袁紅芹，王榮春，段秀英，王夢婷，陳錫強*

1.陜西步長制藥有限公司，咸陽 712000；2.齊魯工業(yè)大學生物研究所，濟南 250103；3.陜西國際商貿(mào)學院，西安 710075；4.山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室，濟南 250103

惡性腫瘤是一類常見疾病，具有細胞分化和增殖異常、浸潤性及轉(zhuǎn)移性等生物學特征，已成為世界性難題。抑制血管生成是抗腫瘤的重要防治手段之一[1-3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGFR)在新生血管的生成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]，其中VEGFR2是核心調(diào)控因子，抑制VEGFR2可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，是抗腫瘤的重要機制[5]。

目前腫瘤血管新生過程參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的研究已取得顯著進展，臨床研究已證實， 抑制內(nèi)皮細胞VEGF信號通路可作為治療腫瘤的策略[6]。斑馬魚由于具有與人類基因組同源性較高、個體小、可大規(guī)模快速繁殖、胚體透明易于觀察，以及成本低等優(yōu)勢，已經(jīng)在抗腫瘤藥物研發(fā)和臨床治療研究中有著廣泛的應用[7]，由于斑馬魚早期免疫功能缺失因而容易成瘤，還可以利用斑馬魚的成像能力進行體內(nèi)深層次的研究[8]。新綠原酸(5-CQA)是廣泛分布于中藥材中的活性成分，研究表明5-CQA具有廣泛的抗腫瘤活性，包括抗氧化、抗炎等活性[9-10]，本研究利用體外細胞模型和斑馬魚模型，考察5-CQA對腫瘤血管生成的影響，并研究其抗腫瘤作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州安泰凈化消毒設備廠)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；IX51型倒置顯微鏡、SZX61型體視熒光顯微鏡和FV1000型激光共聚焦顯微鏡均購自奧利巴斯有限公司；ZGENE biopco 1500型微量注射儀(力鈞生物科技有限公司)；HPG 280BX型光照培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子科技公司)；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設備(北京愛生科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸(質(zhì)量分數(shù)≥96.5%，南通飛宇生物科技有限公司)；基質(zhì)膠、DMEM高糖培養(yǎng)基和新鮮胎牛血清均購自美國Gibco公司；鏈霉蛋白酶E、Tricaine均購自北京索萊寶科技有限公司；實時定量熒光PCR試劑盒SYBR Primix ExTaqTM(Takara公司)。

1.3 材料

HUVEC購自 ATCC 公司；人乳腺管癌細胞T-47D由聊城大學嚴守升博士提供；野生型斑馬魚、AB品系斑馬魚和TG(flk1:EGFR)血管熒光品系由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供；SD大鼠由山東濟南朋悅實驗動物有限公司提供[SCXK(魯)20190003]。本研究經(jīng)山東省科學院生物研究所實驗動物福利倫理委員會審查并批準。

2 方法

2.1 5-CQA對HUVEC增殖的影響

取處于對數(shù)生長期的HUVEC，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個·mL-1，每孔100 μL接種于96孔板，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每個劑量設置3個復孔， 分別設置空白對照組、5-CQA不同梯度濃度組(按照0～320 μmol·L-1梯度設置)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育2 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)基，加入DMSO置于脫色搖床20 min，吸取上清移入96孔板，用全自動酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度值(A)。

2.2 5-CQA對HUVEC遷移能力的影響

預先在6孔板底部畫上標記線，將HUVEC收集計數(shù)后，按每孔4×105個細胞的密度接種于 6 孔板。待細胞生長鋪滿皿底后，用已消毒的槍頭沿縱軸劃線，用PBS反復清洗2次，除去殘留漂浮細胞，分別加入無血清的不同濃度的5-CQA(2、4、8 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)，同時設置對照組。12 h后于倒置顯微鏡下觀察和記錄HUVEC的遷移情況，實驗重復3次，取平均值。

2.3 PCR檢測HUVEC血管相關(guān)基因的表達

將HUVEC收集、計數(shù)后，按每孔4×105個細胞的密度接種于6孔板。待細胞貼壁后，加入不同濃度的5-CQA(28、56、112 μmol·L-1)并設置對照組，48 h后收集細胞，依據(jù)Trizol RNA標準分離方法抽提RNA，采用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參。反應體系：cDNA 4 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，加雙蒸水使總體積為20 μL。反應條件:預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 35 s。反應終止后，基因表達水平用2-△△Ct計算，實驗重復3次，取平均值。

