陳志鑫，范暖東，申廣生，卜凡丹

1.南陽市中心醫(yī)院，南陽 473000；2.南陽市中醫(yī)院，南陽 473000

反復(fù)呼吸道感染(recurrent respiratory tract infection，RRTI)為兒科常見疾病，病因復(fù)雜，部分患兒病情遷延不愈，甚至誘發(fā)肺部較重的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響患兒的身心健康[1-2]。高良姜素(galangin，Ga)為蜂膠及中藥高良姜中一種重要的黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗過敏和清除自由基的藥理學(xué)活性[3]。高良姜素可通過阻斷組胺及多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)緩解肥大細(xì)胞源性過敏性炎癥，并且能夠有效抑制臭氧所致慢性阻塞性肺病小鼠、白蛋白誘導(dǎo)所致過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥，緩解呼吸道癥狀[4-5]。研究顯示，反復(fù)呼吸道感染引起的炎癥反應(yīng)與核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)通路介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)途徑有關(guān)[6]，為此本研究探討高良姜素對(duì)RRTI模型小鼠肺功能及NF-κB/IRF-3通路的影響，以期闡明其抗氣道炎癥作用的具體機(jī)制，為臨床治療RRTI提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)；SW1022-ProfiBlot 48 型全自動(dòng)蛋白印跡分析儀(Bioneer公司)；IX73型倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)有限公司)。

1.2 試藥

高良姜素(Ga，美國Sigma公司)；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(規(guī)格:10 mg，天津生物化學(xué)制藥有限公司)；水合氯醛，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒均購自武漢EIAab公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IRF3、p-IRF3一抗及GAPDH抗體均購自美國Abbiotec公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠40只，3周齡，體質(zhì)量為12～16 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物合格證號(hào): 202010107。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2020-2-008。

2 方法

2.1 RRTI小鼠模型的建立及分組

將40只雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、RRTI模型組、Ga低劑量組、Ga高劑量組，每組10只，全部操作經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。除空白對(duì)照組外，其余3組參考文獻(xiàn)的方法[7]均采用疲勞結(jié)合飲食失節(jié)加煙熏法建立RRTI小鼠模型：連續(xù)30 d，每日將小鼠放于深15 cm，水溫25 ℃的水池中游泳，當(dāng)小鼠口鼻浸入水中表明其已達(dá)耐力極限時(shí)停止游泳；實(shí)驗(yàn)期間，單日給小鼠喂食白菜，每只15 g；雙日用10 mL·kg-1豬油脂灌胃，交叉喂養(yǎng)，自由飲水和食用飼料；在建模第15天時(shí)，使用刨花加煙葉混合煙熏小鼠，每天30 min，連續(xù)15 d；當(dāng)建模小鼠出現(xiàn)游泳耐力明顯下降、精神萎靡、毛發(fā)枯槁易脫、弓背、瞇眼以及消瘦、咳嗽、呼吸急促等癥狀時(shí)表明造模成功。在建模同時(shí)，Ga低、高劑量干預(yù)組連續(xù)分別腹腔注射給予5、10 mg·kg-1的Ga，空白對(duì)照組及模型組則給予等量的生理鹽水。末次給藥后的第2天，空腹12 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.2 RRTI模型小鼠肺功能測(cè)定

將上述各組小鼠使用水合氯醛(質(zhì)量濃度0.1 g·mL-1)腹腔注射麻醉，參考文獻(xiàn)的方法[8]測(cè)定各組小鼠肺功能：將小鼠固定在操作臺(tái)上，頸部做縱向切口后分離氣管，氣管上做倒“T”形切口，插入并固定氣管插管，接入生物信號(hào)采集系統(tǒng)呼吸傳感器，記錄呼吸曲線，測(cè)定小鼠肺功能0.1 s用力呼氣容積(forced expiratory volum in 0.1 second，F(xiàn)EV0.1)、0.2 s用力呼氣容積(forced expiratory volum in 0.2 second，F(xiàn)EV0.2)、用力呼氣流量25-75(forced expiratory flow，F(xiàn)EF 25-75)、最高呼氣流速(peak expiratory flow，PEF)。

2.3 RRTI模型小鼠血清中炎癥因子水平檢測(cè)

各組小鼠在肺功能檢測(cè)結(jié)束后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，分離血清，于4 ℃靜置20 min后，以2 000 r·min-1于4 ℃離心20 min，隨后抽取上清，分裝后置于-80 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平[9]。

2.4 模型肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞及炎癥因子水平檢測(cè)

各組小鼠在肺功能檢測(cè)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)的方法[10]，在氣管切口處插入氣管套管，用注射器抽取1 mL預(yù)冷的生理鹽水，緩慢注入小鼠肺泡內(nèi)，緩慢抽出并重復(fù)3次，將收集的肺泡灌洗液于4 ℃離心15 min(3 000 r·min-1)，取上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組小鼠肺泡灌洗液(alveolar lavage fluid，BALF) 中IL-1β、TNF-α、IL-4的表達(dá)水平；離心后的下層沉淀用生理鹽水稀釋后涂在載玻片上，采用瑞士-吉姆薩染色分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的數(shù)量。

2.5 RRTI模型小鼠肺組織病理學(xué)觀察

在肺泡灌洗液收集結(jié)束后，處死小鼠，分離肺組織，參考文獻(xiàn)的方法[11]進(jìn)行蘇木素精及伊紅(HE)染色：體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素精及伊紅染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察支氣管、肺組織形態(tài)學(xué)及病理學(xué)改變，并進(jìn)行圖像采集。

