陶 冶，張 瑱，周水勇，衛(wèi)艷萍

1.鄭州人民醫(yī)院整形外科，鄭州 450003；2.焦作市人民醫(yī)院皮膚科，焦作 454002

增生性瘢痕(HS)是創(chuàng)傷修復(fù)的必然產(chǎn)物，嚴(yán)重影響機(jī)體的正常功能及美觀[1]。目前普遍采用的治療方法有激光燒灼、冷凍、放射、藥物注射等。丹參酮是從傳統(tǒng)中藥丹參根中提取的一類(lèi)脂溶性二萜類(lèi)成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制血小板聚集、保護(hù)心腦血管等作用[2]。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是丹參的主要有效成分之一，具有明顯的抗炎作用[3]，本研究構(gòu)建大鼠背部皮膚創(chuàng)面動(dòng)物模型，探討Tan ⅡA對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合瘢痕增生的抑制作用及可能的機(jī)制，為T(mén)an ⅡA相關(guān)藥物的研發(fā)及創(chuàng)面愈合的臨床治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7500HT型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；PowerPac電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Cheni Doc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；RM2235型徠卡切片機(jī)(德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)。

1.2 試藥

Tan ⅡA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(上海欣百諾生物科技有限公司)；白介素-10(IL-10)、粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，10周齡，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2019-0009。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

2 方法

2.1 大鼠模型建立

取96只大鼠建立創(chuàng)面動(dòng)物模型。用30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉大鼠，根據(jù)陳志勇等[4]的方法并加以改進(jìn)，以俯臥位固定大鼠，剔除背部被毛，酒精消毒，用經(jīng)消毒的打孔器在脊柱兩側(cè)制造2×2個(gè)直徑為10 mm的圓形創(chuàng)口，間隔1 cm，創(chuàng)口深及筋膜層，裸露不縫合，分籠飼養(yǎng)，不禁食水，創(chuàng)面自然愈合。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及Tan ⅡA低、中和高劑量組，各24只，剩余24只未建立創(chuàng)面模型的大鼠作為對(duì)照組。

2.2 干預(yù)方法

Tan ⅡA溶于二甲基亞砜(DMSO)，術(shù)后30 min Tan ⅡA低、中和高劑量組分別按100、200、300 mg·kg-1劑量溶于DMSO，腹腔注射10 mL，對(duì)照組、模型組腹腔注射DMSO 10 mL[5]。每日1次，連續(xù)處理14 d。

2.3 一般指標(biāo)觀察

第3、7和14天注射后1 h，每組各取3只大鼠，用滌綸投影薄膜覆蓋大鼠創(chuàng)面，掃描圖像計(jì)算創(chuàng)面面積，作為愈合面積。并記錄各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間，求平均值。

2.4 組織學(xué)觀察

分別于第3、7和14天注射后1 h，每組各取5只大鼠，用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉，模型組、Tan ⅡA各劑量組無(wú)菌剪取創(chuàng)面組織，對(duì)照組在脊柱兩側(cè)切取同等面積皮膚，用質(zhì)量濃度100 g·L-1中性甲醛固定48 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋后，制作4 μm的連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，于顯微鏡下觀察瘢痕組織病理學(xué)變化，計(jì)算瘢痕增生指數(shù)(hyperplasia index, HI)。HI=瘢痕最高點(diǎn)到軟骨的垂直距離/正常皮膚到軟骨的距離。計(jì)數(shù)瘢痕中單位面積的成纖維細(xì)胞數(shù)量(number of fibroblasts in unit area, NA)。

2.5 ELISA檢測(cè)TGF-β1、TNF-α水平

分別于第3、7和14天注射后1 h，無(wú)菌取各組8只大鼠創(chuàng)面組織50 mg，加入PBS 1 mL勻漿，以8 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(A)，根據(jù)樣品吸光度值計(jì)算樣品TGF-β1、TNF-α的質(zhì)量濃度。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

