劉寶枚，王金玉，王明芳，莊乾君，陳照宇

日照市中醫(yī)醫(yī)院，日照 276800

2型糖尿病可以導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生[1]，如微血管和大血管并發(fā)癥、神經(jīng)并發(fā)癥等，其中微血管和大血管類疾病是導(dǎo)致2型糖尿病患者死亡的主要原因，高血糖癥一旦發(fā)生，在主動脈就會發(fā)生氧化反應(yīng)生成羰基[2]， 主動脈蛋白羰基的水平是評價蛋白質(zhì)氧化水平最常用的方法，主動脈蛋白羰基的水平升高[3]，大量的活性氧會導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)失衡，激活敏感細(xì)胞的信號通路，如p38有絲分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)，能夠調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生[4]，形成一個前饋回路，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、血管損傷或者炎癥發(fā)生，同時也促使血管并發(fā)癥的發(fā)生[5]。本研究主要探討地黃合劑抑制p38 MAPK對糖尿病大鼠主動脈蛋白羰基和炎癥因子的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AG22331小型高速離心機(jī) (德國Eppendorf公司)；AT-858自動酶標(biāo)分析儀(美國熱電Thermo公司)；DYY-8C電泳儀 (美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

氯沙坦[默沙東(杭州)制藥有限公司] ；兔抗大鼠p38 MAPK多克隆抗(大連寶生物工程有限公司)；CREB兔單克隆抗體、MKK3/6兔抗人一抗、MKP1鼠單克隆抗體、COX2兔抗人一抗均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 藥液制備

地黃合劑主要成分引自《嵇書堯方》，處方：生地黃60 g(生地黃加黃酒10∶3的配比)，熟地黃60 g，炒白術(shù)60 g，淡干姜12 g，制川烏6 g，細(xì)辛4.5 g，蜈蚣3條，生甘草5 g。用水煎煮，第1次加入10倍的水量，煎煮30 min，第2次放入8倍的水量，煎煮30 min后過濾，合并濾液，濃縮成質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的灌胃液。

2.2 研究對象和模型分組

SPF健康大鼠，體質(zhì)量為250～350 g，購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK2013-0001。將50只SPF大鼠分為5組，正常組、糖尿病組、氯沙坦組、低劑量地黃(合劑)組、高劑量地黃(合劑)組，每組10只，禁食8 h，可飲水。

2.3 建模

5組大鼠正常喂養(yǎng)后體質(zhì)量無明顯差異，正常組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病組、氯沙坦組、低和高劑量地黃組用高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)4周后，注射濃度為0.1 mol·L-1的鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液45 mg·kg-1到大鼠腹部，每次注射STZ 1周后隨機(jī)測量大鼠血糖，血糖值大于16.7 mmo1·L-1為建模成功。正常組和糖尿病組每日給予生理鹽水5 mL·kg-1， 氯沙坦組大鼠每日用氯沙坦0.4 g·kg-1灌胃，低劑量地黃組每日用0.25 g·kg-1地黃合劑灌胃，高劑量地黃組每日用0.5 g·kg-1地黃合劑灌胃，連續(xù)治療4周，觀察體質(zhì)量和血糖的變化情況。所有大鼠最后一次灌胃后禁食12 h，給予20 g·L-1戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司)麻醉大鼠，靜脈采血4 mL，腹部正中切開，取出腹部主動脈。

2.4 標(biāo)本采集和處理

靜脈血以2 000 r·min-1離心 20 min，取上清，置于冰箱里保存?zhèn)溆?。血清中的炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)按照試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測。取主動脈組織置于冰箱中保存，備用。

2.5 放免法檢測心肌血管緊張素2的含量

取5組大鼠的主動脈組織各80 mg，分別置于1 mmo1·L-1的冰乙酸中勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的方法檢測血管緊張素2的含量。

2.6 HE染色檢測主動脈病理情況

取主動脈切片進(jìn)行脫蠟，用蘇木精液染色，染色時長為10 min，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，再用蒸餾水去掉浮色，分色后，自來水清洗，進(jìn)行復(fù)染，中性樹膠封固，顯微鏡觀察主動脈病理情況。

2.7 Western blot法檢測p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

將主動脈組織剪碎放入試管中，向其中加入1 mL PMSF細(xì)胞裂解液，裂解0.5 h，移到2 mL離心管中，以11 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于離心管中，留存24 h后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜處理， p38 MAPK、MKK3/6、MKP-1兔抗以1∶700的比例進(jìn)行稀釋，CREB1、COX2兔抗以1∶400的比例進(jìn)行稀釋，加入稀釋后的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、MKP-1、COX2一抗在4 ℃下孵育，并倒入TBST洗滌3次，再加入二抗孵育， 二抗按照1∶10 000的比例進(jìn)行稀釋，用過氧化物酶進(jìn)行標(biāo)記，封閉120 min后倒入TBST，洗滌3次。采用ECL發(fā)光試劑盒對蛋白進(jìn)行檢測，將PVDF膜蛋白置于保鮮膜上，把 ECL的2種等體積試劑A和B置于PVDF膜上，使其充分混合，蛋白和發(fā)光液反應(yīng)1 s，加一層保鮮膜，置于暗室中曝光，用Image J軟件對圖片的灰度值進(jìn)行分析。

