呂 斌,凌圣惠,黎高文,梁 艷
廣西壯族自治區(qū)玉林市第一人民醫(yī)院感染管理科,玉林 537000
蘿卜硫素(sulforaphane,SF)是一種在十字花科蔬菜中發(fā)現(xiàn)的異硫氰酸酯[1],具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用,被認為是對抗炎癥反應(yīng)的有力分子[2]。
腎病綜合征主要表現(xiàn)為高脂血癥、蛋白尿、水腫和低蛋白血癥。多種疾病和因素可導(dǎo)致繼發(fā)性腎病綜合征[3]。炎癥是一種重要的病理反應(yīng),被認為在腎病綜合征的發(fā)病機制中發(fā)揮主導(dǎo)作用[4],與腎病綜合征密切相關(guān)[5]。
核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elemen,ARE)結(jié)合的細胞保護基因的轉(zhuǎn)錄激活因子,通過協(xié)調(diào)炎癥細胞的募集和ARE調(diào)節(jié)基因表達來促進抗炎過程[6]。Nrf2的激活可阻止脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)[7]。
本文選取SD幼鼠作為實驗對象,用多柔比星(doxorubicin,Dox)誘發(fā)幼鼠腎病綜合征模型,觀察SF是否可以通過誘導(dǎo)Nrf2的表達,發(fā)揮改善腎病綜合征的作用,為臨床防治提供新思路。
全自動生化分析儀(山東科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);微量移液器(德國Eppendorf公司);RM2235徠卡切片機(德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司);多功能酶標儀(美國Molecular Device公司);CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司);蛋白凝膠電泳儀(上海天能科技有限公司)。
蘿卜硫素(質(zhì)量分數(shù)≥99.98%,美國Sigma-Aldrich公司);注射用鹽酸多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);40 g·L-1多聚甲醛固定液(北京索萊寶生物科技公司);尿蛋白、血清白蛋白、白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(美國R&D公司);BCA蛋白定量分析試劑盒和RIPA裂解液,均購自碧云天生物技術(shù)有限公司);5×loading buffer蛋白預(yù)混液(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);一抗:兔抗大鼠Nrf2、β-actin抗體,山羊抗兔辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記二抗,均購自英國Abcam公司。
SPF級雄性SD幼鼠32只,3周齡,體質(zhì)量(45±1) g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號為SCXK(京)2019-0009。
SD幼鼠隨機均分為4組,Con組(對照組)、Model組(模型組)、SF組(蘿卜硫素組)和SF溶劑組,每組8只。SF組和SF溶劑組分別腹腔注射15 mg·kg-1SF和等體積的注射用生理鹽水作為溶媒對照,每天2次,間隔8 h,連續(xù)注射3 d。制備Dox誘導(dǎo)的腎病綜合征模型則參照之前的造模方法[8],第4天除Con組外均給予1 mg·mL-1Dox(注射用生理鹽水溶解),尾靜脈2次給藥(4.0、2.5 mg·kg-1),2次間隔1周,Con組在相同處理條件下注射等體積的注射用生理鹽水。幼鼠出現(xiàn)蛋白尿表明腎功能受到損傷,造模成功。
第2次給藥后3 d收集24 h尿液用于檢測尿蛋白的排泄情況。隨后用0.1 g·L-1巴比妥鈉麻醉幼鼠,腹主動脈取血檢測血清白蛋白、IL-18和IL-1β表達水平。取血后取出幼鼠腎臟,組織學(xué)固定后,脫水包埋進行HE染色。
ELISA法對尿蛋白、血清白蛋白水平及促炎因子IL-18和IL-1β血清質(zhì)量濃度進行定量。用標準BCA方法進行蛋白質(zhì)測定。根據(jù)試劑盒方案制備對照品和樣品,并在免疫測定板上孵育30 min。洗孔6次,每孔加入各自對應(yīng)抗體,繼續(xù)孵育1 h。再次洗滌板,將包含的兔抗鼠IgG與HRP偶聯(lián)物加入每個孔中,并將板溫育30 min。洗滌板并加入TMB底物用于顯色。10 min后停止反應(yīng),在450 nm處讀取吸光度。標準曲線用于確定樣品中的質(zhì)量濃度。
觀察腎臟組織病理。用9 g·L-1注射用氯化鈉溶液浸洗左側(cè)腎臟組織,用手術(shù)刀切取2 mm厚的組織塊,用40 g·L-1多聚甲醛固定液固定,經(jīng)乙醇梯度脫水置換和二甲苯脫醇處理后石蠟包埋,切片和染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)學(xué)變化結(jié)果,每張切片隨機選擇10個視野進行觀察評分。
用RIPA裂解液抽提腎臟蛋白,并用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度,用5×loading buffer樣本前預(yù)混后進行熱變性處理。每孔加入變性后蛋白20 μg,進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗體Nrf2,4 ℃過夜孵育,次日TBST漂洗3次,每次8 min,加入對應(yīng)種屬的二抗孵育,顯色,并用ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)和Image J軟件對結(jié)果進行灰度分析。
