晉 濤,陶勝忠,范魯鼎,李卓倫
1.鄭州頤和醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450000;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450000;3.河南中醫(yī)藥大學(xué)(河南省中醫(yī)院)神經(jīng)外科,鄭州 450000;4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450000
腦膠質(zhì)瘤(glioma)是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,是顱內(nèi)常見腫瘤,惡性程度高,浸潤(rùn)性強(qiáng),復(fù)發(fā)率高。白藜蘆醇是從多種植物中分離出的一種酚類化合物,具有抗癌、抗炎和抗氧化應(yīng)激等功效[1-3]。白藜蘆醇可增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性,抑制腫瘤生長(zhǎng)[4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞在某些刺激因子作用下獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種現(xiàn)象,廣泛存在于胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移及組織纖維化過(guò)程中。本研究以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對(duì)象,探討白藜蘆醇是否通過(guò)核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路介導(dǎo)EMT過(guò)程,促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn),為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供新的治療靶點(diǎn)。
多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司;培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;雙垂直電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。
白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)和IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α) ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abclonal公司;上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cad)、神經(jīng)鈣黏蛋白(neural cadherin,N-cad)、波形蛋白(vimentin)、NF-κB p65和p-p65抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。
人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 mg ·L-1鏈霉素和1×105u·L-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 天更換1次培養(yǎng)基,細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),胰蛋白酶消化傳代,培養(yǎng)至第3代的U251細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、白藜蘆醇組、激動(dòng)劑組和激動(dòng)劑+白藜蘆醇組。DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,以每孔1×105個(gè)·孔-1的密度將細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,對(duì)照組細(xì)胞不做處理,白藜蘆醇組細(xì)胞加入白藜蘆醇50 μmol· L-1處理12 h,激動(dòng)劑組細(xì)胞加入LPS 1 μg·mL-1刺激12 h,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組細(xì)胞先用LPS刺激12 h后,再加入白藜蘆醇50 μmol·L-1處理12 h,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,避光條件下每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去原有培養(yǎng)基,每孔加入二甲基亞砜150 μL,37 ℃低速振蕩10 min后,置于酶標(biāo)儀上,設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm,測(cè)定吸光度(A值)。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。
細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以3 000 r·min-1離心10 min,離心半徑8 cm,PBS清洗 2 次后,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1,先加入 Annexin V-FITC 5 μL充分混勻后再加入碘化丙啶5 μL,振蕩混勻,室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
收集各組細(xì)胞上清液,根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行對(duì)照品稀釋,取出酶標(biāo)板設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔,標(biāo)準(zhǔn)孔中加入稀釋后的對(duì)照品50 μL,待測(cè)樣品孔先加入樣品稀釋液40 μL,再加入待測(cè)上清液10 μL,37 ℃水浴鍋中孵育30 min,洗滌液洗滌5次,拍干板子,除空白孔外,其余每孔加入酶標(biāo)抗體50 μL,37 ℃水浴鍋中孵育30 min,洗滌液洗滌5次,拍干板子,再加入顯色液,37 ℃顯色10 min,每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng),酶標(biāo)儀波長(zhǎng)調(diào)至450 nm處,測(cè)量吸光度(A)值。
Transwell小室的上室中鋪上30 μg基質(zhì)膠,DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)·mL-1,在Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液200 μL,在Transwell小室的下室中加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄掉培養(yǎng)基,用棉簽擦掉小室上室中的細(xì)胞,PBS清洗2次,用多聚甲醛固定15 min,用質(zhì)量濃度為1 g·L-1結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下觀察并拍照。
收集細(xì)胞,PBS清洗2次,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min,在4 ℃ 以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為10 cm,收集上清。BSA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度。加入RIPA和蛋白上樣緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度,100 ℃煮沸10 min使蛋白變性。進(jìn)行凝膠電泳,每孔加入蛋白樣品20 μL,80 V電泳30 min,120 V電泳2 h,結(jié)束電泳。0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h,TBST洗膜5 min,3次,室溫封閉1 h,E-cad、N-cad、vimentin、NF-κB p65、p-p65和GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜5 min,3次,二抗(1∶5 000)于低速搖床上室溫孵育1 h,ECL發(fā)光液A液和B液1∶1配制,顯色,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值為目的蛋白條帶相對(duì)表達(dá)量。
細(xì)胞存活率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,白藜蘆醇組細(xì)胞存活率降低(P<0.05),激動(dòng)劑組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與白藜蘆醇組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組細(xì)胞存活率升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。見表1。
表1 細(xì)胞存活率比較
細(xì)胞凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率升高,激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與白藜蘆醇組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2、圖1。
表2 細(xì)胞凋亡率比較
注:A.對(duì)照組;B.白藜蘆醇組;C.激動(dòng)劑組;D.激動(dòng)劑+白藜蘆醇組。
