；另一方面，DSPE-PEG2000有很長(zhǎng)的親水性基團(tuán)，能提高脂質(zhì)體表面的親水性，可有效防止調(diào)理素對(duì)其的識(shí)別作用，從而降低其與單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的親和力[21]。因此，立體位阻和提高膜表面的親水性這2個(gè)因素同時(shí)存在，共同作用，可促使Ica-Lips在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定存在，并使其半衰期延長(zhǎng)，增加腫瘤組織對(duì)其的攝取量。