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        L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶和自發(fā)活動(dòng)的影響

        2023-01-16 13:42:52吳張良李霽宇胡慧娟張繼業(yè)
        西北藥學(xué)雜志 2023年1期
        關(guān)鍵詞:中樞灌胃酒精

        雒 磊,吳張良,李霽宇,王 陽,胡慧娟,張繼業(yè),胡 浩,李 帆*

        1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,西安 710061;2.陜西省西咸新區(qū)市場監(jiān)督管理局灃東新城分局,西安 710116;3.河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司,濟(jì)源 454650;4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西安 710061

        硒是人體必需的微量元素之一[1]。研究表明,硒具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、預(yù)防心血管疾病、解重金屬中毒等作用[2-4]。人體缺硒可引起某些重要器官的功能障礙,導(dǎo)致諸多嚴(yán)重疾病的發(fā)生[5-7]。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-selenium-methylselenocysteine, L-SeMC)是一種新型硒源類的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑,L-SeMC特殊的甲基化結(jié)構(gòu)使其直接分解生成甲基化硒,并進(jìn)入甲基硒代謝池,且具有在人體內(nèi)毒性低、生物利用率高、體內(nèi)代謝機(jī)制清晰等特點(diǎn)[8]。酒精作為外源性的化學(xué)物質(zhì),進(jìn)入機(jī)體后可作用于肝臟、心臟、大腦等重要器官,而硒的攝入對酒精引起的肝臟、心臟、大腦等器官損傷具有保護(hù)作用[9-10]。然而L-SeMC對酒精致中樞興奮作用的影響尚未見報(bào)道,本研究通過觀察L-SeMC對低劑量酒精致中樞興奮的作用,探討其對小鼠學(xué)習(xí)記憶和自發(fā)活動(dòng)的影響。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        實(shí)驗(yàn)所用自主活動(dòng)儀(ZZ-6)、跳臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(SDT-8)以及避暗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(PAT-8),均由成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)。酶標(biāo)儀(Multiskan FC),由賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)。

        1.2 試藥

        L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-SeMC),白色粉末,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%(HPLC),批號210801,購自河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司,用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度。56度紅星二鍋頭酒,批號SC11511160310087,北京紅星股份有限公司生產(chǎn)。ALT、AST、MDA和SOD試劑檢測盒,均購自北京索萊寶科技有限公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        昆明小鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量18~22 g,動(dòng)物許可證號為SCXK(陜)2018-001,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在溫度為25 ℃±2 ℃、相對濕度為50%~ 70 %的條件下飼養(yǎng),12 h明暗交替。

        2 方法

        2.1 中樞興奮作用酒精劑量探索

        以往研究多為酒精中毒對機(jī)體或動(dòng)物的影響,而酒精引起中樞興奮作用的劑量參考較少。結(jié)合本課題組前期研究以及初步預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量摸索,最終設(shè)定了0.8 、1.3、1.5、1.6 μg·kg-14個(gè)酒精劑量組,通過自發(fā)活動(dòng)檢測,以尋找引起小鼠中樞興奮作用酒精的合適劑量。

        2.2 動(dòng)物分組及處理

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對照組、酒精組、L-SeMC低劑量組、L-SeMC中劑量組、L-SeMC高劑量組。各組動(dòng)物禁食12 h,對照組與酒精組小鼠灌胃給予蒸餾水,其余3組小鼠分別給予L-SeMC 10.4、13.0、39.0 μg·kg-1。30 min后,對照組灌胃給予蒸餾水,其余組灌胃給予酒精1.5 g·kg-1,給藥容積均為0.01 mL·g-1。15 min后,進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)檢測、跳臺實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)。

        2.3 自發(fā)活動(dòng)檢測

        清理擦拭自主活動(dòng)儀各個(gè)通道,將小鼠放置在通道內(nèi)適應(yīng)1 min后開始檢測,記錄5 min內(nèi)小鼠在水平方向的活動(dòng)次數(shù)和垂直方向的站立次數(shù)。

        2.4 跳臺實(shí)驗(yàn)

