李 振，劉丹丹，付開巖，李曉華

鞍鋼集團(tuán)公司總醫(yī)院眼科，鞍山 114002

白內(nèi)障臨床表現(xiàn)為晶狀體渾濁，從而影響光線從晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視力下降及損傷[1]。白內(nèi)障的發(fā)生與紫外線照射密切相關(guān)，部分紫外線可穿過角膜和房水被晶狀體所吸收，受到紫外線照射的細(xì)胞可啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。白藜蘆醇是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理活性。白藜蘆醇具有抗細(xì)胞凋亡作用，在椎間盤退變及糖尿病心肌病中可通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用[3-4]。白藜蘆醇可抑制動(dòng)物糖尿病性白內(nèi)障進(jìn)展過程[5]。本研究通過紫外線照射建立白內(nèi)障小鼠模型，探討白藜蘆醇對(duì)白內(nèi)障小鼠晶體透明度的改善作用及其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，Mini-Protean4電泳儀購自美國Bio Rad公司。

1.2 試藥

復(fù)方托吡卡胺滴眼液(美多麗)購自日本參天制藥株式會(huì)社；白藜蘆醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，批號(hào)R5010)購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物研究所；miR-125b-inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司合成；兔抗大鼠p53、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2gene，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)一抗和HRP標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠90只，6周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)裂隙燈檢查，排除眼球疾病。

2 方法

2.1 建模

隨機(jī)選取65只小鼠，參照文獻(xiàn)用紫外線照射法[6]建立白內(nèi)障模型，將復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴入雙側(cè)眼球進(jìn)行擴(kuò)瞳，5 min后腹腔注射10 mg·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉小鼠，用紫外線(360 μW·cm-2)照射右眼，照射時(shí)間為5 min，1日1次，連續(xù)7 d，左眼不照射。

2.2 晶狀體miR-125b表達(dá)

末次紫外線照射后2 h，隨機(jī)選取5只建模小鼠，另取5只未建模小鼠，處死后取晶狀體前囊膜，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq TM 10 μL，模板cDNA2 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性5 s，55 ℃退火5 s，60 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，根據(jù)2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：miR-125b上游5′-ACAGATGGTCCGGCTAGCTC-3′，下游5′-GTCCGACAAGTCGGCATGCT-3′；U6上游5′-GCAAGGGCGCGATC-TAGCTC-3′，下游5′-GCCGATAGCAGAATCCCGCT-3′。

2.3 分組及干預(yù)

剩余60只建模小鼠隨機(jī)分為模型組、白藜蘆醇組和白藜蘆醇+inhibitor組，每組各20只，另設(shè)20只對(duì)照組。白藜蘆醇組灌胃給予100 mg·kg-1白藜蘆醇且玻璃體內(nèi)注射PBS 3 μL；白藜蘆醇+inhibitor組灌胃給予100 mg·kg-1白藜蘆醇，1日1次，連續(xù)14 d，第8 d灌胃完畢后2 h，玻璃體內(nèi)注射miR-125b-inhibitor 3 μL，僅注射1次；模型組和對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水且玻璃體內(nèi)注射等體積PBS，干預(yù)頻次同上。玻璃體內(nèi)注射方法：小鼠麻醉后，碘伏消毒眼表，顯微鏡下，使用微量注射器于鞏膜側(cè)后垂直進(jìn)針，隨后向眼球壁傾斜避開晶狀體，到達(dá)視網(wǎng)膜中央，進(jìn)行注射，注射完畢后復(fù)位眼球，滴典必殊滴眼液。

2.4 裂隙燈觀察晶狀體渾濁度

用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，裂隙燈觀測(cè)各組小鼠右眼晶狀體渾濁度。依據(jù)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)晶狀體進(jìn)行分級(jí)評(píng)分：0級(jí)為透明無渾濁，記為0分；Ⅰ級(jí)為輕度渾濁，周邊有少量空泡，記為1分；Ⅱ級(jí)為中度渾濁，空泡向中心聚集，記為2分；Ⅲ級(jí)為高度渾濁，空泡聚集至中心部位，呈現(xiàn)霧狀混濁；Ⅳ級(jí)為完全渾濁，記為4分。

2.5 檢測(cè)晶狀體SOD、GSH和MDA水平

評(píng)分完畢后，各組隨機(jī)選取5只小鼠，處死后摘取眼球，取右眼晶狀體放入離心管中，按1∶9加入生理鹽水，制備100 mg·L-1組織勻漿，離心取上清，按照試劑盒說明書加入試劑和樣品，充分混勻，反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算SOD、GSH和MDA活力。

