劉寶枚，王金玉，王明芳，莊乾君，陳照宇

日照市中醫(yī)醫(yī)院，日照 276800

2型糖尿病可以導致多種并發(fā)癥的發(fā)生[1]，如微血管和大血管并發(fā)癥、神經(jīng)并發(fā)癥等，其中微血管和大血管類疾病是導致2型糖尿病患者死亡的主要原因，高血糖癥一旦發(fā)生，在主動脈就會發(fā)生氧化反應生成羰基[2]， 主動脈蛋白羰基的水平是評價蛋白質(zhì)氧化水平最常用的方法，主動脈蛋白羰基的水平升高[3]，大量的活性氧會導致氧化還原反應失衡，激活敏感細胞的信號通路，如p38有絲分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)，能夠調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生[4]，形成一個前饋回路，從而導致內(nèi)皮功能障礙、血管損傷或者炎癥發(fā)生，同時也促使血管并發(fā)癥的發(fā)生[5]。本研究主要探討地黃合劑抑制p38 MAPK對糖尿病大鼠主動脈蛋白羰基和炎癥因子的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AG22331小型高速離心機 (德國Eppendorf公司)；AT-858自動酶標分析儀(美國熱電Thermo公司)；DYY-8C電泳儀 (美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

氯沙坦[默沙東(杭州)制藥有限公司] ；兔抗大鼠p38 MAPK多克隆抗(大連寶生物工程有限公司)；CREB兔單克隆抗體、MKK3/6兔抗人一抗、MKP1鼠單克隆抗體、COX2兔抗人一抗均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 藥液制備

地黃合劑主要成分引自《嵇書堯方》，處方：生地黃60 g(生地黃加黃酒10∶3的配比)，熟地黃60 g，炒白術(shù)60 g，淡干姜12 g，制川烏6 g，細辛4.5 g，蜈蚣3條，生甘草5 g。用水煎煮，第1次加入10倍的水量，煎煮30 min，第2次放入8倍的水量，煎煮30 min后過濾，合并濾液，濃縮成質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的灌胃液。

2.2 研究對象和模型分組

SPF健康大鼠，體質(zhì)量為250～350 g，購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK2013-0001。將50只SPF大鼠分為5組，正常組、糖尿病組、氯沙坦組、低劑量地黃(合劑)組、高劑量地黃(合劑)組，每組10只，禁食8 h，可飲水。

2.3 建模

5組大鼠正常喂養(yǎng)后體質(zhì)量無明顯差異，正常組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病組、氯沙坦組、低和高劑量地黃組用高脂飼料進行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后，注射濃度為0.1 mol·L-1的鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液45 mg·kg-1到大鼠腹部，每次注射STZ 1周后隨機測量大鼠血糖，血糖值大于16.7 mmo1·L-1為建模成功。正常組和糖尿病組每日給予生理鹽水5 mL·kg-1， 氯沙坦組大鼠每日用氯沙坦0.4 g·kg-1灌胃，低劑量地黃組每日用0.25 g·kg-1地黃合劑灌胃，高劑量地黃組每日用0.5 g·kg-1地黃合劑灌胃，連續(xù)治療4周，觀察體質(zhì)量和血糖的變化情況。所有大鼠最后一次灌胃后禁食12 h，給予20 g·L-1戊巴比妥鈉(湖北鴻運隆生物科技有限公司)麻醉大鼠，靜脈采血4 mL，腹部正中切開，取出腹部主動脈。

2.4 標本采集和處理

靜脈血以2 000 r·min-1離心 20 min，取上清，置于冰箱里保存?zhèn)溆?。血清中的炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)按照試劑盒說明書進行標準檢測。取主動脈組織置于冰箱中保存，備用。

2.5 放免法檢測心肌血管緊張素2的含量

取5組大鼠的主動脈組織各80 mg，分別置于1 mmo1·L-1的冰乙酸中勻漿，嚴格按照試劑盒說明書中的方法檢測血管緊張素2的含量。

2.6 HE染色檢測主動脈病理情況

取主動脈切片進行脫蠟，用蘇木精液染色，染色時長為10 min，細胞核呈藍色，胞質(zhì)呈紅色，再用蒸餾水去掉浮色，分色后，自來水清洗，進行復染，中性樹膠封固，顯微鏡觀察主動脈病理情況。

