邢雙麗，趙明娟，金 榮

焦作煤業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司中央醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二區(qū)，焦作 454100

間質(zhì)性肺病(interstitial lung diseaese, ILD)是一組具有不同病因、臨床、影像學(xué)和組織學(xué)表現(xiàn)的異質(zhì)性、彌漫性、實(shí)質(zhì)性肺疾病，間質(zhì)性肺炎(interstitial pneumonia, IP)是ILD最常見病型[1]。其中纖維化尤其是特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是IP最具侵襲性的形式之一，其特點(diǎn)是慢性進(jìn)行性纖維化破壞肺結(jié)構(gòu)并造成炎癥損傷，導(dǎo)致肺功能不全和呼吸衰竭[2]。作為一種轉(zhuǎn)錄依賴的調(diào)節(jié)機(jī)制，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin, mTOR complex 1, mTORC1)/轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)通路為自噬的復(fù)雜調(diào)控提供了新的見解[3]。冬蟲夏草提取物(cordyceps sinensis extract，CSE)可延緩大鼠肺纖維化的早期肺泡炎[4]，并可通過抗炎和抗氧化作用有效改善急性肺損傷[5]，本研究擬通過建立IP小鼠模型，觀察CSE的改善作用，并探討其可能作用機(jī)制，為IP的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Olympus光學(xué)顯微鏡購(gòu)自伯輝生物科技有限公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自北京華泰和合商貿(mào)有限公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司。

1.2 試藥

CSE(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購(gòu)自西安利時(shí)生物科技有限公司；博來(lái)霉素購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；Ⅰ型膠原酶和2.5 mg·mL-1胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Masson染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)及白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、自噬降解底物P62蛋白(autophagy degradation substrate p62 protein，p62)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、鼠源單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；mTORC1和磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(phosphorylated mammalian rapamycin target protein complex 1，p-mTORC1)和TFEB鼠源單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡雄性C57BL/6小鼠75只，體質(zhì)量為(30±5) g，由大冢(上海)藥物研究開發(fā)有限公司提供，許可證號(hào)為SYXK(滬)2019-002。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

24 ℃恒溫恒濕普通飼養(yǎng)，12 h光照與12 h黑暗交替，適應(yīng)1周后，隨機(jī)選取15只作為正常組，剩余60只小鼠均用于構(gòu)建間質(zhì)性肺炎模型。戊巴比妥鈉(2 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，單手固定小鼠保持頭上尾下豎立狀態(tài)，充分暴露鼻腔并緩慢滴注博來(lái)霉素(2 mg·kg-1，生理鹽水溶解)至充分進(jìn)入肺部，正常組小鼠鼻腔內(nèi)等量滴注生理鹽水。后將60只建模小鼠隨機(jī)分為4組，模型組、CSE低劑量組、CSE中劑量組及CSE高劑量組，每組各15只，次日給藥。CSE(生理鹽水溶解)低、中、高劑量組的灌服給藥量分別為20、40、80 mg·kg-1·d-1，每日1次，正常組和模型組小鼠均每日等量灌服生理鹽水0.5 mL。連續(xù)給藥28 d。

2.2 標(biāo)本采集與處理

末次給藥結(jié)束后，小鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(80 mg·kg-1)，處死，取肺組織檢測(cè)肺組織濕干質(zhì)量比(n=5)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)灌洗收集支氣管肺泡灌洗液用于ELISA檢測(cè)(n=5)；另取肺組織分別保存于體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛和液氮中，用于組織病理學(xué)染色觀察及Western blot檢測(cè)(n=5)。

2.3 檢測(cè)肺組織濕干質(zhì)量比

對(duì)各組肺組織進(jìn)行編號(hào)，濾紙吸除肺組織表面血液及水分，于電子天平上精確稱定質(zhì)量，即為濕質(zhì)量；后置于80 ℃的干燥箱中干燥48 h至肺組織質(zhì)量不再變化，再次稱定質(zhì)量即為干質(zhì)量。小鼠肺組織濕質(zhì)量(wet，W)/干質(zhì)量(dry，D)即W/D比值用于評(píng)價(jià)肺水腫程度。

2.4 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)量

小鼠處死后完全暴露氣管及肺組織，結(jié)扎主支氣管，并于氣管處作切口，插入18 G套管針并固定，冷PBS 0.6 mL緩慢灌洗左肺，30 s后抽出再打入，重復(fù)操作，保證液體提取率在90%以上。以2 500 r·min-1低溫離心5 min，取上清，保存于-80 ℃，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作步驟檢測(cè)各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)量。