IL-6、IL-1β和TNF-α含量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低,激動(dòng)劑組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05);與白藜蘆醇組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.05)。見表3。
表3 IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較
侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)減少,激動(dòng)劑組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05);與白藜蘆醇組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。見表4、圖2。
E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,白藜蘆醇組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,激動(dòng)劑組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與白藜蘆醇組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與激動(dòng)劑組比較,激動(dòng)劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見表5、圖3。
表4 侵襲細(xì)胞數(shù)比較
注: A.對(duì)照組;B.白藜蘆醇組;C.激動(dòng)劑組;D.激動(dòng)劑+白藜蘆醇組。
表5 E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較
注:A.對(duì)照組;B.白藜蘆醇組;C.激動(dòng)劑組;D.激動(dòng)劑+白藜蘆醇組。
腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤常引起患者神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷,根據(jù)病理分級(jí),可將腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤分為4級(jí),Ⅰ級(jí):癌細(xì)胞增殖能力低,手術(shù)治愈性高;Ⅱ級(jí):癌細(xì)胞具有浸潤(rùn)性,有向高級(jí)別腫瘤進(jìn)展的趨勢(shì);Ⅲ級(jí):癌細(xì)胞具有惡性腫瘤特點(diǎn),術(shù)后需進(jìn)行輔助性放化療;Ⅳ級(jí):癌細(xì)胞具有惡性細(xì)胞學(xué)表象,生長(zhǎng)快,進(jìn)展快,復(fù)發(fā)率高,術(shù)后需要輔助性放化療[5-6]。臨床上常見的癥狀包括癲癇發(fā)作、顱內(nèi)壓升高、頭痛、皮質(zhì)脊髓束受累以及腦神經(jīng)損傷等,但由于缺乏特異性常被誤診為急性腦血管疾病。目前,對(duì)于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制尚未明確。
中藥由于其多靶點(diǎn)、毒副作用小、療效佳等優(yōu)點(diǎn),在腫瘤的臨床治療上已受到廣泛關(guān)注,例如三七皂苷可降低胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[7],淫羊藿苷抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移[8]。白藜蘆醇又稱芪三酚,存在于葡萄、虎杖和大麥草等多種植物中,ZHANG W等[9]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過(guò)激活Nrf2通路發(fā)揮抗炎作用,減輕糖尿病大鼠神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度。HU Y等研究報(bào)道白藜蘆醇可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[10]。白藜蘆醇作為一種藥理活性廣泛的傳統(tǒng)中藥,其在抗腫瘤方面的作用已被報(bào)道,白藜蘆醇可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞A549對(duì)輻射損傷的敏感性,提高肝癌的治療效果[11]。XU Q H等[12]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程抑制缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲,既往研究表明,白藜蘆醇具有良好的抗腫瘤效用,但是其在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中是否具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用仍待研究,因此本實(shí)驗(yàn)以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對(duì)象,探討白藜蘆醇在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,白藜蘆醇可抑制U251細(xì)胞增殖和侵襲、促進(jìn)其凋亡,同時(shí)可降低炎癥因子釋放。
EMT是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程,涉及多種基因,與腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)密切相關(guān)。EMT發(fā)生過(guò)程中,原發(fā)灶癌上皮細(xì)胞失去上皮表型獲得間質(zhì)表型,細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)行為發(fā)生改變、細(xì)胞之間或細(xì)胞基質(zhì)間黏附性減弱,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞w移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)血液和淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處組織形成新的病灶。E-cad主要表達(dá)于上皮細(xì)胞,N-cad是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,細(xì)胞骨架成分蛋白vimentin增高誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,因此E-cad的減少和N-cad、vimentin的增加標(biāo)志著EMT的發(fā)生[13]。NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中具有重要作用,而且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14],正常情況下,NF-κB主要以p65和p50二聚體形式與IKB結(jié)合于胞漿,未見生物活性,當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),IKB發(fā)生磷酸化而被降解,暴露NF-κB二聚體從胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核,從而調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄,其中包括促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。既往研究表明,NF-κB信號(hào)通路的激活與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的增殖活性和遷移浸潤(rùn)密切相關(guān)[15-16]。LIU F F等[17]研究發(fā)現(xiàn),阻斷NF-κB信號(hào)通路可抑制喉癌細(xì)胞增殖遷移以及EMT過(guò)程。WANG Y S等[18]研究報(bào)道NF-κB信號(hào)通路參與調(diào)控EMT過(guò)程。黃芩素通過(guò)抑制NF-κB p65通路介導(dǎo)的EMT過(guò)程和炎癥反應(yīng)以改善肺纖維化,白細(xì)胞介素17A激活NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)EMT促進(jìn)膽囊癌侵襲[19-20]。本實(shí)驗(yàn)以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對(duì)象,探討白藜蘆醇抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖和侵襲是否與該信號(hào)通路有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS激活該信號(hào)通路后,E-cad蛋白表達(dá)減少,N-cad、vimentin蛋白表達(dá)增加,白藜蘆醇預(yù)處理后,E-cad蛋白表達(dá)增加,N-cad、vimentin蛋白表達(dá)減少,此結(jié)果提示在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,白藜蘆醇可通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路抑制EMT過(guò)程。
綜上所述,白藜蘆醇可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲,促進(jìn)凋亡,其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路抑制EMT過(guò)程、減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用,為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。