2.6 晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)凋亡情況

各組隨機(jī)選取5只小鼠，處死，取右眼晶狀體前囊膜，剪碎，磷酸鹽緩沖液懸浮，300目網(wǎng)篩過濾，制備上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以1 000 r·min-1離心3 min，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1，加入Annexin V-FITC和PI工作液，室溫避光染色5 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，記錄各組細(xì)胞凋亡率。

2.7 小鼠晶狀體病理學(xué)變化

各組隨機(jī)選取5只小鼠，處死，取右眼晶狀體前囊膜，于40 mg·L-1多聚甲醛中固定后，石蠟包埋，制備4 μm切片，脫蠟、復(fù)水，蘇木素染色5 min，蒸餾水洗滌，10 mg·L-1鹽酸乙醇分化，伊紅染色5 min，蒸餾水洗滌，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察晶狀體病理學(xué)變化。

2.8 晶狀體凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)

處死各組剩余小鼠，取右眼晶狀體前囊膜，Trizol法提取總RNA，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。引物序列：p53上游5′-TGACTAGCATCAGGCATTAG-3′，下游5′-AGCTAGCGATGCATCGATGA-3′；Bcl-2上游5′-CGACTAGCTAATAGCTATCG-3′，下游5′-TGACGTTAGCTAGTAGCGAT-3′；Bax上游5′-ACTCGATCGATTAGACCTAGC-3′，下游5′-AGGTACGTACTCGTACATAGT-3′；β-actin上游5′-ATGCAGTAGCGATATCATCGCT-3′，下游5′-ATCCGACGCTACGACTAGCAGT-3′。

2.9 晶狀體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取右眼晶狀體前囊膜，PBS洗滌，加入裂解液制備組織勻漿，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，煮沸使蛋白變性，以12 000 r·min-1(離心半徑12 cm)離心5 min，留取上清。蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h。加入p53、Bcl-2、Bax和β-actin(1∶800)一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光、顯影。Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，各目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平以其與內(nèi)參條帶灰度比值表示。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 白內(nèi)障小鼠晶狀體miR-125b低表達(dá)

造模小鼠晶狀體miR-125b相對(duì)表達(dá)量為(0.37±0.05)，未造模小鼠晶狀體miR-125b的相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.00)，造模小鼠顯著低于未造模小鼠(t=28.174，P<0.05)。

3.2 小鼠晶狀體渾濁度評(píng)分

對(duì)照組小鼠晶狀體均透明，無渾濁現(xiàn)象。與模型組比較，白藜蘆醇組晶狀體渾濁程度和評(píng)分降低(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+inhibitor組晶狀體渾濁程度和評(píng)分升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠晶狀體渾濁度及評(píng)分比較 [n=20，n(%)]

3.3 小鼠晶狀體SOD、GSH和MDA水平

與對(duì)照組比較，模型組小鼠晶狀體SOD、GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，白藜蘆醇組小鼠晶狀體SOD、GSH水平升高，MDA水平降低(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+inhibitor組晶狀體SOD、GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠晶狀體SOD、GSH、MDA水平比較

3.4 小鼠LEC凋亡率

與對(duì)照組比較，模型組LEC凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，白藜蘆醇組LEC凋亡率降低(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+inhibitor組LEC凋亡率升高(P<0.05)。見表3。

3.5 HE染色觀察小鼠晶狀體病理變化

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組LEC形態(tài)規(guī)則、排列整齊；模型組LEC大小不一、排列紊亂、核固縮，晶狀體纖維出現(xiàn)斷裂；白藜蘆醇組LEC排列基本整齊，細(xì)胞損傷較輕，晶狀體纖維偶見斷裂；白藜蘆醇+inhibitor組較模型組有所改善，但仍較白藜蘆醇組損傷嚴(yán)重，LEC紊亂，可見斷裂的晶狀體纖維。見圖1。

表3 各組小鼠LEC凋亡率比較

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.白藜蘆醇組；D.白藜蘆醇+inhibitor組。

3.6 小鼠晶狀體凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組p53、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組比較，白藜蘆醇組p53、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+inhibitor組p53、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠晶狀體mRNA表達(dá)水平比較

