沈洪麗， 張良東，郭連勝， 沈紅瑞， 張 梅

1.滄州市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，滄州 061000；2.滄州市中心醫(yī)院感染內(nèi)二科，滄州 061000；3.滄州市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，滄州 061000；4.滄州市人民醫(yī)院急診科，滄州 061000；5.滄州市傳染病醫(yī)院肝病六科，滄州 061000

肺炎是肺泡、肺間質(zhì)、中末氣道炎癥的統(tǒng)稱，重癥肺炎為其嚴(yán)重階段，致死率較高。肺炎的致病因素較多，以細(xì)菌感染為主，肺炎克雷伯菌肺炎是典型的細(xì)菌性肺炎。據(jù)報(bào)道[1]，炎性細(xì)胞因子釋放誘發(fā)的炎性反應(yīng)為肺炎主要病理?yè)p傷機(jī)制，故抗炎為治療肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎的第一要?jiǎng)?wù)。穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)菌感染性肺炎有特殊功效[2]。重癥肺炎發(fā)生、發(fā)展與免疫功能下降密切相關(guān)，林克武等[3]研究表明穿心蓮內(nèi)酯還有增強(qiáng)免疫功能的作用。ZELANTE T等[4]報(bào)道，在真菌感染的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校瑢?duì)免疫抵抗的正面和負(fù)面影響都?xì)w因于IL-23/Th17軸。故本研究擬建立肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠模型，分析穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠IL-23/Th17平衡的影響及其對(duì)肺部損傷的作用與機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.2 試藥

穿心蓮內(nèi)酯粉末(廣西昌洲天然藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)；地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024469，規(guī)格0.75 mg)；肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603)由廣州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供；FITC-CD4、FITC-IL-17單克隆抗體，均購(gòu)自法國(guó)IMMUNOTECH S.A.S公司；兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)、p-NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和p-IκBα、GAPDH一抗，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(海古朵生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，60只，7周齡，體質(zhì)量260～270 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于無(wú)菌環(huán)境，室溫為24～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，自然光照，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 造模、分組和干預(yù)

取50只大鼠建立肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠模型[5]：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，固定，頸部備皮消毒，取切口暴露上段氣管，注射400個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏姆窝卓死撞鷺?biāo)準(zhǔn)株混懸液0.5 mL，分多次注射。剩余10只作為健康組，注射等體積生理鹽水，注射后縫合切口，局部消毒。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠反應(yīng)遲緩、呆滯，胸廓快速運(yùn)動(dòng)，發(fā)生嚴(yán)重低氧血癥，胸部X線片顯現(xiàn)彌漫性滲出影。40只大鼠建模成功，隨機(jī)分為模型組、穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組各10只。建模后給藥：穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組分別灌胃0.5、1.0 mg·mL-1穿心蓮內(nèi)酯混懸液(臨用時(shí)取穿心蓮內(nèi)酯粉末，先用DMSO溶解成質(zhì)量濃度10 mg·mL-1，再用生理鹽水配制為實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃1.04 mg·kg-1地塞米松(用生理鹽水灌服)，健康組與模型組灌胃等體積生理鹽水。每日1次，連續(xù)干預(yù)7 d。

2.2 肺功能檢測(cè)

末次治療后，戊巴比妥鈉麻醉，固定，頸部正中取切口，暴露氣管，在第3、4氣管環(huán)中間取倒T切口插管。將大鼠置入體描箱，連接呼吸機(jī)，用AniRes 2005 軟件導(dǎo)出靜息通氣量、 氣道阻力比值。

2.3 肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比檢測(cè)

肺功能檢測(cè)后，麻醉，腹主動(dòng)脈采血，備用待測(cè)炎性細(xì)胞因子。脫頸處死大鼠，取右肺并沿血管、氣管走向切成10 mm厚小塊，選擇病灶明顯組織，一半裝入無(wú)菌離心管液氮冷凍，保存于-80 ℃待測(cè)Western blot，一半用40 g·L-1多聚甲醛固定。取左肺稱量肺濕質(zhì)量，置于80 ℃烘箱烘干至恒定質(zhì)量，稱量肺干質(zhì)量，計(jì)算肺濕干質(zhì)量比值。

2.4 ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-23、IL-17水平

取腹主動(dòng)脈血，室溫靜置2 h，4 ℃以1 500 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清，參考IL-23、IL-17 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)：常規(guī)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和樣品孔，加樣，溫育，加酶標(biāo)試劑后，加入顯色劑，終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-23、IL-17質(zhì)量濃度。

2.5 HE染色觀察大鼠肺病理學(xué)

取多聚甲醛固定的右肺組織，固定24 h后常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，按HE試劑盒說(shuō)明書(shū)染色：二甲苯透明，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗，蘇木精染色，流水緩沖，乙醇脫術(shù)，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，并拍照。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17細(xì)胞比例

取腹主動(dòng)脈血加紅細(xì)胞裂解液，冰浴30 min，以3 000 r·min-1離心15 min，離心半徑為10 cm，收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS洗滌后重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，加入FITC-CD4、FITC-IL-17單克隆抗體，混勻后避光孵育30 min，以3 000 r·min-1離心5 min，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀，重懸，混勻后上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、CD4細(xì)胞百分比，計(jì)算其比值。

2.7 檢測(cè)大鼠肺組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取液氮冷凍的肺組織，冰上研磨呈粉末，加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，用Bradford調(diào)整各組蛋白質(zhì)量濃度一致后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα和GAPDH一抗(稀釋1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(稀釋1∶2 000)，室溫封閉1 h，滴加ECL暗室曝光顯影，計(jì)算目標(biāo)蛋白灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠肺功能指標(biāo)

