沈洪麗, 張良東,郭連勝, 沈紅瑞, 張 梅
1.滄州市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科,滄州 061000;2.滄州市中心醫(yī)院感染內(nèi)二科,滄州 061000;3.滄州市傳染病醫(yī)院檢驗科,滄州 061000;4.滄州市人民醫(yī)院急診科,滄州 061000;5.滄州市傳染病醫(yī)院肝病六科,滄州 061000
肺炎是肺泡、肺間質(zhì)、中末氣道炎癥的統(tǒng)稱,重癥肺炎為其嚴重階段,致死率較高。肺炎的致病因素較多,以細菌感染為主,肺炎克雷伯菌肺炎是典型的細菌性肺炎。據(jù)報道[1],炎性細胞因子釋放誘發(fā)的炎性反應(yīng)為肺炎主要病理損傷機制,故抗炎為治療肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎的第一要務(wù)。穿心蓮內(nèi)酯對細菌感染性肺炎有特殊功效[2]。重癥肺炎發(fā)生、發(fā)展與免疫功能下降密切相關(guān),林克武等[3]研究表明穿心蓮內(nèi)酯還有增強免疫功能的作用。ZELANTE T等[4]報道,在真菌感染的實驗?zāi)P椭?,對免疫抵抗的正面和負面影響都歸因于IL-23/Th17軸。故本研究擬建立肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠模型,分析穿心蓮內(nèi)酯對大鼠IL-23/Th17平衡的影響及其對肺部損傷的作用與機制。
CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。
穿心蓮內(nèi)酯粉末(廣西昌洲天然藥業(yè)有限公司,質(zhì)量分數(shù)98%);地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團有限公司,國藥準字H44024469,規(guī)格0.75 mg);肺炎克雷伯菌標準株(ATCC700603)由廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科細菌室提供;FITC-CD4、FITC-IL-17單克隆抗體,均購自法國IMMUNOTECH S.A.S公司;兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)、p-NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和p-IκBα、GAPDH一抗,均購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(海古朵生物科技有限公司)。
SPF級雄性SD大鼠,60只,7周齡,體質(zhì)量260~270 g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于無菌環(huán)境,室溫為24~26 ℃,相對濕度為40%~60%,自然光照,自由攝食飲水,實驗開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。
取50只大鼠建立肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠模型[5]:腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,固定,頸部備皮消毒,取切口暴露上段氣管,注射400個麥氏濁度單位的肺炎克雷伯菌標準株混懸液0.5 mL,分多次注射。剩余10只作為健康組,注射等體積生理鹽水,注射后縫合切口,局部消毒。建模成功標準:大鼠反應(yīng)遲緩、呆滯,胸廓快速運動,發(fā)生嚴重低氧血癥,胸部X線片顯現(xiàn)彌漫性滲出影。40只大鼠建模成功,隨機分為模型組、穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組,每組各10只。建模后給藥:穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組分別灌胃0.5、1.0 mg·mL-1穿心蓮內(nèi)酯混懸液(臨用時取穿心蓮內(nèi)酯粉末,先用DMSO溶解成質(zhì)量濃度10 mg·mL-1,再用生理鹽水配制為實驗質(zhì)量濃度),陽性對照組灌胃1.04 mg·kg-1地塞米松(用生理鹽水灌服),健康組與模型組灌胃等體積生理鹽水。每日1次,連續(xù)干預(yù)7 d。
末次治療后,戊巴比妥鈉麻醉,固定,頸部正中取切口,暴露氣管,在第3、4氣管環(huán)中間取倒T切口插管。將大鼠置入體描箱,連接呼吸機,用AniRes 2005 軟件導(dǎo)出靜息通氣量、 氣道阻力比值。
肺功能檢測后,麻醉,腹主動脈采血,備用待測炎性細胞因子。脫頸處死大鼠,取右肺并沿血管、氣管走向切成10 mm厚小塊,選擇病灶明顯組織,一半裝入無菌離心管液氮冷凍,保存于-80 ℃待測Western blot,一半用40 g·L-1多聚甲醛固定。取左肺稱量肺濕質(zhì)量,置于80 ℃烘箱烘干至恒定質(zhì)量,稱量肺干質(zhì)量,計算肺濕干質(zhì)量比值。
取腹主動脈血,室溫靜置2 h,4 ℃以1 500 r·min-1離心10 min,離心半徑為10 cm,取上清,參考IL-23、IL-17 ELISA試劑盒說明書檢測:常規(guī)設(shè)置標準孔、空白孔和樣品孔,加樣,溫育,加酶標試劑后,加入顯色劑,終止反應(yīng),450 nm波長處測定各孔光密度值,根據(jù)標準曲線計算IL-23、IL-17質(zhì)量濃度。
