晉 濤，陶勝忠，范魯鼎，李卓倫

1.鄭州頤和醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)(河南省中醫(yī)院)神經(jīng)外科，鄭州 450000；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州 450000

腦膠質(zhì)瘤(glioma)是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，是顱內(nèi)常見腫瘤，惡性程度高，浸潤性強，復(fù)發(fā)率高。白藜蘆醇是從多種植物中分離出的一種酚類化合物，具有抗癌、抗炎和抗氧化應(yīng)激等功效[1-3]。白藜蘆醇可增強腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性，抑制腫瘤生長[4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞在某些刺激因子作用下獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種現(xiàn)象，廣泛存在于胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移及組織纖維化過程中。本研究以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇是否通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路介導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和浸潤，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供新的治療靶點。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 試藥

白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)購自美國Sigma公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)和IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α) ELISA試劑盒均購自美國Abclonal公司；上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cad)、神經(jīng)鈣黏蛋白(neural cadherin，N-cad)、波形蛋白(vimentin)、NF-κB p65和p-p65抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞系

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 mg ·L-1鏈霉素和1×105u·L-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 天更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)到80%融合時，胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)至第3代的U251細(xì)胞用于實驗。

對數(shù)生長期U251細(xì)胞隨機分為對照組、白藜蘆醇組、激動劑組和激動劑+白藜蘆醇組。DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，以每孔1×105個·孔-1的密度將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長后，對照組細(xì)胞不做處理，白藜蘆醇組細(xì)胞加入白藜蘆醇50 μmol· L-1處理12 h，激動劑組細(xì)胞加入LPS 1 μg·mL-1刺激12 h，激動劑+白藜蘆醇組細(xì)胞先用LPS刺激12 h后，再加入白藜蘆醇50 μmol·L-1處理12 h，進(jìn)行實驗。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，避光條件下每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，37 ℃低速振蕩10 min后，置于酶標(biāo)儀上，設(shè)定波長為490 nm，測定吸光度(A值)。細(xì)胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑8 cm，PBS清洗 2 次后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個·mL-1，先加入 Annexin V-FITC 5 μL充分混勻后再加入碘化丙啶5 μL，振蕩混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.4 ELISA法檢測IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)

收集各組細(xì)胞上清液，根據(jù)說明書進(jìn)行對照品稀釋，取出酶標(biāo)板設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入稀釋后的對照品50 μL，待測樣品孔先加入樣品稀釋液40 μL，再加入待測上清液10 μL，37 ℃水浴鍋中孵育30 min，洗滌液洗滌5次，拍干板子，除空白孔外，其余每孔加入酶標(biāo)抗體50 μL，37 ℃水浴鍋中孵育30 min，洗滌液洗滌5次，拍干板子，再加入顯色液，37 ℃顯色10 min，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長調(diào)至450 nm處，測量吸光度(A)值。

2.5 Transwell實驗檢測侵襲細(xì)胞數(shù)

Transwell小室的上室中鋪上30 μg基質(zhì)膠，DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為105個·mL-1，在Transwell小室的上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，在Transwell小室的下室中加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，用棉簽擦掉小室上室中的細(xì)胞，PBS清洗2次，用多聚甲醛固定15 min，用質(zhì)量濃度為1 g·L-1結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 蛋白印跡法檢測細(xì)胞中蛋白相對表達(dá)量

收集細(xì)胞，PBS清洗2次，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，在4 ℃ 以12 000 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清。BSA法測定蛋白質(zhì)量濃度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)量濃度。加入RIPA和蛋白上樣緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性。進(jìn)行凝膠電泳，每孔加入蛋白樣品20 μL，80 V電泳30 min，120 V電泳2 h，結(jié)束電泳。0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，TBST洗膜5 min，3次，室溫封閉1 h，E-cad、N-cad、vimentin、NF-κB p65、p-p65和GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min，3次，二抗(1∶5 000)于低速搖床上室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液A液和B液1∶1配制，顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值為目的蛋白條帶相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率檢測結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，激動劑組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 細(xì)胞存活率比較

3.2 細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果

細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率升高，激動劑組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 細(xì)胞凋亡率比較

注：A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

3.3 ELISA檢測結(jié)果

IL-6、IL-1β和TNF-α含量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低，激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.05)。見表3。

表3 IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較

3.4 Transwell實驗檢測結(jié)果

侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)減少，激動劑組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。見表4、圖2。