2.8 DNPH比色法檢測蛋白羰基相關(guān)指標(biāo)含量

采用DNPH比色法檢測蛋白羰基的含量，收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白，放在冰的生理鹽水中漂洗，加入2，4-二硝基苯肼的的稀鹽酸溶液2 mL，以1 500 r·min-1離心15 min，將獲得的混合物去上清，將蛋白質(zhì)懸浮于3 mL鹽酸胍溶液中，用10 mmo1·L-1磷酸鉀調(diào)pH值為2.5，定容，過濾，離心3 min，取上清液測定紫外吸收，讀取270～370 nm處的吸光度值(A)， 后者與前者的比值即為蛋白質(zhì)羰基的含量。SOD活性采用超氧化物歧化酶試劑盒進(jìn)行測定，GSH-px采用谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒進(jìn)行檢測，MDA采用二醛試劑盒進(jìn)行檢測，GSH用還原型谷胱甘肽試劑盒進(jìn)行檢測，上述操作均按照試劑盒的使用說明嚴(yán)格操作。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠基本指標(biāo)情況

未建模前，各組大鼠情況良好，建模成功后，大鼠出現(xiàn)食物攝入量增多現(xiàn)象，同時飲水量和尿量也相應(yīng)增多，活動明顯減少，體質(zhì)量先降低，后期明顯增加，建模第3周，多只大鼠出現(xiàn)口鼻碰撞出血，動作不敏捷，4周后，大鼠尾部出現(xiàn)發(fā)炎脫皮現(xiàn)象，糖尿病組中4只較為明顯，氯沙坦組3只，低劑量地黃組6只，高劑量地黃組2只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后糖尿病組中有4只大鼠死亡，低劑量地黃組有2只大鼠死亡，氯沙坦組和高劑量地黃組各有1只大鼠死亡，共8只大鼠死亡。其中糖尿病組與正常組相比，體質(zhì)量下降，血糖和血管緊張素2升高(P<0.05)；低劑量地黃組與糖尿病組相比，體質(zhì)量和血管緊張素2的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，血糖明顯降低(P<0.05)；氯沙坦組和高劑量地黃組與糖尿病組相比，體質(zhì)量明顯升高，血糖和血管緊張素2降低(P<0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的體質(zhì)量、血糖和血管緊張素2相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠基本指標(biāo)情況對比分析

3.2 主動脈病理學(xué)變化情況

對建模4周后大鼠的主動脈進(jìn)行HE染色分析，正常組血管內(nèi)膜表面光滑，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞的形態(tài)完整，沒有脫落現(xiàn)象發(fā)生;糖尿病組血管內(nèi)膜表面粗糙，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，細(xì)胞的形態(tài)不規(guī)則;低劑量地黃組、氯沙坦組、高劑量地黃組經(jīng)藥物治療后，組織形態(tài)的變化均有不同程度的減輕，高劑量地黃組和氯沙坦組組織形態(tài)變化減輕程度最為明顯(P<0.001)，低劑量地黃組次之(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常組;B.糖尿病組;C.氯沙坦組;D.低劑量地黃組;E.高劑量地黃組。

3.3 p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Western blot檢測結(jié)果表明，正常組的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平較糖尿病組的明顯升高， MKP-1降低(P<0.05)，低劑量地黃組p38 MAPK、COX2與糖尿病組相比明顯降低(P<0.05)，其他指標(biāo)無明顯變化。氯沙坦組與高劑量地黃組相比各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2水平與糖尿病組相比顯著降低， MKP-1明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況對比分析

注:A.正常組;B.糖尿病組;C.氯沙坦組;D.低劑量地黃組;E.高劑量地黃組。

3.4 蛋白羰基相關(guān)指標(biāo)水平

通過對蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA對比分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病組的蛋白羰基和MDA較正常組明顯下降(P<0.05)，糖尿病組的SOD、GSH、GSH-px較正常組明顯上升(P<0.05)；用藥后，低劑量地黃組的蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA水平與糖尿病組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的蛋白羰基、MDA較糖尿病組明顯降低(P<0.05)，氯沙坦組和高劑量地黃組的SOD、GSH、GSH-px水平較糖尿病組顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 蛋白羰基相關(guān)指標(biāo)水平對比分析

3.5 炎性因子指標(biāo)情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病組的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10較正常組明顯升高(P<0.05)；氯沙坦組的炎性因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與糖尿病組相比TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10明顯降低(P<0.001)；低劑量地黃合劑組的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10與糖尿病組相比有所降低(P<0.05)，CRP無明顯變化(P<0.05)；高劑量地黃合劑組的炎性因子TNF-α、MCP-1、IL-10與糖尿病組相比顯著降低(P<0.001)。見表4。