3.7 小鼠晶狀體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組p53、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組比較，白藜蘆醇組p53、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+inhibitor組p53、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 各組小鼠晶狀體蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

本研究用紫外線照射建立白內(nèi)障小鼠模型，結(jié)果顯示模型組小鼠晶狀體渾濁度明顯升高，表明紫外線誘導(dǎo)白內(nèi)障模型成功。MDA是脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其水平高低反映了組織細(xì)胞受自由基損傷的嚴(yán)重程度[8]；SOD是體內(nèi)一種抗氧化劑，對(duì)維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡具有重要作用[9]；GSH是抗氧化系統(tǒng)重要組成部分，可清除活性氧保護(hù)組織細(xì)胞[10]。白藜蘆醇是一種天然抗氧化劑，安全有效，副作用少，體外實(shí)驗(yàn)顯示，白藜蘆醇可減少胰島中自由基的產(chǎn)生，減少細(xì)胞凋亡，提高胰島存活能力和功能性[11]。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.白藜蘆醇組；D.白藜蘆醇+inhibitor組。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，白藜蘆醇在腎臟缺血再灌注大鼠模型中通過抑制相關(guān)通路發(fā)揮抗氧化作用，并可減少腎組織細(xì)胞凋亡[12-13]。紫外線通過氧化損傷LEC引起晶狀體渾濁[14]，白藜蘆醇可通過減輕氧化損傷減少LEC凋亡，在細(xì)胞受到紫外線輻射時(shí)發(fā)揮抗輻射作用，從而保護(hù)晶狀體[15]。目前白藜蘆醇的抗氧化活性已經(jīng)得到證實(shí)，本研究采用白藜蘆醇治療白內(nèi)障小鼠，檢測(cè)小鼠晶狀體渾濁度，結(jié)果顯示較模型組顯著下降，同時(shí)晶狀體SOD、GSH水平顯著升高，MDA水平下降，LEC凋亡率下降，晶狀體病理變化得到明顯改善，提示白藜蘆醇可減輕紫外線的氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡，改善晶狀體透明度。

研究顯示，miRNA通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等病理生理過程，與白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。已有研究顯示，多個(gè)miRNA與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制有關(guān)，為相應(yīng)靶向治療提供了依據(jù)[16-17]。因紫外線輻射氧化損傷導(dǎo)致LEC凋亡增加，被證實(shí)與miRNA有密切聯(lián)系[18]。miR-125b是重要腫瘤調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲過程密切相關(guān)，可作為多發(fā)性腫瘤診斷和預(yù)后指標(biāo)。已有研究證實(shí)，miR-125b可改善缺血性心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心臟修復(fù)[19]。Bcl-2和Bax同屬于Bcl-2家族，Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因，二者在決定細(xì)胞生存和死亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。p53可抑制Bcl-2表達(dá)及功能，提高Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。王建民等[20]報(bào)道，miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中表達(dá)水平明顯低于正常人，過表達(dá)miR-125b可抑制LEC凋亡。本研究結(jié)果顯示，造模小鼠晶狀體miR-125b表達(dá)顯著低于未造模小鼠，提示miR-125b在白內(nèi)障小鼠中表達(dá)水平存在異常，并在給予miR-125b-inhibitor后，小鼠晶狀體抗氧化能力下降，LEC凋亡增加，p53、Bax mRNA和蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)降低，表明miR-125b可能參與白內(nèi)障發(fā)展過程，與LEC凋亡有關(guān)。為進(jìn)一步探討白藜蘆醇的可能作用機(jī)制，本研究在用白藜蘆醇治療白內(nèi)障小鼠基礎(chǔ)上，同時(shí)給予miR-125b-inhibitor，結(jié)果顯示，白藜蘆醇的改善作用顯著降低，抑制miR-125b表達(dá)可抵消部分白藜蘆醇對(duì)白內(nèi)障小鼠的治療作用，證實(shí)白藜蘆醇降低白內(nèi)障小鼠晶狀體渾濁度、減少氧化應(yīng)激對(duì)LEC的損傷，可能是通過促進(jìn)miR-125b表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用的。

綜上所述，白藜蘆醇降低白內(nèi)障小鼠晶狀體渾濁度、減輕氧化應(yīng)激、減少LEC凋亡，與促進(jìn)miR-125b表達(dá)有關(guān)，可為臨床治療白內(nèi)障提供理論依據(jù)。miR-125b通過何種機(jī)制發(fā)揮抗凋亡作用，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。