2.6 模型肺組織NF-κB/IRF3信號(hào)通路蛋白測(cè)定

分離上述各組小鼠的肺部組織，參考文獻(xiàn)的方法[12]制備肺組織勻漿，RIPA裂解后提取肺組織總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后常規(guī)上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后依次加入兔源單克隆NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、IRF3(1∶1 000)、p-IRF3(1∶1 000)一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)志羊抗兔二抗(1∶2 000)，化學(xué)底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析，采用Image-QuaNT軟件測(cè)量其光密度，以各GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Ga對(duì)模型小鼠肺功能的影響

與空白對(duì)照組比較，RRTI模型組的FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF均顯著降低(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組的FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF均顯著升高(P<0.05)，Ga高劑量組較低劑量組上述指標(biāo)顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較

3.2 Ga對(duì)模型小鼠肺組織病理學(xué)的影響

空白對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小均勻，氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤。RRTI模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡壁塌陷，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，支氣管黏膜上皮可見大量杯狀細(xì)胞增生，肺泡間質(zhì)及氣道內(nèi)存在大量炎性細(xì)胞浸潤，腔內(nèi)可見明顯的黏液。Ga干預(yù)組小鼠肺組織損傷較模型組明顯減輕，尤其Ga高劑量組肺泡完整性較好，肺泡融合范圍明顯縮小，肺間質(zhì)及氣道炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，但仍然存在少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

注：A.空白對(duì)照組；B.RRTI模型組；C.Ga低劑量組；D.Ga高劑量組。

3.3 Ga對(duì)模型小鼠炎癥因子水平的影響

與空白對(duì)照組比較，RRTI模型組血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，Ga高劑量組較低劑量組上述指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠炎癥因子水平的比較

3.4 Ga對(duì)模型小鼠肺泡灌洗液炎性細(xì)胞數(shù)量的影響

與空白對(duì)照組比較，RRTI模型組肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著增加(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著減少(P<0.05)，Ga低、高劑量2組間上述指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ga高劑量組較低劑量組肺泡灌洗液中的上述炎性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠炎性細(xì)胞數(shù)量的比較

3.5 Ga對(duì)模型小鼠NF-κB/IRF3信號(hào)通路的影響

與空白對(duì)照組比較，RRTI模型組肺組織中p-IRF3/IRF3、p-NF-κB p65/NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組肺組織中p-IRF3/IRF3、p-NF-κB p65/NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，Ga高劑量組較低劑量組肺組織中上述通路蛋白的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠NF-κB/IRF3信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

4 討論

Ga可通過Nrf-2-Keap1抗氧化系統(tǒng)有效抑制慢性阻塞性肺病小鼠氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)Ga可降低哮喘小鼠多種炎癥因子的表達(dá)，減輕哮喘小鼠氣道炎癥，改善慢性阻塞性肺病小鼠和哮喘小鼠的呼吸道癥狀[13-14]。在本研究中，Ga能明顯改善RRTI模型小鼠FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF等肺功能指標(biāo)，病理學(xué)結(jié)果顯示，Ga干預(yù)組小鼠肺泡融合范圍明顯縮小，肺間質(zhì)及氣道炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，表明Ga能明顯降低RRTI模型小鼠氣道受阻的程度，改善肺功能。因此，Ga對(duì)于改善反復(fù)呼吸道感染的肺功能同樣具有較好的療效。

小兒反復(fù)呼吸道感染可伴發(fā)呼吸道多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)的釋放，明顯存在嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤，其中嗜酸性粒細(xì)胞還可通過釋放前炎癥介質(zhì)和細(xì)胞毒性介質(zhì)來調(diào)節(jié)氣道炎癥[15-16]。TNF-α作為一種強(qiáng)有力的致炎癥因子，可以刺激呼吸道中白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，并上調(diào)其他致炎細(xì)胞因子的表達(dá)[17]；IL-1β及IL-4作為人體內(nèi)重要的前炎癥細(xì)胞因子，可激活和募集上述炎癥細(xì)胞，加重人體呼吸道的炎癥反應(yīng)[18]；在本研究中，Ga能夠明顯減少RRTI模型小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)量，顯著降低血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-4的水平，表明Ga能明顯抑制RRTI模型小鼠氣道炎癥，減少炎癥細(xì)胞浸潤，緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)和因炎癥誘導(dǎo)的肺損傷。

反復(fù)呼吸道感染存在的炎癥反應(yīng)與NF-κB/IRF-3介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)途徑有關(guān)，多種呼吸道感染物可激活I(lǐng)RF-3和 NF-κB信號(hào)，促使下游促炎因子的過度表達(dá)和釋放，增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)的合成，從而影響氣道炎癥反應(yīng)[19-20]。研究顯示，柴胡提取物可通過抑制NF-κB信號(hào)減少IL-1β、 IL-4、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生和聚集，從而改善哮喘小鼠的呼吸道炎癥[21]。在本研究中，RRTI模型小鼠均存在NF-κB和IRF3的活化，表明RRTI模型小鼠的氣道炎癥與NF-κB/IRF-3的異常激活有關(guān)；在給予Ga干預(yù)后，NF-κB和IRF3的活化均受到抑制，同時(shí)IL-1β、TNF-α、IL-4等炎癥因子的水平明顯降低，表明Ga對(duì)RRTI模型小鼠氣道炎癥的緩解作用與抑制NF-κB/IRF-3信號(hào)通路、減少炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。

綜上所述，Ga可改善RRTI模型小鼠肺功能、減輕炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB/IRF-3信號(hào)通路、降低炎癥因子水平和減少炎性細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。