與健康組比較，模型組靜息通氣量、氣道阻力比值較低(P<0.05)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠靜息通氣量、氣道阻力比值比較

3.2 大鼠肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比

與健康組比較，模型組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較高(P<0.05)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比

3.3 大鼠血清IL-23、IL-17水平

與健康組比較，模型組血清IL-23、IL-17水平較高(P<0.05)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-23、IL-17水平

3.4 大鼠肺病理學(xué)

健康組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔變實(shí)，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與漿液性滲出；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的肺泡結(jié)構(gòu)完整性、形態(tài)均改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見(jiàn)圖1。

3.5 大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例

與健康組比較，模型組大鼠外周血Th17細(xì)胞比例較高(P<0.05)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠外周血Th17細(xì)胞比例較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞比例較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較，陽(yáng)性對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞比例較低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠外周血Th17細(xì)胞比例

與健康組比較，模型組大鼠肺組織p-IκBα蛋白表達(dá)水平較低，p-NF-κB蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組肺組織p-IκBα蛋白表達(dá)水平較高，p-NF-κB蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)；與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組肺組織p-IκBα蛋白表達(dá)水平較高，p-NF-κB蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)。各組IκBα、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5、圖2。

表5 各組大鼠肺組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

注：A.健康組；B.模型組；C.穿心蓮內(nèi)酯低劑量組；D.穿心蓮內(nèi)酯高劑量組。

4 討論

克雷伯桿菌為最早發(fā)現(xiàn)的可誘發(fā)肺炎的革蘭氏陰性菌，可通過(guò)呼吸道感染而引起肺炎，病理表現(xiàn)為肺泡擴(kuò)張、炎性細(xì)胞增多[6]。克雷伯桿菌肺炎存在高耐藥、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，目前尚無(wú)特效治療藥物。穿心蓮內(nèi)酯是從爵床科植物穿心蓮中提取獲得的二萜內(nèi)酯類化合物，有抗炎、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤等功效，且毒性低、價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于各種炎癥疾病治療中，效果確切[7-8]。TAO Z等[9]研究表明抗炎、調(diào)節(jié)免疫是應(yīng)對(duì)重癥肺炎的關(guān)鍵，故以穿心蓮內(nèi)酯為實(shí)驗(yàn)藥物，分析其對(duì)肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠的治療作用及其機(jī)制，為該病臨床治療提供借鑒。

靜息通氣量、氣道阻力比值為臨床常用的肺功能檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果提示，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組靜息通氣量、氣道阻力比值升高，提示穿心蓮內(nèi)酯可改善大鼠肺功能。HE染色觀察大鼠肺組織病理發(fā)現(xiàn)，與健康組比較，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺泡腔有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示重癥肺炎可造成嚴(yán)重肺部損傷，表現(xiàn)為肺部含水量增加。觀察各組大鼠肺濕干質(zhì)量比發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組的肺濕干質(zhì)量比較低，且病理學(xué)表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改善，提示穿心蓮內(nèi)酯可減輕肺組織損傷，減輕肺泡腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IL-23、IL-17均屬于白細(xì)胞介素，IL-17是CD4 Th17、CD8 Tc17細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子，在炎性環(huán)境中，CD4+T細(xì)胞將分化成Th17表型，產(chǎn)生IL-17，而IL-17的產(chǎn)生需由IL-23啟動(dòng)[10-11]。故IL-23/IL-17軸在炎癥產(chǎn)生發(fā)展中相輔相成。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組大鼠血清IL-23、IL-17水平均較低，提示穿心蓮內(nèi)酯有抗炎作用，這可能是其減輕大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的主要原因。Th17為CD4+的獨(dú)特譜系輔助性T細(xì)胞，可在IL-23刺激下產(chǎn)生多種炎癥趨化因子、細(xì)胞因子，包括IL-17，在宿主免疫反應(yīng)中扮演重要角色，主要參與炎癥反應(yīng)自身免疫性疾病[12-13]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道[14-15]，Th17細(xì)胞與多種肺部疾病存在相關(guān)性，其作為前炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)菌等引起的重癥肺炎中可能有致病作用。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組外周血Th17細(xì)胞比例較低，提示穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)抗炎調(diào)節(jié)大鼠免疫功能。

NF-κB是一種可特異性結(jié)合基因增強(qiáng)子或啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子，在正常情況下與IκBα結(jié)合，以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)；若受到刺激，IκBα降解，釋放NF-κB p65，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因表達(dá)[16-18]。IκBα為NF-κB抑制蛋白，是IκB家族最早克隆出的、最成熟的蛋白，可在細(xì)胞因子、病毒蛋白等刺激因子刺激細(xì)胞時(shí)，級(jí)聯(lián)信號(hào)快速激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物，p-IκBα21、21位賴氨酸發(fā)生泛素化降解，脫離NF-κB，從而使NF-κB核定位信號(hào)區(qū)暴露，引起NF-κB活化、核轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-17、IL-23等釋放，誘發(fā)炎癥[19-20]。結(jié)果提示，與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組大鼠肺組織IκBα蛋白表達(dá)上調(diào)，NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過(guò)上調(diào)IκBα蛋白、下調(diào)NF-κB蛋白發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯可介導(dǎo)IL-23/Th17平衡，增強(qiáng)肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠免疫功能，并減輕肺部損傷，這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IκBα/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。