呂 斌，凌圣惠，黎高文，梁 艷

廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院感染管理科，玉林 537000

蘿卜硫素(sulforaphane，SF)是一種在十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的異硫氰酸酯[1]，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用，被認為是對抗炎癥反應(yīng)的有力分子[2]。

腎病綜合征主要表現(xiàn)為高脂血癥、蛋白尿、水腫和低蛋白血癥。多種疾病和因素可導(dǎo)致繼發(fā)性腎病綜合征[3]。炎癥是一種重要的病理反應(yīng)，被認為在腎病綜合征的發(fā)病機制中發(fā)揮主導(dǎo)作用[4]，與腎病綜合征密切相關(guān)[5]。

核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elemen，ARE)結(jié)合的細胞保護基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過協(xié)調(diào)炎癥細胞的募集和ARE調(diào)節(jié)基因表達來促進抗炎過程[6]。Nrf2的激活可阻止脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)[7]。

本文選取SD幼鼠作為實驗對象，用多柔比星(doxorubicin，Dox)誘發(fā)幼鼠腎病綜合征模型，觀察SF是否可以通過誘導(dǎo)Nrf2的表達，發(fā)揮改善腎病綜合征的作用，為臨床防治提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動生化分析儀(山東科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；RM2235徠卡切片機(德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)；CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；蛋白凝膠電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 試藥

蘿卜硫素(質(zhì)量分數(shù)≥99.98%，美國Sigma-Aldrich公司)；注射用鹽酸多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；40 g·L-1多聚甲醛固定液(北京索萊寶生物科技公司)；尿蛋白、血清白蛋白、白細胞介素18(interleukin-18，IL-18)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(美國R&D公司)；BCA蛋白定量分析試劑盒和RIPA裂解液，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司)；5×loading buffer蛋白預(yù)混液(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；一抗：兔抗大鼠Nrf2、β-actin抗體，山羊抗兔辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗，均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD幼鼠32只，3周齡，體質(zhì)量(45±1) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(京)2019-0009。

2 方法

2.1 分組、造模及干預(yù)方法

SD幼鼠隨機均分為4組，Con組(對照組)、Model組(模型組)、SF組(蘿卜硫素組)和SF溶劑組，每組8只。SF組和SF溶劑組分別腹腔注射15 mg·kg-1SF和等體積的注射用生理鹽水作為溶媒對照，每天2次，間隔8 h，連續(xù)注射3 d。制備Dox誘導(dǎo)的腎病綜合征模型則參照之前的造模方法[8]，第4天除Con組外均給予1 mg·mL-1Dox(注射用生理鹽水溶解)，尾靜脈2次給藥(4.0、2.5 mg·kg-1)，2次間隔1周，Con組在相同處理條件下注射等體積的注射用生理鹽水。幼鼠出現(xiàn)蛋白尿表明腎功能受到損傷，造模成功。

2.2 取材

第2次給藥后3 d收集24 h尿液用于檢測尿蛋白的排泄情況。隨后用0.1 g·L-1巴比妥鈉麻醉幼鼠，腹主動脈取血檢測血清白蛋白、IL-18和IL-1β表達水平。取血后取出幼鼠腎臟，組織學(xué)固定后，脫水包埋進行HE染色。

2.3 測定

ELISA法對尿蛋白、血清白蛋白水平及促炎因子IL-18和IL-1β血清質(zhì)量濃度進行定量。用標(biāo)準(zhǔn)BCA方法進行蛋白質(zhì)測定。根據(jù)試劑盒方案制備對照品和樣品，并在免疫測定板上孵育30 min。洗孔6次，每孔加入各自對應(yīng)抗體，繼續(xù)孵育1 h。再次洗滌板，將包含的兔抗鼠IgG與HRP偶聯(lián)物加入每個孔中，并將板溫育30 min。洗滌板并加入TMB底物用于顯色。10 min后停止反應(yīng)，在450 nm處讀取吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線用于確定樣品中的質(zhì)量濃度。

2.4 腎臟組織HE染色

觀察腎臟組織病理。用9 g·L-1注射用氯化鈉溶液浸洗左側(cè)腎臟組織，用手術(shù)刀切取2 mm厚的組織塊，用40 g·L-1多聚甲醛固定液固定，經(jīng)乙醇梯度脫水置換和二甲苯脫醇處理后石蠟包埋，切片和染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)學(xué)變化結(jié)果，每張切片隨機選擇10個視野進行觀察評分。

2.5 Nrf2核蛋白表達量檢測

用RIPA裂解液抽提腎臟蛋白，并用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，用5×loading buffer樣本前預(yù)混后進行熱變性處理。每孔加入變性后蛋白20 μg，進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗體Nrf2，4 ℃過夜孵育，次日TBST漂洗3次，每次8 min，加入對應(yīng)種屬的二抗孵育，顯色，并用ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)和Image J軟件對結(jié)果進行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組幼鼠腎組織病理學(xué)

Con組可觀察到腎小球囊壁基底膜質(zhì)地均勻，細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)排列整齊，見圖1A；Model組和SF溶劑組分別呈現(xiàn)出腎小球球內(nèi)膜細胞不同程度地紊亂排列、細胞空泡和水腫，見圖1B、圖1D。同SF溶劑組相比，細胞核排列較整齊，質(zhì)地較均勻，見圖1C。另外，從觀察腎臟組織的評分結(jié)果可得出，與Con組比較，SF組、SF溶劑組和Model組腎損傷評分顯著升高(P<0.05)，其中Model組尤為明顯，而SF的預(yù)處理可以顯著降低腎損傷評分，且高于SF組(P<0.05)；Model組與SF溶劑組腎臟組織病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