取多聚甲醛固定的右肺組織,固定24 h后常規(guī)脫水、透明、包埋、切片,按HE試劑盒說明書染色:二甲苯透明,梯度酒精脫水,蒸餾水沖洗,蘇木精染色,流水緩沖,乙醇脫術(shù),伊紅染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,封片。顯微鏡下觀察,并拍照。
取腹主動脈血加紅細胞裂解液,冰浴30 min,以3 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為10 cm,收集細胞沉淀,用預(yù)冷的PBS洗滌后重懸細胞,計數(shù),取1×106個細胞的細胞懸浮液,加入FITC-CD4、FITC-IL-17單克隆抗體,混勻后避光孵育30 min,以3 000 r·min-1離心5 min,用預(yù)冷PBS洗滌細胞沉淀,重懸,混勻后上機,用流式細胞儀檢測Th17、CD4細胞百分比,計算其比值。
取液氮冷凍的肺組織,冰上研磨呈粉末,加RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)量濃度,用Bradford調(diào)整各組蛋白質(zhì)量濃度一致后進行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)膜到PVDF膜,脫脂奶粉封閉2 h,加入兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα和GAPDH一抗(稀釋1∶1 000),4 ℃孵育過夜,加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋1∶2 000),室溫封閉1 h,滴加ECL暗室曝光顯影,計算目標蛋白灰度值。
與健康組比較,模型組靜息通氣量、氣道阻力比值較低(P<0.05);與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較,穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽性對照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較,陽性對照組靜息通氣量、氣道阻力比值較高(P<0.05)。見表1。
表1 大鼠靜息通氣量、氣道阻力比值比較
與健康組比較,模型組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較高(P<0.05);與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較,穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽性對照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較,陽性對照組肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比較低(P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量比
與健康組比較,模型組血清IL-23、IL-17水平較高(P<0.05);與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較,穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽性對照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較,陽性對照組血清IL-23、IL-17水平較低(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠血清IL-23、IL-17水平
健康組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,無炎性細胞浸潤;模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔變實,可見大量炎性細胞浸潤與漿液性滲出;與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組的肺泡結(jié)構(gòu)完整性、形態(tài)均改善,炎性細胞浸潤減輕。見圖1。
與健康組比較,模型組大鼠外周血Th17細胞比例較高(P<0.05);與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組及陽性對照組大鼠外周血Th17細胞比例較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較,穿心蓮內(nèi)酯高劑量組及陽性對照組外周血Th17細胞比例較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯高劑量組比較,陽性對照組外周血Th17細胞比例較低(P<0.05)。見表4。
表4 各組大鼠外周血Th17細胞比例
與健康組比較,模型組大鼠肺組織p-IκBα蛋白表達水平較低,p-NF-κB蛋白表達水平較高(P<0.05);與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組肺組織p-IκBα蛋白表達水平較高,p-NF-κB蛋白表達水平較低(P<0.05);與穿心蓮內(nèi)酯低劑量組比較,穿心蓮內(nèi)酯高劑量組肺組織p-IκBα蛋白表達水平較高,p-NF-κB蛋白表達水平較低(P<0.05)。各組IκBα、p-NF-κB蛋白表達水平組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5、圖2。