分別于第3、7和14天注射后1 h，無(wú)菌取各組8只大鼠創(chuàng)面組織置于液氮中研磨并低溫保存，各組取50 mg創(chuàng)面組織用Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA質(zhì)量及質(zhì)量濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA，嚴(yán)格按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在熒光定量PCR儀上檢測(cè)IL-10和GM-CSF mRNA表達(dá)水平的變化。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，加DEPC水定容至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)；以2-△△CT為目的基因IL-10、GM-CSF的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取各組2.6項(xiàng)下低溫保存的創(chuàng)面組織100 mg，加入RIPA 0.6 mL勻漿并搖勻，靜置5 min，重復(fù)3次，于離心機(jī)離心10 min(4 ℃, 12 000 r·min-1)，取上清用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取樣本20 μg與等量上樣緩沖液混勻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V電轉(zhuǎn)30 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入適量封閉液封閉2 h(室溫)，將膜放入1∶1 000稀釋的IL-10、GM-CSF一抗中，置于搖床中孵育過(guò)夜(4 ℃)，TBST洗膜3次×10 min，放入1∶2 000稀釋的二抗中，置于搖床中孵育1 h(室溫)，TBST洗膜3次×10 min，將PVDF膜置于顯影區(qū)，均勻滴加顯影液，用濾紙吸除PVDF膜周邊多余的顯影液，設(shè)置顯影條件，于暗室中進(jìn)行曝光、顯影，用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 創(chuàng)面愈合面積、愈合時(shí)間比較

Tan ⅡA不同劑量組創(chuàng)面愈合時(shí)間均短于模型組(P<0.05)；注射3、7和14 d后，Tan ⅡA不同劑量組愈合面積大于模型組(P<0.05)；創(chuàng)面愈合面積與Tan ⅡA呈劑量依賴(lài)性增加，愈合時(shí)間與Tan ⅡA呈劑量依賴(lài)性縮短(P<0.05)；各組愈合面積隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 創(chuàng)面組織愈合面積、愈合時(shí)間比較

3.2 創(chuàng)面病理組織學(xué)觀察及HI、NA比較

注射3、7 d Tan ⅡA不同劑量組HI、NA均較模型組增加(P<0.05)；注射14 d Tan ⅡA低、中劑量組HI、NA均較模型組降低，高劑量組較模型組升高(P<0.05)。與注射3 d相比，各組HI、NA增加，與注射7 d相比，Tan ⅡA低、中劑量組注射14 d時(shí)NA降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 創(chuàng)面組織HI、NA比較

對(duì)照組切口組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。注射3 d，模型組大鼠創(chuàng)面組織存在明顯水腫和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)增生成纖維細(xì)胞；Tan ⅡA低、中劑量組創(chuàng)面組織周?chē)休^多壞死組織、較少成纖維細(xì)胞增生并伴輕微水腫，存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Tan ⅡA高劑量組壞死組織較少，創(chuàng)面組織存在增生的成纖維細(xì)胞和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。注射7 d，模型組有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)膠原纖維增生并伴區(qū)域變性；Tan ⅡA低、中劑量組出現(xiàn)粗大的新生膠原纖維，其分布均勻但排列紊亂；Tan ⅡA高劑量組存在大量增生成纖維細(xì)胞，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，存在間質(zhì)膠原纖維增生。注射14 d，模型組大鼠可見(jiàn)排列紊亂的成纖維細(xì)胞，膠原纖維無(wú)明顯增生；Tan ⅡA低、中劑量組成纖維細(xì)胞減少、體積偏小，間質(zhì)存在少量排列無(wú)序的膠原纖維；Tan ⅡA高劑量組新生表皮角質(zhì)化明顯，存在大量成纖維細(xì)胞、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.Tan ⅡA低劑量組；D.Tan ⅡA中劑量組；E.Tan ⅡA高劑量組。

3.3 創(chuàng)面組織TGF-β1、TNF-α水平比較

注射3、7、14 d TanⅡA不同劑量組TGF-β1的水平均較模型組升高，TNF-α的水平較模型組降低(P<0.05)；Tan ⅡA劑量越高，TGF-β1水平越高，TNF-α水平越低(P<0.05)；Tan ⅡA不同劑量組TGF-β1、TNF-α水平隨TanⅡ A注射時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 創(chuàng)面組織TGF-β1、TNF-α水平比較

3.4 創(chuàng)面組織IL-10、GM-CSF mRNA表達(dá)水平比較

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同劑量組的IL-10、GM-CSF mRNA表達(dá)水平均較模型組上升(P<0.05)；Tan ⅡA的劑量越大，IL-10、GM-CSF mRNA的水平越高(P<0.05)；Tan ⅡA不同劑量組GM-CSF mRNA的水平隨Tan ⅡA注射時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，IL-10 mRNA的水平隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 創(chuàng)面組織IL-10、GM-CSF mRNA表達(dá)水平比較

3.5 創(chuàng)面組織IL-10、GM-CSF蛋白表達(dá)水平比較

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同劑量組IL-10、GM-CSF蛋白的表達(dá)水平較模型組升高(P<0.05)；TanⅡA的劑量越大，IL-10、GM-CSF蛋白的表達(dá)水平越高(P<0.05)；TanⅡA不同劑量組GM-CSF蛋白的表達(dá)水平隨TanⅡA注射時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，IL-10蛋白的表達(dá)水平隨注射時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖2。