注：A.Con組；B.Model組；C.SF組；D.SF溶劑組。

表1 各組幼鼠腎臟組織病理學(xué)評分

3.2 各組幼鼠尿蛋白和血清白蛋白比較

尾靜脈注射多柔比星后，Model組、SF組及SF溶劑組尿蛋白與血清白蛋白水平顯著高于Con組(P<0.05)。Model組24 h尿蛋白和血清白蛋白高于Con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SF預(yù)處理后可明顯降低尿蛋白和血清白蛋白的表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但SF溶劑組和Model組尿蛋白及血清白蛋白比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組幼鼠尿蛋白和血清白蛋白水平比較

3.3 各組幼鼠血清IL-18和IL-1β比較

Model組和SF溶劑組幼鼠血清IL-18和IL-1β含量高于Con組(P<0.05)；SF組IL-18和IL-1β含量低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Model組IL-18和IL-1β含量與SF溶劑組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組幼鼠血清IL-18和IL-1β比較

3.4 各組幼鼠腎臟組織Nrf2核蛋白表達比較

與Con組比較，Model組、SF組和SF溶劑組Nrf2核蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，其中SF組上調(diào)更顯著，為SF溶劑組的2倍(P<0.05)；Model組與SF溶劑組Nrf2核蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，Model組和SF溶媒組Dox注射后10 d腎損傷組織評分顯著升高，同時2組炎性因子IL-18和IL-1β均出現(xiàn)上調(diào)。

有報道顯示，泛素特異性肽酶10可減輕敗血癥引起的腎功能障礙，并減少腎小管上皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激[9]。多柔比星誘導(dǎo)的腎病綜合征模型是目前公認的造模方法，其機制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)，研究表明，多柔比星造模處理后，模型組幼鼠腎組織中丙二醛含量明顯升高，并表現(xiàn)出時間依賴性[10]。

注：A.Con組；B.Model組；C.SF組；D.SF溶劑組。與Con組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05；與SF溶劑組比較，%P<0.05。

SF是一種廣為人知的炎癥抑制劑。有研究顯示，SF抑制了LPS激活的N9細胞中一氧化氮、活性氧和促炎細胞因子的產(chǎn)生[11]。SUBEDI L等[12]還觀察到，SF抑制了LPS激活的小膠質(zhì)細胞中一氧化氮的產(chǎn)生和LPS激活的小膠質(zhì)細胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和COX-2的表達水平。此外，Nrf2和血紅素加氧酶-1的激活可增強抗炎細胞因子的產(chǎn)生，尤其是IL-10，以此表明SF的抗炎潛力[13]。本研究結(jié)果顯示，Model組腎組織Nrf2核蛋白表達水平顯著高于Con組，Nrf2核蛋白上調(diào)，可能與Dox激活機體炎癥有關(guān)，因此表現(xiàn)為腎臟損傷。在SF組中，表現(xiàn)出高表達的Nrf2水平和顯著降低的腎臟損傷評分，且炎性因子的表達遠低于Model組，這表明SF可通過上調(diào)Nrf2的表達來減輕Dox誘導(dǎo)腎損傷的加重。

正常生理條件下，Nrf2與其內(nèi)源性抑制劑Keap1作為一種普遍存在的、進化上保守的細胞內(nèi)防御機制來對抗炎性反應(yīng)。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，Nrf2從Keap1分離并易位到細胞核，并與Maf蛋白異二聚體結(jié)合。異源二聚體復(fù)合物可識別結(jié)合到AREs，啟動其下游多個抗氧化基因和解毒酶進行轉(zhuǎn)錄翻譯，并以此方式對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。Nrf2在影響不同系統(tǒng)的炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，其中包括胃炎、肝損傷、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。Nrf2-/-動物比WT動物表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥和組織損傷癥狀。在LPS誘導(dǎo)的肺膿毒癥的Nrf2敲除小鼠模型中，NF-κB可調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的激活，如COX-2、IL-13、IL-6和TNF-α[15]。因此，認為Nrf2信號通路在炎癥性疾病中具有保護作用。

Nrf2/ARE信號通路在炎癥性疾病中發(fā)揮了重要保護作用，Nrf2可上調(diào)SF表達，是Nrf2基因最重要的激活劑[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SF預(yù)處理后Nrf2表達水平顯著提高，腎臟形態(tài)學(xué)上觀察有明顯的改善作用，并伴隨尿蛋白、血清白蛋白和促炎因子的下調(diào)，表明了從某種程度上SF可誘導(dǎo)上調(diào)Nrf2的表達從而發(fā)揮保護腎功能的作用。本研究從幼鼠腎病綜合征模型入手，探索了SF在該疾病中的干預(yù)作用，說明了其在Nrf2/ARE通路中扮演的基本角色。在隨后的研究中，將會繼續(xù)在細胞水平上著重探討其分子通路的機制和蛋白相互作用。

綜上所述，SF可緩解Dox誘導(dǎo)的幼鼠腎病綜合征功能損傷和炎癥狀態(tài)，可能是通過激活Nrf2/ARE來發(fā)揮作用的。