2.5 HE染色

將固定24 h后的肺組織脫水、透明、浸蠟和包埋，并制成4 μm組織石蠟切片，根據(jù)染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇覆水，蘇木精染色，伊紅染色，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

2.6 Masson染色

制備4 μm石蠟切片脫蠟、水化，根據(jù)染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Weigert氏鐵蘇木素液染核，麗春紅染色，磷鉬酸處理，苯胺藍(lán)染色，分化，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察觀察肺組織纖維化情況并采集圖片。

2.7 TUNEL染色

4 μm石蠟切片干燥后，充分脫蠟，水化，細(xì)胞通透后加入預(yù)冷的TUNEL染液反應(yīng)，過氧化物酶封閉后與底物二氨基聯(lián)苯胺混合液反應(yīng)顯色后，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕色顆粒即表示染色陽(yáng)性，為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野。細(xì)胞凋亡率=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

2.8 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

取各組小鼠(n=5)新鮮肺組織，冷PBS清洗至無(wú)血跡，于無(wú)菌通風(fēng)廚內(nèi)分離細(xì)胞，剪碎肺組織，剔除血管及白色結(jié)締組織，轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)加適量胰蛋白酶(250 mg·mL-1)，于37 ℃消化10 min，過濾得濾渣，轉(zhuǎn)入加有Ⅰ型膠原酶的離心管內(nèi)，37 ℃繼續(xù)消化1 h，期間視組織消化情況緩慢搖晃離心管數(shù)次以充分消化，最后加入完全培養(yǎng)液終止消化。70 μm細(xì)胞篩過濾，收集濾液，以1 500 r·min-1離心5 min，去上清，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，以適當(dāng)密度接種到包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，洗脫未黏附細(xì)胞并收集，重新接種于包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，純化1～2次。后收集洗脫液并離心，小心棄去上清，利用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，以適當(dāng)密度接種，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，用于Western blot檢測(cè)。

2.9 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞并移入離心管，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，劇烈震蕩后離心，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(壓縮膠60 V，25 min；分離膠120 V，70 min)，轉(zhuǎn)膜(200 mA，120 min)，后將PVDF膜于脫脂乳(0.05 g·mL-1)37 ℃搖床內(nèi)封閉2 h，于稀釋后的一抗(1∶1 000)內(nèi)4 ℃孵育過夜；次日TBST洗膜，換液3～6次后于25 ℃搖床內(nèi)用稀釋后的二抗(1∶8 000)孵育2 h，TBST洗膜，換液3～6次，PVDF膜暗處浸潤(rùn)ECL顯影試劑2～3 min，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白mTORC1、p-mTORC1、TFEB、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、α-SMA與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)

與正常組比較，模型組肺組織W/D值顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，CSE低、中和高劑量組W/D值均顯著下降(P<0.05)；與CSE低劑量組比較，CSE中、高劑量組W/D值均顯著降低(P<0.05)；與CSE中劑量組比較，CSE高劑量組W/D值顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 小鼠肺組織W/D值

3.2 小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示，模型組肺組織灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，CSE低、中及高劑量組肺組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)；與CSE低劑量組比較，CSE中、高劑量組TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)；與CSE中劑量組比較，CSE高劑量組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

3.3 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞滲出，肺泡間隔未見增厚；模型組見有上皮細(xì)胞脫落，肺組織結(jié)構(gòu)不完整，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞滲出嚴(yán)重，肺泡壁增厚；CSE低、中和高劑量組小鼠間質(zhì)性肺炎肺組織中，結(jié)構(gòu)逐漸變得完整清晰、肺泡壁逐漸變薄，炎性細(xì)胞滲出均明顯減少。見圖1。

3.4 小鼠肺組織纖維化程度

Masson染色結(jié)果顯示，正常組肺組織完整、清晰，排列規(guī)則，無(wú)膠原纖維沉積；模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂不規(guī)則，膠原纖維藍(lán)色染色較深，纖維化嚴(yán)重；CSE低、中及高劑量組膠原纖維沉積較模型組均減少，藍(lán)色變淺，纖維化減弱，且肺泡結(jié)構(gòu)逐漸變得完整、清晰，見圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.CSE低劑量組；D.CSE中劑量組；E.CSE高劑量組。

注：A.正常組；B.模型組；C.CSE低劑量組；D.CSE中劑量組；E.CSE高劑量組。

3.5 小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況

與正常組比較，模型組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，CSE低、中及高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與CSE低劑量組比較，CSE中和高劑量組細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)；另CSE高劑量組中的細(xì)胞凋亡率顯著低于CSE中劑量組(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率