表6 創(chuàng)面組織IL-10、GM-CSF蛋白水平比較

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.Tan ⅡA低劑量組；D.Tan ⅡA中劑量組；E.Tan ⅡA高劑量組。

4 討論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括止血、炎癥、增殖和重塑等階段[6]。增生性瘢痕是在某些異常因素的調(diào)控下，創(chuàng)面成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，膠原合成與分解的平衡被打破，細(xì)胞外基質(zhì)大量無(wú)序沉積于組織中形成。我國(guó)傳統(tǒng)中藥在治療瘢痕方面有著悠久的歷史[7]。中藥的傳統(tǒng)功效是藥效的理論依據(jù)，丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰等功效，可用于治療胸痹心痛、癥痕積聚、瘡瘍腫痛等癥[8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制膠原纖維產(chǎn)生和促進(jìn)纖維蛋白降解及抗炎、抗氧化等作用[9-10]。Tan ⅡA是丹參的重要活性成分，在對(duì)抗纖維化疾病和炎癥疾病中具有潛在的應(yīng)用前景，有望成為治療增生性瘢痕的藥物。

本研究結(jié)果顯示，Tan ⅡA各劑量組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間短于模型組，愈合面積大于模型組，表明Tan ⅡA可加快創(chuàng)面愈合，抑制創(chuàng)面增生性瘢痕的形成。Tan ⅡA各劑量組的HI、NA均較模型組顯著增加，表明Tan ⅡA促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)前中期成纖維細(xì)胞增殖以促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。HE染色結(jié)果顯示，注射3 d模型組大鼠創(chuàng)面組織存在明顯水腫和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)增生成纖維細(xì)胞；Tan ⅡA低、中劑量組有較少成纖維細(xì)胞增生；Tan ⅡA高劑量組存在大量增生成纖維細(xì)胞。注射7 d，Tan ⅡA高劑量組有大量增生成纖維細(xì)胞，存在間質(zhì)膠原纖維增生。注射14 d，Tan ⅡA高劑量組新生表皮角質(zhì)化明顯，存在大量成纖維細(xì)胞，表明Tan ⅡA可以通過(guò)成纖維細(xì)胞大量增生來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面組織更好、更快地愈合。由此推測(cè)，Tan ⅡA使得創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中成纖維細(xì)胞增生、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，并縮小愈合創(chuàng)面瘢痕面積，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。既往研究顯示，Tan ⅡA可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低血脂和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善非酒精性脂肪肝[11]。也有研究證實(shí)，Tan ⅡA在皮膚痤瘡中具有抗炎作用[12]。本研究在大鼠創(chuàng)面中也觀察到相似的結(jié)果，表明Tan ⅡA可能通過(guò)發(fā)揮抗炎作用進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

炎癥細(xì)胞可以通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子參與創(chuàng)面愈合。GM-CSF是一種多功能生長(zhǎng)因子，皮膚受到創(chuàng)傷時(shí)其會(huì)參與到創(chuàng)面愈合的多個(gè)階段[13-15]。GM-CSF可調(diào)控促進(jìn)生長(zhǎng)因子，如TGF等的生成，提高成纖維細(xì)胞增殖活性[16]。TGF-β1介導(dǎo)了多種組織纖維化反應(yīng)，通過(guò)刺激間質(zhì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)[17]，促進(jìn)皮膚傷口張力增加和創(chuàng)面局部纖維化，加速皮膚創(chuàng)傷愈合[18]。IL-10是減輕創(chuàng)面纖維化的重要因子[19]，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎因子的合成和釋放，抑制單核或巨噬細(xì)胞抗原、TNF-α受體的表達(dá)[20]。TNF-α通過(guò)提高中性粒細(xì)胞的吞噬功能而具有促進(jìn)炎癥細(xì)胞分化的作用[21]。在本研究中，注射3、7、14 d TanⅡA各劑量組TGF-β1、TNF-α的水平均較模型組顯著降低，IL-10、GM-CSF mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增加，表明Tan ⅡA可能是通過(guò)減輕炎性反應(yīng)、增加IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表達(dá)來(lái)抑制大鼠創(chuàng)面增生性瘢痕的產(chǎn)生、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的。

綜上所述，Tan ⅡA通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中成纖維細(xì)胞增生、減輕炎性反應(yīng)，使大鼠創(chuàng)面瘢痕更快、更好地愈合，減少創(chuàng)面愈合后瘢痕的產(chǎn)生，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用，為臨床治療創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。