表4 5組大鼠炎性因子對比分析

4 討論

引起糖尿病的主要原因是胰島素相對缺乏[6]，也可能是由于細(xì)胞組織對胰島素的敏感性降低。糖尿病的主要特點(diǎn)是血糖升高，或者是體內(nèi)的糖量代謝緩慢[7]，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，全球已經(jīng)有4億人罹患糖尿病[8]，未來20年內(nèi)，糖尿病患者會暴增到6億例，尤其是2型糖尿病患者的數(shù)量增長迅速[9]，目前已引起臨床高度重視。流行病調(diào)查顯示，我國糖尿病人口已達(dá)到1.4億[10]，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的不斷改變，年輕人群的占比不斷上升，目前年輕人已占糖尿病患者總數(shù)的12%，隨著病程的延長，血管病變成為導(dǎo)致糖尿病患者死亡最主要的因素[11]。糖尿病涉及的病變范圍比較廣，隨病程進(jìn)展會導(dǎo)致血管內(nèi)膜出現(xiàn)輕度的炎癥，包括過度激活蛋白激酶糖基化產(chǎn)物增多、多元醇通路異常等。p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管重構(gòu)過程中發(fā)揮著纖維化和致炎的作用，所以要阻斷p38 MAPK的轉(zhuǎn)導(dǎo)，改變糖尿病的血管病變過程[12-13]。

與糖尿病大鼠相比，低劑量地黃組和高劑量地黃組大鼠的體質(zhì)量明顯升高，血糖和血管緊張素2降低，而且高劑量地黃合劑的藥效相當(dāng)于氯沙坦的藥效，表明地黃合劑對改善大鼠的基本情況具有一定的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同劑量的地黃合劑在治療糖尿病大鼠主動脈病變中的作用，采用HE染色進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，隨著地黃合劑劑量的逐漸增加，組織形態(tài)上都有不同程度的變化，其中高劑量地黃合劑對于大鼠主動脈病變的改善最為明顯，低劑量次之。p38 MAPK是一種具有雙重磷酸化能力的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞信息傳遞的交匯點(diǎn)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育，調(diào)控炎癥反應(yīng)、應(yīng)激作用以及多種生理過程中發(fā)揮作用[14-15]。本研究驗(yàn)證了不同劑量的地黃合劑對p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，高劑量地黃合劑組大鼠與糖尿病組大鼠相比，p38 MAPK、CREB1、MKK3/6、COX2的表達(dá)水平顯著降低，MKP-1的表達(dá)水平明顯升高，表明不同劑量的地黃合劑會抑制p38 MAPK通路以及相關(guān)通路蛋白的表達(dá)。

蛋白羰基化是一個不可逆的化學(xué)反應(yīng)，羰基化蛋白質(zhì)從產(chǎn)生、聚集到被機(jī)體識別、分解有可能引起多種疾病[16]。蛋白質(zhì)羰基化是一種氧化應(yīng)激反應(yīng)，其主要與機(jī)體內(nèi)鐵離子催化自由基的過程相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基被損傷，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞[17]。本研究通過對蛋白羰基、SOD、GSH、GSH-px、MDA進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，高劑量地黃組中的蛋白羰基、MDA與糖尿病組相比明顯降低， SOD、GSH、GSH-px與糖尿病組相比顯著升高，表明使用低劑量的地黃合劑，蛋白羰基相關(guān)指標(biāo)與患病大鼠相比波動不明顯，使用高劑量地黃合劑和氯沙坦，蛋白羰基相關(guān)指標(biāo)與患病大鼠相比明顯改善，氯沙坦和高劑量地黃合劑藥效相當(dāng)。有研究表明，地黃合劑能緩解糖尿病大鼠的蛋白排出，降低尿素氮，對糖尿病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用[18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠主動脈病變是一個慢性低水平的炎癥狀態(tài)，炎癥因子TNF-α、MCP-1、CRP、IL-10可參與糖尿病主動脈病變的發(fā)生和發(fā)展，同時還可損傷胰島β細(xì)胞造成MS的惡化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量地黃合劑能明顯降低炎癥因子水平，表明高劑量地黃合劑與氯沙坦的療效相當(dāng)，優(yōu)于低劑量的地黃合劑。曾有研究表明，地黃合劑能有效降低蛋白磷酸化水平，阻斷p38 MAPK的表達(dá)，減輕糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)[20]。

綜上所述，高劑量地黃合劑與氯沙坦的藥效相當(dāng)，能夠有效阻斷p38 MAPK信號通路，改善糖尿病大鼠主動脈的病理組織結(jié)構(gòu)，降低主動脈蛋白羰基水平，抑制氧化還原反應(yīng)發(fā)生，降低炎性因子水平。