2.7 Western blot法檢測p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況

將主動脈組織剪碎放入試管中，向其中加入1 mL PMSF細胞裂解液，裂解0.5 h，移到2 mL離心管中，以11 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于離心管中，留存24 h后進行電泳和轉(zhuǎn)膜處理， p38 MAPK、MKK3/6、MKP-1兔抗以1∶700的比例進行稀釋，CREB1、COX2兔抗以1∶400的比例進行稀釋，加入稀釋后的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、MKP-1、COX2一抗在4 ℃下孵育，并倒入TBST洗滌3次，再加入二抗孵育， 二抗按照1∶10 000的比例進行稀釋，用過氧化物酶進行標記，封閉120 min后倒入TBST，洗滌3次。采用ECL發(fā)光試劑盒對蛋白進行檢測，將PVDF膜蛋白置于保鮮膜上，把 ECL的2種等體積試劑A和B置于PVDF膜上，使其充分混合，蛋白和發(fā)光液反應1 s，加一層保鮮膜，置于暗室中曝光，用Image J軟件對圖片的灰度值進行分析。

2.8 DNPH比色法檢測蛋白羰基相關(guān)指標含量

采用DNPH比色法檢測蛋白羰基的含量，收集細胞進行裂解，提取總蛋白，放在冰的生理鹽水中漂洗，加入2，4-二硝基苯肼的的稀鹽酸溶液2 mL，以1 500 r·min-1離心15 min，將獲得的混合物去上清，將蛋白質(zhì)懸浮于3 mL鹽酸胍溶液中，用10 mmo1·L-1磷酸鉀調(diào)pH值為2.5，定容，過濾，離心3 min，取上清液測定紫外吸收，讀取270～370 nm處的吸光度值(A)， 后者與前者的比值即為蛋白質(zhì)羰基的含量。SOD活性采用超氧化物歧化酶試劑盒進行測定，GSH-px采用谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒進行檢測，MDA采用二醛試劑盒進行檢測，GSH用還原型谷胱甘肽試劑盒進行檢測，上述操作均按照試劑盒的使用說明嚴格操作。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠基本指標情況

未建模前，各組大鼠情況良好，建模成功后，大鼠出現(xiàn)食物攝入量增多現(xiàn)象，同時飲水量和尿量也相應增多，活動明顯減少，體質(zhì)量先降低，后期明顯增加，建模第3周，多只大鼠出現(xiàn)口鼻碰撞出血，動作不敏捷，4周后，大鼠尾部出現(xiàn)發(fā)炎脫皮現(xiàn)象，糖尿病組中4只較為明顯，氯沙坦組3只，低劑量地黃組6只，高劑量地黃組2只，實驗結(jié)束后糖尿病組中有4只大鼠死亡，低劑量地黃組有2只大鼠死亡，氯沙坦組和高劑量地黃組各有1只大鼠死亡，共8只大鼠死亡。其中糖尿病組與正常組相比，體質(zhì)量下降，血糖和血管緊張素2升高(P<0.05)；低劑量地黃組與糖尿病組相比，體質(zhì)量和血管緊張素2的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血糖明顯降低(P<0.05)；氯沙坦組和高劑量地黃組與糖尿病組相比，體質(zhì)量明顯升高，血糖和血管緊張素2降低(P<0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的體質(zhì)量、血糖和血管緊張素2相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠基本指標情況對比分析

3.2 主動脈病理學變化情況

對建模4周后大鼠的主動脈進行HE染色分析，正常組血管內(nèi)膜表面光滑，結(jié)構(gòu)清晰，細胞的形態(tài)完整，沒有脫落現(xiàn)象發(fā)生;糖尿病組血管內(nèi)膜表面粗糙，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，細胞的形態(tài)不規(guī)則;低劑量地黃組、氯沙坦組、高劑量地黃組經(jīng)藥物治療后，組織形態(tài)的變化均有不同程度的減輕，高劑量地黃組和氯沙坦組組織形態(tài)變化減輕程度最為明顯(P<0.001)，低劑量地黃組次之(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常組;B.糖尿病組;C.氯沙坦組;D.低劑量地黃組;E.高劑量地黃組。

3.3 p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況

Western blot檢測結(jié)果表明，正常組的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平較糖尿病組的明顯升高， MKP-1降低(P<0.05)，低劑量地黃組p38 MAPK、COX2與糖尿病組相比明顯降低(P<0.05)，其他指標無明顯變化。氯沙坦組與高劑量地黃組相比各項指標無明顯變化(P>0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平與糖尿病組相比顯著降低， MKP-1明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況對比分析

注:A.正常組;B.糖尿病組;C.氯沙坦組;D.低劑量地黃組;E.高劑量地黃組。

3.4 蛋白羰基相關(guān)指標水平

通過對蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA對比分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病組的蛋白羰基和MDA較正常組明顯下降(P<0.05)，糖尿病組的SOD、GSH、GSH-px較正常組明顯上升(P<0.05)；用藥后，低劑量地黃組的蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA水平與糖尿病組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的蛋白羰基、MDA較糖尿病組明顯降低(P<0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的SOD、GSH、GSH-px水平較糖尿病組顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 蛋白羰基相關(guān)指標水平對比分析