表1 引物序列

2.4 5-CQA對大鼠動脈環(huán)微血管生成的影響

檢測5-CQA對大鼠動脈環(huán)血管生成的影響參照NICOSIA R F等[11]的方法進行并加以改進。取4周SD雄性大鼠2只，適應性飼養(yǎng)3 d，麻醉后處死、解剖，取出其主動脈，用預冷PBS清洗并剔除結(jié)締組織，剪成面積約為1 mm2的動脈環(huán)，加入已預制混合膠的48孔板中，分別加入陽性藥PTK787和不同濃度的5-CQA，平放動脈環(huán)后置于CO2培養(yǎng)箱中，40 min后加入0.2 mL完全培養(yǎng)基，每2～3 d更換1次含藥培養(yǎng)基，第5天用倒置顯微鏡觀察動脈內(nèi)皮細胞和新生血管的生成情況，拍照記錄，用Image J軟件處理圖像。

2.5 5-CQA對斑馬魚血管生成模型的影響

斑馬魚飼養(yǎng)方法、取卵方法和移植瘤的造模方法參照已發(fā)表文獻[12-13]。取健康發(fā)育的TG(flk1:EGFR)斑馬魚24 h受精卵，用質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的鏈酶蛋白酶E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入24孔培養(yǎng)板中，每孔12～14枚，每次每組設2個重復孔，用不同濃度的5-CQA處理孵育斑馬魚，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。48 h受精后于熒光顯微鏡下觀察，計算節(jié)間血管生成長度，并觀察胚胎死亡或畸形情況。

將斑馬魚移植瘤模型T-47D細胞置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在無菌條件下將培養(yǎng)瓶中的T-47D細胞除去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，胰酶消化后加入含少量血清的培養(yǎng)基終止其消化，離心后更換新的培養(yǎng)基，每1 mL細胞懸液加入活細胞染色劑CM-DiL 7.5 μL，37 ℃孵育5 min，于4 ℃孵育15 min，離心棄上清，PBS清洗2次后加入無血清培養(yǎng)基重懸，鏡下調(diào)整細胞密度至1×106個·mL-1。

在受精卵發(fā)育48 h后，在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入6孔培養(yǎng)板中，并進行顯微注射，注射體積5 nL，4 h后在熒光倒置顯微鏡下挑選注射部位一致的斑馬魚，并加藥處理，每孔15枚，設置正常對照組、模型組、224 μmol·L-15-CQA組，然后置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。48 h后將各組胚胎麻醉后用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，并統(tǒng)計熒光面積。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 MTT結(jié)果

與對照組比較，經(jīng)5-CQA處理24 h后的細胞存活率明顯降低，在320 μmol·L-1時可顯著抑制細胞的增殖(P<0.05)，320 μmol·L-1及以下濃度對HUVEC的增殖無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 5-CQA對HUVEC增殖的影響

3.2 5-CQA對 HUVEC體外遷移能力的影響

用不同濃度5-CQA處理HUVEC 12 h，鏡下可見大量細胞從劃痕邊緣向空白區(qū)域遷移，其中經(jīng)5-CQA處理的HUVEC向空白區(qū)域遷移的距離較對照組明顯縮短，且細胞遷移的距離隨著5-CQA濃度的增加而縮短，見表3，表明5-CQA能夠抑制HUVEC體外遷移能力并呈劑量依賴性。

表3 5-CQA對HUVEC遷移的影響

3.3 5-CQA對HUVEC成血管相關(guān)基因表達的影響

用不同濃度5-CQA(28、56、112 μmol·L-1)處理細胞48 h，按2-△△Ct計算其VEGF、bFGF基因的表達量，與對照組相比，5-CQA可顯著抑制HUVEC中 VEGF、bFGF mRNA的表達量，見表4，表明5-CQA可通過抑制VEGF、bFGF基因的表達，抑制HUVEC成血管化并呈劑量依賴性。

表4 5-CQA對HUVEC中血管相關(guān)基因表達的影響

3.4 5-CQA對大鼠動脈環(huán)模型的影響

與對照組相比，PTK787組的微血管形成被顯著抑制(P<0.001)；與對照組比較，56、112 μmol·L-15-CQA組的微血管形成被顯著抑制(P<0.05，P<0.01)，且具有明顯的劑量依賴性，28 μmol·L-15-CQA組的微血管無明顯變化，見表5、圖1。

