雒 磊，吳張良，李霽宇，王 陽(yáng)，胡慧娟，張繼業(yè)，胡 浩，李 帆*

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061；2.陜西省西咸新區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局灃東新城分局，西安 710116；3.河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)源 454650；4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安 710061

硒是人體必需的微量元素之一[1]。研究表明，硒具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、預(yù)防心血管疾病、解重金屬中毒等作用[2-4]。人體缺硒可引起某些重要器官的功能障礙，導(dǎo)致諸多嚴(yán)重疾病的發(fā)生[5-7]。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-selenium-methylselenocysteine, L-SeMC)是一種新型硒源類的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，L-SeMC特殊的甲基化結(jié)構(gòu)使其直接分解生成甲基化硒，并進(jìn)入甲基硒代謝池，且具有在人體內(nèi)毒性低、生物利用率高、體內(nèi)代謝機(jī)制清晰等特點(diǎn)[8]。酒精作為外源性的化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)入機(jī)體后可作用于肝臟、心臟、大腦等重要器官，而硒的攝入對(duì)酒精引起的肝臟、心臟、大腦等器官損傷具有保護(hù)作用[9-10]。然而L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮作用的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)觀察L-SeMC對(duì)低劑量酒精致中樞興奮的作用，探討其對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶和自發(fā)活動(dòng)的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)所用自主活動(dòng)儀(ZZ-6)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(SDT-8)以及避暗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(PAT-8)，均由成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)。酶標(biāo)儀(Multiskan FC)，由賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試藥

L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-SeMC)，白色粉末，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%(HPLC)，批號(hào)210801，購(gòu)自河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司，用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度。56度紅星二鍋頭酒，批號(hào)SC11511160310087，北京紅星股份有限公司生產(chǎn)。ALT、AST、MDA和SOD試劑檢測(cè)盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(陜)2018-001，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在溫度為25 ℃±2 ℃、相對(duì)濕度為50%～ 70 %的條件下飼養(yǎng)，12 h明暗交替。

2 方法

2.1 中樞興奮作用酒精劑量探索

以往研究多為酒精中毒對(duì)機(jī)體或動(dòng)物的影響，而酒精引起中樞興奮作用的劑量參考較少。結(jié)合本課題組前期研究以及初步預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量摸索，最終設(shè)定了0.8 、1.3、1.5、1.6 μg·kg-14個(gè)酒精劑量組，通過(guò)自發(fā)活動(dòng)檢測(cè)，以尋找引起小鼠中樞興奮作用酒精的合適劑量。

2.2 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、酒精組、L-SeMC低劑量組、L-SeMC中劑量組、L-SeMC高劑量組。各組動(dòng)物禁食12 h，對(duì)照組與酒精組小鼠灌胃給予蒸餾水，其余3組小鼠分別給予L-SeMC 10.4、13.0、39.0 μg·kg-1。30 min后，對(duì)照組灌胃給予蒸餾水，其余組灌胃給予酒精1.5 g·kg-1，給藥容積均為0.01 mL·g-1。15 min后，進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)檢測(cè)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)。

2.3 自發(fā)活動(dòng)檢測(cè)

清理擦拭自主活動(dòng)儀各個(gè)通道，將小鼠放置在通道內(nèi)適應(yīng)1 min后開(kāi)始檢測(cè)，記錄5 min內(nèi)小鼠在水平方向的活動(dòng)次數(shù)和垂直方向的站立次數(shù)。

2.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

將小鼠置于跳臺(tái)箱內(nèi)，讓小鼠在箱內(nèi)自由活動(dòng)2 min適應(yīng)環(huán)境，再通電(28 V)對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練5 min，小鼠被電擊會(huì)跳至安全臺(tái)上躲避電擊，并形成相關(guān)記憶。24 h后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠置于跳臺(tái)箱安全臺(tái)上，以小鼠初次離開(kāi)安全臺(tái)的時(shí)間為潛伏期，5 min內(nèi)離開(kāi)跳臺(tái)的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。

2.5 避暗實(shí)驗(yàn)

將小鼠置于避暗箱內(nèi)，讓小鼠在明、暗室自由活動(dòng)2 min適應(yīng)環(huán)境，再將暗室通電(28 V)對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練5 min，小鼠被電擊后會(huì)從暗室躲避回到明室，形成相關(guān)記憶。24 h后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠置于明室后，以小鼠初次進(jìn)入暗室的時(shí)間為潛伏期，5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。

2.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，取動(dòng)物全血和肝臟組織。血液以6 000 r·min-1離心5 min，分離出血清，取血清100 μL，按試劑盒要求，檢測(cè)血清中ALT和AST的水平。取肝臟組織稱定質(zhì)量，按每0.1 g組織1 mL提取液的比例進(jìn)行研磨，提取組織蛋白，以12 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，按試劑盒要求，取100 μL檢測(cè)肝臟組織中MDA含量。對(duì)蛋白上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度檢測(cè)，取18 μL蛋白上清液，按試劑盒要求檢測(cè)SOD的活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 酒精對(duì)中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

與空白對(duì)照組比較，0.8 g·kg-1酒精攝入對(duì)小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。而1.3、1.5、1.6 g·kg-1酒精攝入15 min后，小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)均明顯增多(P<0.01)，且1.5 g·kg-1酒精攝入5 min站立次數(shù)也明顯增加(P<0.05)。上述結(jié)果提示，1.5 g·kg-1酒精是較為合適的引起小鼠中樞興奮的劑量。見(jiàn)表1。