3.5 炎性因子指標情況

實驗結(jié)果表明，糖尿病組的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10較正常組明顯升高(P<0.05)；氯沙坦組的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與糖尿病組相比TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10明顯降低(P<0.001)；低劑量地黃合劑組的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10與糖尿病組相比有所降低(P<0.05)，CRP無明顯變化(P<0.05)；高劑量地黃合劑組的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10與糖尿病組相比顯著降低(P<0.001)。見表4。

表4 5組大鼠炎性因子對比分析

4 討論

引起糖尿病的主要原因是胰島素相對缺乏[6]，也可能是由于細胞組織對胰島素的敏感性降低。糖尿病的主要特點是血糖升高，或者是體內(nèi)的糖量代謝緩慢[7]，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，全球已經(jīng)有4億人罹患糖尿病[8]，未來20年內(nèi)，糖尿病患者會暴增到6億例，尤其是2型糖尿病患者的數(shù)量增長迅速[9]，目前已引起臨床高度重視。流行病調(diào)查顯示，我國糖尿病人口已達到1.4億[10]，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，年輕人群的占比不斷上升，目前年輕人已占糖尿病患者總數(shù)的12%，隨著病程的延長，血管病變成為導致糖尿病患者死亡最主要的因素[11]。糖尿病涉及的病變范圍比較廣，隨病程進展會導致血管內(nèi)膜出現(xiàn)輕度的炎癥，包括過度激活蛋白激酶糖基化產(chǎn)物增多、多元醇通路異常等。p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在血管重構(gòu)過程中發(fā)揮著纖維化和致炎的作用，所以要阻斷p38 MAPK的轉(zhuǎn)導，改變糖尿病的血管病變過程[12-13]。

與糖尿病大鼠相比，低劑量地黃組和高劑量地黃組大鼠的體質(zhì)量明顯升高，血糖和血管緊張素2降低，而且高劑量地黃合劑的藥效相當于氯沙坦的藥效，表明地黃合劑對改善大鼠的基本情況具有一定的作用。為了進一步驗證不同劑量的地黃合劑在治療糖尿病大鼠主動脈病變中的作用，采用HE染色進行驗證，結(jié)果顯示，隨著地黃合劑劑量的逐漸增加，組織形態(tài)上都有不同程度的變化，其中高劑量地黃合劑對于大鼠主動脈病變的改善最為明顯，低劑量次之。p38 MAPK是一種具有雙重磷酸化能力的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞信息傳遞的交匯點，在調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育，調(diào)控炎癥反應、應激作用以及多種生理過程中發(fā)揮作用[14-15]。本研究驗證了不同劑量的地黃合劑對p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達情況的影響，結(jié)果顯示，高劑量地黃合劑組大鼠與糖尿病組大鼠相比，p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2的表達水平顯著降低，MKP-1的表達水平明顯升高，表明不同劑量的地黃合劑會抑制p38 MAPK通路以及相關(guān)通路蛋白的表達。

蛋白羰基化是一個不可逆的化學反應，羰基化蛋白質(zhì)從產(chǎn)生、聚集到被機體識別、分解有可能引起多種疾病[16]。蛋白質(zhì)羰基化是一種氧化應激反應，其主要與機體內(nèi)鐵離子催化自由基的過程相關(guān)，進而導致蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基被損傷，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[17]。本研究通過對蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA進行對比分析發(fā)現(xiàn)，高劑量地黃組中的蛋白羰基、MDA與糖尿病組相比明顯降低， SOD、GSH、GSH-px與糖尿病組相比顯著升高，表明使用低劑量的地黃合劑，蛋白羰基相關(guān)指標與患病大鼠相比波動不明顯，使用高劑量地黃合劑和氯沙坦，蛋白羰基相關(guān)指標與患病大鼠相比明顯改善，氯沙坦和高劑量地黃合劑藥效相當。有研究表明，地黃合劑能緩解糖尿病大鼠的蛋白排出，降低尿素氮，對糖尿病大鼠的腎臟具有保護作用[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠主動脈病變是一個慢性低水平的炎癥狀態(tài)，炎癥因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10可參與糖尿病主動脈病變的發(fā)生和發(fā)展，同時還可損傷胰島β細胞造成MS的惡化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量地黃合劑能明顯降低炎癥因子水平，表明高劑量地黃合劑與氯沙坦的療效相當，優(yōu)于低劑量的地黃合劑。曾有研究表明，地黃合劑能有效降低蛋白磷酸化水平，阻斷p38 MAPK的表達，減輕糖尿病大鼠的炎癥反應[20]。

綜上所述，高劑量地黃合劑與氯沙坦的藥效相當，能夠有效阻斷p38 MAPK信號通路，改善糖尿病大鼠主動脈的病理組織結(jié)構(gòu)，降低主動脈蛋白羰基水平，抑制氧化還原反應發(fā)生，降低炎性因子水平。