Con組可觀察到腎小球囊壁基底膜質(zhì)地均勻,細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)排列整齊,見圖1A;Model組和SF溶劑組分別呈現(xiàn)出腎小球球內(nèi)膜細胞不同程度地紊亂排列、細胞空泡和水腫,見圖1B、圖1D。同SF溶劑組相比,細胞核排列較整齊,質(zhì)地較均勻,見圖1C。另外,從觀察腎臟組織的評分結(jié)果可得出,與Con組比較,SF組、SF溶劑組和Model組腎損傷評分顯著升高(P<0.05),其中Model組尤為明顯,而SF的預(yù)處理可以顯著降低腎損傷評分,且高于SF組(P<0.05);Model組與SF溶劑組腎臟組織病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
注:A.Con組;B.Model組;C.SF組;D.SF溶劑組。
表1 各組幼鼠腎臟組織病理學(xué)評分
尾靜脈注射多柔比星后,Model組、SF組及SF溶劑組尿蛋白與血清白蛋白水平顯著高于Con組(P<0.05)。Model組24 h尿蛋白和血清白蛋白高于Con組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SF預(yù)處理后可明顯降低尿蛋白和血清白蛋白的表達水平,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但SF溶劑組和Model組尿蛋白及血清白蛋白比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 各組幼鼠尿蛋白和血清白蛋白水平比較
Model組和SF溶劑組幼鼠血清IL-18和IL-1β含量高于Con組(P<0.05);SF組IL-18和IL-1β含量低于Model組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Model組IL-18和IL-1β含量與SF溶劑組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 各組幼鼠血清IL-18和IL-1β比較
與Con組比較,Model組、SF組和SF溶劑組Nrf2核蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),其中SF組上調(diào)更顯著,為SF溶劑組的2倍(P<0.05);Model組與SF溶劑組Nrf2核蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。
本研究結(jié)果顯示,Model組和SF溶媒組Dox注射后10 d腎損傷組織評分顯著升高,同時2組炎性因子IL-18和IL-1β均出現(xiàn)上調(diào)。
有報道顯示,泛素特異性肽酶10可減輕敗血癥引起的腎功能障礙,并減少腎小管上皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激[9]。多柔比星誘導(dǎo)的腎病綜合征模型是目前公認的造模方法,其機制可能與氧化應(yīng)激相關(guān),研究表明,多柔比星造模處理后,模型組幼鼠腎組織中丙二醛含量明顯升高,并表現(xiàn)出時間依賴性[10]。
注:A.Con組;B.Model組;C.SF組;D.SF溶劑組。與Con組比較,*P<0.05;與Model組比較,#P<0.05;與SF溶劑組比較,%P<0.05。
SF是一種廣為人知的炎癥抑制劑。有研究顯示,SF抑制了LPS激活的N9細胞中一氧化氮、活性氧和促炎細胞因子的產(chǎn)生[11]。SUBEDI L等[12]還觀察到,SF抑制了LPS激活的小膠質(zhì)細胞中一氧化氮的產(chǎn)生和LPS激活的小膠質(zhì)細胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和COX-2的表達水平。此外,Nrf2和血紅素加氧酶-1的激活可增強抗炎細胞因子的產(chǎn)生,尤其是IL-10,以此表明SF的抗炎潛力[13]。本研究結(jié)果顯示,Model組腎組織Nrf2核蛋白表達水平顯著高于Con組,Nrf2核蛋白上調(diào),可能與Dox激活機體炎癥有關(guān),因此表現(xiàn)為腎臟損傷。在SF組中,表現(xiàn)出高表達的Nrf2水平和顯著降低的腎臟損傷評分,且炎性因子的表達遠低于Model組,這表明SF可通過上調(diào)Nrf2的表達來減輕Dox誘導(dǎo)腎損傷的加重。
正常生理條件下,Nrf2與其內(nèi)源性抑制劑Keap1作為一種普遍存在的、進化上保守的細胞內(nèi)防御機制來對抗炎性反應(yīng)。炎癥反應(yīng)發(fā)生時,Nrf2從Keap1分離并易位到細胞核,并與Maf蛋白異二聚體結(jié)合。異源二聚體復(fù)合物可識別結(jié)合到AREs,啟動其下游多個抗氧化基因和解毒酶進行轉(zhuǎn)錄翻譯,并以此方式對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。Nrf2在影響不同系統(tǒng)的炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用,其中包括胃炎、肝損傷、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。Nrf2-/-動物比WT動物表現(xiàn)出更嚴重的炎癥和組織損傷癥狀。在LPS誘導(dǎo)的肺膿毒癥的Nrf2敲除小鼠模型中,NF-κB可調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的激活,如COX-2、IL-13、IL-6和TNF-α[15]。因此,認為Nrf2信號通路在炎癥性疾病中具有保護作用。
Nrf2/ARE信號通路在炎癥性疾病中發(fā)揮了重要保護作用,Nrf2可上調(diào)SF表達,是Nrf2基因最重要的激活劑[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SF預(yù)處理后Nrf2表達水平顯著提高,腎臟形態(tài)學(xué)上觀察有明顯的改善作用,并伴隨尿蛋白、血清白蛋白和促炎因子的下調(diào),表明了從某種程度上SF可誘導(dǎo)上調(diào)Nrf2的表達從而發(fā)揮保護腎功能的作用。本研究從幼鼠腎病綜合征模型入手,探索了SF在該疾病中的干預(yù)作用,說明了其在Nrf2/ARE通路中扮演的基本角色。在隨后的研究中,將會繼續(xù)在細胞水平上著重探討其分子通路的機制和蛋白相互作用。
綜上所述,SF可緩解Dox誘導(dǎo)的幼鼠腎病綜合征功能損傷和炎癥狀態(tài),可能是通過激活Nrf2/ARE來發(fā)揮作用的。