        將小鼠置于跳臺箱內(nèi),讓小鼠在箱內(nèi)自由活動(dòng)2 min適應(yīng)環(huán)境,再通電(28 V)對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練5 min,小鼠被電擊會跳至安全臺上躲避電擊,并形成相關(guān)記憶。24 h后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),將小鼠置于跳臺箱安全臺上,以小鼠初次離開安全臺的時(shí)間為潛伏期,5 min內(nèi)離開跳臺的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。

        2.5 避暗實(shí)驗(yàn)

        將小鼠置于避暗箱內(nèi),讓小鼠在明、暗室自由活動(dòng)2 min適應(yīng)環(huán)境,再將暗室通電(28 V)對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練5 min,小鼠被電擊后會從暗室躲避回到明室,形成相關(guān)記憶。24 h后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),將小鼠置于明室后,以小鼠初次進(jìn)入暗室的時(shí)間為潛伏期,5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。

        2.6 生化指標(biāo)檢測

        行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死動(dòng)物,取動(dòng)物全血和肝臟組織。血液以6 000 r·min-1離心5 min,分離出血清,取血清100 μL,按試劑盒要求,檢測血清中ALT和AST的水平。取肝臟組織稱定質(zhì)量,按每0.1 g組織1 mL提取液的比例進(jìn)行研磨,提取組織蛋白,以12 000 r·min-1離心10 min,分離上清液,按試劑盒要求,取100 μL檢測肝臟組織中MDA含量。對蛋白上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度檢測,取18 μL蛋白上清液,按試劑盒要求檢測SOD的活性。

        2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        3 結(jié)果

        3.1 酒精對中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

        與空白對照組比較,0.8 g·kg-1酒精攝入對小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)無顯著影響(P>0.05)。而1.3、1.5、1.6 g·kg-1酒精攝入15 min后,小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)均明顯增多(P<0.01),且1.5 g·kg-1酒精攝入5 min站立次數(shù)也明顯增加(P<0.05)。上述結(jié)果提示,1.5 g·kg-1酒精是較為合適的引起小鼠中樞興奮的劑量。見表1。

        表1 不同劑量酒精對中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

        3.2 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

        與空白對照組比較,酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后,5 min活動(dòng)次數(shù)明顯增多(P<0.01),但5 min站立次數(shù)無明顯變化(P>0.05)。與酒精組比較,提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精,10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC均可顯著減少小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)(P<0.05,P<0.01),5 min站立次數(shù)也明顯減少(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果提示,L-SeMC對酒精致小鼠中樞興奮自發(fā)活動(dòng)有明顯抑制作用。見表2。

        表2 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

        3.3 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(跳臺法)

        與空白對照組比較,小鼠灌胃1.5 g·kg-1酒精15 min后,跳臺實(shí)驗(yàn)中小鼠潛伏期縮短,錯(cuò)誤次數(shù)增加,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與酒精組比較,提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精,10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05),13.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05),減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05),而39.0 μg·kg-1L-SeMC對潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明,10.4、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學(xué)習(xí)記憶功能的影響。見表3。

        表3 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(跳臺法)

        3.4 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(避暗法)

        與空白對照組比較,灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后,避暗實(shí)驗(yàn)中小鼠潛伏期顯著縮短(P<0.05),錯(cuò)誤次數(shù)增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與酒精組比較,提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精,10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05),減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)。而13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC對潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明,10.4 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學(xué)習(xí)記憶功能的影響。見表4。

        表4 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(避暗法)

        3.5 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

        與空白對照組比較,給予1.5 g·kg-1酒精15 min后,血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與酒精組比較,提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精,10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可不同程度降低血清ALT、AST水平(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明,3個(gè)劑量L-SeMC均可改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能。見表5。

        表5 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

        3.6 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

        與空白對照組比較,酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后,肝臟組織MDA含量增加(P<0.01),SOD活性減弱(P<0.01)。與酒精組比較,提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精,10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01),增強(qiáng)SOD活性(P<0.01)。結(jié)果表明,3個(gè)劑量L-SeMC均可顯著改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷。見表6。