表1 不同劑量酒精對(duì)中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

3.2 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

與空白對(duì)照組比較，酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，5 min活動(dòng)次數(shù)明顯增多(P<0.01)，但5 min站立次數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC均可顯著減少小鼠5 min活動(dòng)次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，5 min站立次數(shù)也明顯減少(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果提示，L-SeMC對(duì)酒精致小鼠中樞興奮自發(fā)活動(dòng)有明顯抑制作用。見(jiàn)表2。

表2 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

3.3 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(跳臺(tái)法)

與空白對(duì)照組比較，小鼠灌胃1.5 g·kg-1酒精15 min后，跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中小鼠潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長(zhǎng)潛伏期(P<0.05)，13.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長(zhǎng)潛伏期(P<0.05)，減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)，而39.0 μg·kg-1L-SeMC對(duì)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明，10.4、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響。見(jiàn)表3。

表3 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(跳臺(tái)法)

3.4 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(避暗法)

與空白對(duì)照組比較，灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，避暗實(shí)驗(yàn)中小鼠潛伏期顯著縮短(P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長(zhǎng)潛伏期(P<0.05)，減少錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)。而13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC對(duì)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明，10.4 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響。見(jiàn)表4。

表4 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響(避暗法)

3.5 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

與空白對(duì)照組比較，給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可不同程度降低血清ALT、AST水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，3個(gè)劑量L-SeMC均可改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能。見(jiàn)表5。

表5 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

3.6 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

與空白對(duì)照組比較，酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，肝臟組織MDA含量增加(P<0.01)，SOD活性減弱(P<0.01)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01)，增強(qiáng)SOD活性(P<0.01)。結(jié)果表明，3個(gè)劑量L-SeMC均可顯著改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷。見(jiàn)表6。

表6 L-SeMC對(duì)酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

4 討論

硒是人體所需的重要微量元素，我國(guó)已批準(zhǔn)的硒制品補(bǔ)劑主要有無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒。無(wú)機(jī)硒主要包括亞硒酸鈉、硒酸鈉等，有機(jī)硒主要包括富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白和富硒食用菌粉等[11]。無(wú)機(jī)硒需進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)化才可被機(jī)體吸收，且毒性大，易引起中毒，實(shí)際應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。而有機(jī)硒如富硒酵母、硒蛋白和富硒食用菌粉等產(chǎn)品中硒含量不是固定的，且硒的有效補(bǔ)充劑量與中毒劑量較接近，因此這些有機(jī)硒的食用也存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)[12]。L-SeMC具有毒性低、生物利用率高、結(jié)構(gòu)明確、人體內(nèi)代謝機(jī)理清晰等特點(diǎn)，是新型的硒源供體，從安全性而言，更適用于在藥食類制品中針對(duì)相關(guān)疾病發(fā)揮作用。

硒對(duì)諸多酒精誘導(dǎo)的疾病有重要的治療作用，特別是對(duì)酒精引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用[13]。大量研究表明，過(guò)量酒精攝入可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、學(xué)習(xí)記憶能力下降，主要是因?yàn)榫凭苎杆偻高^(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)還可改變神經(jīng)細(xì)胞膜及突觸膜流動(dòng)性，干擾神經(jīng)細(xì)胞遞質(zhì)合成、釋放和回?cái)z，引起細(xì)胞和突觸功能障礙[14-15]。酒精的代謝主要依賴于肝臟的乙醇脫氫酶等關(guān)鍵酶，在其作用下酒精最終轉(zhuǎn)化為乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，該途徑可代謝肝臟中80%的酒精，發(fā)揮重要的解酒作用，因此提高乙醇脫氫酶活性可加速酒精的體內(nèi)代謝，在一定程度上可緩解酒精引起的疾病癥狀[16-17]。研究報(bào)道，復(fù)方枳椇子制劑和紫蘇籽肽復(fù)合硒可提高乙醇脫氫酶活力，提高解酒功能[18]。本研究中L-SeMC提供的甲基硒可快速發(fā)揮硒的生物學(xué)作用，降低酒精引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，可能與其改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能、加速酒精代謝有關(guān)。此外，L-SeMC在加速酒精代謝的同時(shí)，也可能直接通過(guò)其抗氧化作用保護(hù)腦組織。比如硒可通過(guò)增加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而減輕ROS系統(tǒng)帶來(lái)的氧化損傷，這可能與L-SeMC改善受損的學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)[19-20]。本研究中L-SeMC可明顯改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷，發(fā)揮潛在護(hù)肝作用，加速酒精代謝，從而改善學(xué)習(xí)記憶。L-SeMC改善學(xué)習(xí)記憶能力與其劑量關(guān)系密切，本研究中10.4 、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的降低，10.4 μg·kg-1對(duì)應(yīng)L-SeMC的人體每日推薦劑量為80 μg，13.0 μg·kg-1對(duì)應(yīng)L-SeMC的國(guó)標(biāo)建議人體每日最大用量為100 μg。而3倍于人體每日最大用量的超大劑量L-SeMC 39.0 μg·kg-1對(duì)酒精致中樞興奮引起的學(xué)習(xí)記憶功能降低無(wú)明顯影響。以上結(jié)果提示，L-SeMC在一定范圍內(nèi)才能發(fā)揮保護(hù)作用。此外，10.4 、13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著抑制酒精引起的小鼠中樞興奮自發(fā)活動(dòng)，這說(shuō)明酒精引起學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)關(guān)系不甚密切，而與酒精對(duì)大腦的直接作用有關(guān)。

綜上所述，L-SeMC作為一種新的硒供體，在一定的劑量范圍內(nèi)可改善酒精致中樞興奮對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的降低，抑制中樞興奮自發(fā)活動(dòng)，其機(jī)制可能與改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能和肝臟氧化損傷有關(guān)，這為L(zhǎng)-SeMC的應(yīng)用和推廣提供了新的參考依據(jù)。