表5 各組大鼠肺組織NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達
注:A.健康組;B.模型組;C.穿心蓮內(nèi)酯低劑量組;D.穿心蓮內(nèi)酯高劑量組。
克雷伯桿菌為最早發(fā)現(xiàn)的可誘發(fā)肺炎的革蘭氏陰性菌,可通過呼吸道感染而引起肺炎,病理表現(xiàn)為肺泡擴張、炎性細胞增多[6]。克雷伯桿菌肺炎存在高耐藥、并發(fā)癥多等特點,目前尚無特效治療藥物。穿心蓮內(nèi)酯是從爵床科植物穿心蓮中提取獲得的二萜內(nèi)酯類化合物,有抗炎、增強免疫、抗氧化、抗腫瘤等功效,且毒性低、價格低廉,廣泛應(yīng)用于各種炎癥疾病治療中,效果確切[7-8]。TAO Z等[9]研究表明抗炎、調(diào)節(jié)免疫是應(yīng)對重癥肺炎的關(guān)鍵,故以穿心蓮內(nèi)酯為實驗藥物,分析其對肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠的治療作用及其機制,為該病臨床治療提供借鑒。
靜息通氣量、氣道阻力比值為臨床常用的肺功能檢測指標,結(jié)果提示,與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組靜息通氣量、氣道阻力比值升高,提示穿心蓮內(nèi)酯可改善大鼠肺功能。HE染色觀察大鼠肺組織病理發(fā)現(xiàn),與健康組比較,模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞,肺泡腔有大量炎性細胞浸潤,提示重癥肺炎可造成嚴重肺部損傷,表現(xiàn)為肺部含水量增加。觀察各組大鼠肺濕干質(zhì)量比發(fā)現(xiàn),與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組的肺濕干質(zhì)量比較低,且病理學表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)、炎性細胞浸潤改善,提示穿心蓮內(nèi)酯可減輕肺組織損傷,減輕肺泡腔炎性細胞浸潤。IL-23、IL-17均屬于白細胞介素,IL-17是CD4 Th17、CD8 Tc17細胞分泌的一種促炎細胞因子,在炎性環(huán)境中,CD4+T細胞將分化成Th17表型,產(chǎn)生IL-17,而IL-17的產(chǎn)生需由IL-23啟動[10-11]。故IL-23/IL-17軸在炎癥產(chǎn)生發(fā)展中相輔相成。研究結(jié)果顯示,與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組大鼠血清IL-23、IL-17水平均較低,提示穿心蓮內(nèi)酯有抗炎作用,這可能是其減輕大鼠肺組織炎性細胞浸潤的主要原因。Th17為CD4+的獨特譜系輔助性T細胞,可在IL-23刺激下產(chǎn)生多種炎癥趨化因子、細胞因子,包括IL-17,在宿主免疫反應(yīng)中扮演重要角色,主要參與炎癥反應(yīng)自身免疫性疾病[12-13]。國內(nèi)外研究報道[14-15],Th17細胞與多種肺部疾病存在相關(guān)性,其作為前炎癥細胞因子,在細菌等引起的重癥肺炎中可能有致病作用。研究結(jié)果顯示,與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組外周血Th17細胞比例較低,提示穿心蓮內(nèi)酯可通過抗炎調(diào)節(jié)大鼠免疫功能。
NF-κB是一種可特異性結(jié)合基因增強子或啟動子的調(diào)節(jié)因子,在正常情況下與IκBα結(jié)合,以無活性形式存在于細胞質(zhì);若受到刺激,IκBα降解,釋放NF-κB p65,使其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核,調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因表達[16-18]。IκBα為NF-κB抑制蛋白,是IκB家族最早克隆出的、最成熟的蛋白,可在細胞因子、病毒蛋白等刺激因子刺激細胞時,級聯(lián)信號快速激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物,p-IκBα21、21位賴氨酸發(fā)生泛素化降解,脫離NF-κB,從而使NF-κB核定位信號區(qū)暴露,引起NF-κB活化、核轉(zhuǎn)錄,介導(dǎo)細胞因子IL-17、IL-23等釋放,誘發(fā)炎癥[19-20]。結(jié)果提示,與模型組比較,穿心蓮內(nèi)酯低、高劑量組大鼠肺組織IκBα蛋白表達上調(diào),NF-κB蛋白表達下調(diào),提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過上調(diào)IκBα蛋白、下調(diào)NF-κB蛋白發(fā)揮抗炎作用。
綜上所述,穿心蓮內(nèi)酯可介導(dǎo)IL-23/Th17平衡,增強肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠免疫功能,并減輕肺部損傷,這可能是通過調(diào)節(jié)IκBα/NF-κB通路實現(xiàn)的。