        表6 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

        4 討論

        硒是人體所需的重要微量元素,我國已批準(zhǔn)的硒制品補(bǔ)劑主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒。無機(jī)硒主要包括亞硒酸鈉、硒酸鈉等,有機(jī)硒主要包括富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白和富硒食用菌粉等[11]。無機(jī)硒需進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)化才可被機(jī)體吸收,且毒性大,易引起中毒,實(shí)際應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。而有機(jī)硒如富硒酵母、硒蛋白和富硒食用菌粉等產(chǎn)品中硒含量不是固定的,且硒的有效補(bǔ)充劑量與中毒劑量較接近,因此這些有機(jī)硒的食用也存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)[12]。L-SeMC具有毒性低、生物利用率高、結(jié)構(gòu)明確、人體內(nèi)代謝機(jī)理清晰等特點(diǎn),是新型的硒源供體,從安全性而言,更適用于在藥食類制品中針對相關(guān)疾病發(fā)揮作用。

        硒對諸多酒精誘導(dǎo)的疾病有重要的治療作用,特別是對酒精引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用[13]。大量研究表明,過量酒精攝入可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、學(xué)習(xí)記憶能力下降,主要是因?yàn)榫凭苎杆偻高^血腦屏障進(jìn)入腦組織,對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,同時(shí)還可改變神經(jīng)細(xì)胞膜及突觸膜流動(dòng)性,干擾神經(jīng)細(xì)胞遞質(zhì)合成、釋放和回?cái)z,引起細(xì)胞和突觸功能障礙[14-15]。酒精的代謝主要依賴于肝臟的乙醇脫氫酶等關(guān)鍵酶,在其作用下酒精最終轉(zhuǎn)化為乙酸,進(jìn)入三羧酸循環(huán),該途徑可代謝肝臟中80%的酒精,發(fā)揮重要的解酒作用,因此提高乙醇脫氫酶活性可加速酒精的體內(nèi)代謝,在一定程度上可緩解酒精引起的疾病癥狀[16-17]。研究報(bào)道,復(fù)方枳椇子制劑和紫蘇籽肽復(fù)合硒可提高乙醇脫氫酶活力,提高解酒功能[18]。本研究中L-SeMC提供的甲基硒可快速發(fā)揮硒的生物學(xué)作用,降低酒精引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性,可能與其改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能、加速酒精代謝有關(guān)。此外,L-SeMC在加速酒精代謝的同時(shí),也可能直接通過其抗氧化作用保護(hù)腦組織。比如硒可通過增加谷胱甘肽過氧化物酶抑制脂質(zhì)過氧化,進(jìn)而減輕ROS系統(tǒng)帶來的氧化損傷,這可能與L-SeMC改善受損的學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)[19-20]。本研究中L-SeMC可明顯改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷,發(fā)揮潛在護(hù)肝作用,加速酒精代謝,從而改善學(xué)習(xí)記憶。L-SeMC改善學(xué)習(xí)記憶能力與其劑量關(guān)系密切,本研究中10.4 、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學(xué)習(xí)記憶功能的降低,10.4 μg·kg-1對應(yīng)L-SeMC的人體每日推薦劑量為80 μg,13.0 μg·kg-1對應(yīng)L-SeMC的國標(biāo)建議人體每日最大用量為100 μg。而3倍于人體每日最大用量的超大劑量L-SeMC 39.0 μg·kg-1對酒精致中樞興奮引起的學(xué)習(xí)記憶功能降低無明顯影響。以上結(jié)果提示,L-SeMC在一定范圍內(nèi)才能發(fā)揮保護(hù)作用。此外,10.4 、13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著抑制酒精引起的小鼠中樞興奮自發(fā)活動(dòng),這說明酒精引起學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)關(guān)系不甚密切,而與酒精對大腦的直接作用有關(guān)。

        綜上所述,L-SeMC作為一種新的硒供體,在一定的劑量范圍內(nèi)可改善酒精致中樞興奮對學(xué)習(xí)記憶功能的降低,抑制中樞興奮自發(fā)活動(dòng),其機(jī)制可能與改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能和肝臟氧化損傷有關(guān),這為L-SeMC的應(yīng)用和推廣提供了新的參考依據(jù)。

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