注：A.正常組；B.模型組；C.CSE低劑量組；D.CSE中劑量組；E.CSE高劑量組。

3.6 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，各組mTORC1總蛋白含量未見顯著改變，但與正常組比較，模型組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中p-mTORC1、p62及α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高，TFEB、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，CSE低、中和高劑量組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中p-mTORC1、p62及α-SMA水平均顯著降低，TFEB、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與CSE低劑量組比較，CSE中、高劑量組p-mTORC1、p62及α-SMA水平均顯著降低，TFEB、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與CSE中劑量組比較，CSE高劑量組p-mTORC1、p62及α-SMA蛋白水平顯著降低，TFEB、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

注：A.正常組；B.模型組；C.CSE低劑量組；D.CSE中劑量；E.CSE高劑量組。

4 討論

IPF的發(fā)病機(jī)制始于肺泡炎，其特征是肺實(shí)質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞積累并釋放細(xì)胞因子，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖并遷移到急性肺損傷區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌增強(qiáng)并沉積，最終引起肺纖維化[6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，肺泡上皮細(xì)胞，特別是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的功能障礙是纖維化發(fā)展的起點(diǎn)[7]。自噬是一種溶酶體介導(dǎo)的分解代謝過程，作為抵抗細(xì)胞應(yīng)激的生存機(jī)制，其在調(diào)控肺部炎癥和影響肺纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[8-9]，可清除肺纖維化時(shí)異常沉積的蛋白及受損的細(xì)胞器，并下調(diào)炎癥反應(yīng)；自噬功能障礙時(shí)可加快肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[10-11]。

博萊霉素是目前公認(rèn)的致肺纖維化藥物[12]，經(jīng)一次性鼻腔滴注博萊霉素后，小鼠出現(xiàn)肺臟水腫，并見有肺泡壁增厚、腔內(nèi)炎性細(xì)胞滲出及膠原纖維嚴(yán)重沉積、肺細(xì)胞大量凋亡，說(shuō)明成功建立間質(zhì)性肺炎模型。有研究表明，IL-6除作為促炎癥細(xì)胞因子外，還與纖維化反應(yīng)相關(guān)，可通過驅(qū)動(dòng)慢性炎癥和激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β途徑促進(jìn)纖維化[13]，巨噬細(xì)胞來(lái)源的IL-1β也可加重纖維化[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組中促炎因子TNF-α及IL-6、IL-1β水平均顯著升高，肺組織見有嚴(yán)重炎性及纖維化病理?yè)p傷，細(xì)胞凋亡率高；而經(jīng)CSE治療后，炎性反應(yīng)減輕，肺組織病理?yè)p傷及細(xì)胞凋亡情況得到顯著改善，且效果呈現(xiàn)一定的劑量性依賴，提示CSE對(duì)小鼠間質(zhì)性肺炎具有抗炎、抗纖維化作用。

自噬通常被認(rèn)為是真核生物發(fā)育過程中溶酶體依賴的自我降解途徑，與組織纖維化相關(guān)[15]，其活性的降低被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵過程[16]。LC3和p62蛋白可作為自噬的標(biāo)志物[17]，p62可與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合并與位于自噬小體內(nèi)膜上的LC3II蛋白形成復(fù)合物，一同被自噬溶酶體降解，當(dāng)LC3II/LC3I的表達(dá)水平降低時(shí)，大量p62在細(xì)胞中積聚，自噬受阻，從而導(dǎo)致自噬活性降低[18]，自噬不足會(huì)促進(jìn)肌成纖維蛋白標(biāo)記物α-SMA表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[19]而導(dǎo)致纖維化發(fā)展。mTORC1是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子，其通路的激活可抑制自噬，另外mTORC1也是TFEB活性的主要調(diào)控因子，TFEB的過表達(dá)可促進(jìn)自噬和溶酶體基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高溶酶體的降解能力[20]。本研究中結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中p-mTORC1、p62、α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高，TFEB、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示間質(zhì)性肺炎Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞自噬活性不足及纖維化；經(jīng)干預(yù)后，CSE可顯著降低p-mTORC1、p62、α-SMA蛋白表達(dá)水平，提高TFEB及LC3II/LC3I的表達(dá)，提示CSE可能通過抑制mTORC1活性促進(jìn)TFEB表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞自噬活性，發(fā)揮改善間質(zhì)性肺炎炎癥及纖維化病理癥狀的潛力。

綜上所述，CSE可減輕小鼠間質(zhì)性肺炎的病理?yè)p傷，降低促炎因子表達(dá)，改善肺臟纖維化，其機(jī)制可能與抑制mTORC1活性、促進(jìn)TFEB表達(dá)、進(jìn)而誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生有關(guān)，可為中藥治療間質(zhì)性肺炎提供一定參考依據(jù)。