3.5 蛋白印跡法檢測結(jié)果

E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達(dá)量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量降低，激動劑組E-cad蛋白相對表達(dá)量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達(dá)量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達(dá)量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表4 侵襲細(xì)胞數(shù)比較

注： A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

表5 E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達(dá)量比較

注：A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

4 討論

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤常引起患者神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，根據(jù)病理分級，可將腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤分為4級，Ⅰ級：癌細(xì)胞增殖能力低，手術(shù)治愈性高；Ⅱ級：癌細(xì)胞具有浸潤性，有向高級別腫瘤進(jìn)展的趨勢；Ⅲ級：癌細(xì)胞具有惡性腫瘤特點，術(shù)后需進(jìn)行輔助性放化療；Ⅳ級：癌細(xì)胞具有惡性細(xì)胞學(xué)表象，生長快，進(jìn)展快，復(fù)發(fā)率高，術(shù)后需要輔助性放化療[5-6]。臨床上常見的癥狀包括癲癇發(fā)作、顱內(nèi)壓升高、頭痛、皮質(zhì)脊髓束受累以及腦神經(jīng)損傷等，但由于缺乏特異性常被誤診為急性腦血管疾病。目前，對于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)病機制尚未明確。

中藥由于其多靶點、毒副作用小、療效佳等優(yōu)點，在腫瘤的臨床治療上已受到廣泛關(guān)注，例如三七皂苷可降低胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[7]，淫羊藿苷抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移[8]。白藜蘆醇又稱芪三酚，存在于葡萄、虎杖和大麥草等多種植物中，ZHANG W等[9]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過激活Nrf2通路發(fā)揮抗炎作用，減輕糖尿病大鼠神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度。HU Y等研究報道白藜蘆醇可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[10]。白藜蘆醇作為一種藥理活性廣泛的傳統(tǒng)中藥，其在抗腫瘤方面的作用已被報道，白藜蘆醇可增強肝癌細(xì)胞A549對輻射損傷的敏感性，提高肝癌的治療效果[11]。XU Q H等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過逆轉(zhuǎn)EMT過程抑制缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，既往研究表明，白藜蘆醇具有良好的抗腫瘤效用，但是其在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中是否具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用仍待研究，因此本實驗以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用。實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇可抑制U251細(xì)胞增殖和侵襲、促進(jìn)其凋亡，同時可降低炎癥因子釋放。

EMT是一個復(fù)雜的生理過程，涉及多種基因，與腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤密切相關(guān)。EMT發(fā)生過程中，原發(fā)灶癌上皮細(xì)胞失去上皮表型獲得間質(zhì)表型，細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)行為發(fā)生改變、細(xì)胞之間或細(xì)胞基質(zhì)間黏附性減弱，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞w移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，通過血液和淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處組織形成新的病灶。E-cad主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，N-cad是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，細(xì)胞骨架成分蛋白vimentin增高誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，因此E-cad的減少和N-cad、vimentin的增加標(biāo)志著EMT的發(fā)生[13]。NF-κB信號通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中具有重要作用，而且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14]，正常情況下，NF-κB主要以p65和p50二聚體形式與IKB結(jié)合于胞漿，未見生物活性，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，IKB發(fā)生磷酸化而被降解，暴露NF-κB二聚體從胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，從而調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。既往研究表明，NF-κB信號通路的激活與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的增殖活性和遷移浸潤密切相關(guān)[15-16]。LIU F F等[17]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB信號通路可抑制喉癌細(xì)胞增殖遷移以及EMT過程。WANG Y S等[18]研究報道NF-κB信號通路參與調(diào)控EMT過程。黃芩素通過抑制NF-κB p65通路介導(dǎo)的EMT過程和炎癥反應(yīng)以改善肺纖維化，白細(xì)胞介素17A激活NF-κB信號通路介導(dǎo)EMT促進(jìn)膽囊癌侵襲[19-20]。本實驗以腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇抑制腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖和侵襲是否與該信號通路有關(guān)。實驗結(jié)果顯示，LPS激活該信號通路后，E-cad蛋白表達(dá)減少，N-cad、vimentin蛋白表達(dá)增加，白藜蘆醇預(yù)處理后，E-cad蛋白表達(dá)增加，N-cad、vimentin蛋白表達(dá)減少，此結(jié)果提示在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，白藜蘆醇可通過阻斷NF-κB信號通路抑制EMT過程。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡，其可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制EMT過程、減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮調(diào)控作用，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。