表5 5-CQA對大鼠動脈環(huán)模型的影響

3.5 5-CQA對斑馬魚血管生成模型的影響

對照組節(jié)間血管完整，無熒光缺失。與對照組相比，陽性藥PTK787組節(jié)間血管基本消失(P<0.001)，表明陽性對照在此條件下具有明顯活性。與PTK787組相比，224 μmol·L-15-CQA組的血管長度總值顯著降低。5-CQA各組呈現(xiàn)出熒光血管缺失的情況，與對照組比較，56 μmol·L-15-CQA組與112 μmol·L-15-CQA組的節(jié)間血管總長度明顯縮短(圖2A)(P<0.01)；在斑馬魚移植瘤模型中(圖2B)，可以觀察到移植瘤組SIV網(wǎng)狀增加，分支增多，熒光明顯增強，SIV的A值與對照組有顯著性差異(P<0.01)，224 μmol·L-15-CQA組出現(xiàn)SIV生長缺失，與模型組比較SIV熒光A值有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果見表6。

注：A.對照組；B.PTK787組；C.5-CQA 28 μmol·L-1組；D.5-CQA 56 μmol·L-1組；E.5-CQA 112 μmol·L-1組。

注：A.5-CQA對轉(zhuǎn)基因熒光血管斑馬魚模型血管生成的影響；a.對照組；b.PTK787組；c.5-CQA 28 μmol·L-1組；d.5-CQA 56 μmol·L-1組；e.5-CQA 112 μmol·L-1組；B.5-CQA對轉(zhuǎn)基因熒光血管斑馬魚移植瘤模型腸下靜脈的影響；a.明場對照組；b.熒光血管圖；c.對照組；d.移植瘤組；e.移植瘤+5-CQA 224 μmol·L-1組。箭頭所示為紅色腫瘤細胞；方框所示腸下靜脈區(qū)域。

4 討論

5-CQA是咖啡?？鼘幩嵯盗谢衔镏械囊环N，該化合物在植物中的分布非常廣泛[14]，是中藥材金銀花、杜仲的主要活性成分，文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)該類化合物具有廣泛的藥理活性，可通過抗氧化、抗炎和誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤的作用，但5-CQA抑制血管生成的作用尚未見報道。內(nèi)皮細胞的遷移是血管新生的重要階段，本研究結(jié)果表明，5-CQA不僅可以顯著抑制HUVEC的增殖，并且對其遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴性。眾多生長因子可調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及分化，從而促進生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下的血管新生，其中最重要的生長因子是血管內(nèi)皮細胞因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[15]。VEGF參與血管內(nèi)皮細胞中多種生物學狀態(tài)的調(diào)控，bFGF可與內(nèi)皮細胞表面受體直接結(jié)合，誘導內(nèi)皮細胞遷移、增殖以及蛋白酶分泌[16]。本研究發(fā)現(xiàn)5-CQA通過抑制內(nèi)皮細胞中VEGF、 bFGF mRNA的表達從而發(fā)揮抑制血管生成的作用。

表6 5-CQA對轉(zhuǎn)基因熒光血管斑馬魚移植瘤模型腸下靜脈的影響

本研究利用斑馬魚模型的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)5-CQA具有抑制血管生成的活性。研究結(jié)果顯示，在不影響HUVEC增殖的條件下，112 μmol·L-1的5-CQA對大鼠動脈環(huán)微血管生成、斑馬魚的節(jié)間血管模型和移植瘤引起的SIV增生具有明顯的抑制作用。

血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)是內(nèi)皮細胞中VEGF誘導的信號轉(zhuǎn)導的主要受體，在內(nèi)皮細胞參與血管增殖和出芽步驟中起重要的調(diào)控作用[17-18]。綠原酸類化合物是由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(quinic acid)形成的縮酚酸，近年的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸具有抑制血管生成和間接抑制VEGFR2表達的作用[19]。在本研究中，5-CQA能夠引起轉(zhuǎn)基因斑馬魚/移植瘤腸下靜脈VEGFR2(flk1)熒光血管的缺失，表明5-CQA具有抑制血管生成的作用，其作用機制與抑制斑馬魚VEGFR2的表達有關(guān)。

雖然CQA類化合物抗腫瘤活性一直是當今研究的熱點，但大部分集中在新靶點及體外研究，缺乏體內(nèi)研究。本研究前期利用斑馬魚模型可視化和高通量的特性，完成了咖啡酸奎寧酸系列化合物的初篩，并進行斑馬魚模型的體內(nèi)活性研究[20]，報道了5-CQA抑制血管生成的作用，表明5-CQA可作為潛在抗腫瘤候選天然化合物。