雒 磊，吳張良，李霽宇，王 陽，胡慧娟，張繼業(yè)，胡 浩，李 帆*

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院，西安 710061；2.陜西省西咸新區(qū)市場監(jiān)督管理局灃東新城分局，西安 710116；3.河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司，濟源 454650；4.西安交通大學醫(yī)學部，西安 710061

硒是人體必需的微量元素之一[1]。研究表明，硒具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、預防心血管疾病、解重金屬中毒等作用[2-4]。人體缺硒可引起某些重要器官的功能障礙，導致諸多嚴重疾病的發(fā)生[5-7]。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-selenium-methylselenocysteine, L-SeMC)是一種新型硒源類的食品營養(yǎng)強化劑，L-SeMC特殊的甲基化結(jié)構(gòu)使其直接分解生成甲基化硒，并進入甲基硒代謝池，且具有在人體內(nèi)毒性低、生物利用率高、體內(nèi)代謝機制清晰等特點[8]。酒精作為外源性的化學物質(zhì)，進入機體后可作用于肝臟、心臟、大腦等重要器官，而硒的攝入對酒精引起的肝臟、心臟、大腦等器官損傷具有保護作用[9-10]。然而L-SeMC對酒精致中樞興奮作用的影響尚未見報道，本研究通過觀察L-SeMC對低劑量酒精致中樞興奮的作用，探討其對小鼠學習記憶和自發(fā)活動的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

實驗所用自主活動儀(ZZ-6)、跳臺實驗系統(tǒng)(SDT-8)以及避暗實驗系統(tǒng)(PAT-8)，均由成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)。酶標儀(Multiskan FC)，由賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試藥

L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-SeMC)，白色粉末，質(zhì)量分數(shù)>99%(HPLC)，批號210801，購自河南希百康健康產(chǎn)業(yè)有限公司，用蒸餾水配制成不同質(zhì)量濃度。56度紅星二鍋頭酒，批號SC11511160310087，北京紅星股份有限公司生產(chǎn)。ALT、AST、MDA和SOD試劑檢測盒，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

昆明小鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量18～22 g，動物許可證號為SCXK(陜)2018-001，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。在溫度為25 ℃±2 ℃、相對濕度為50%～ 70 %的條件下飼養(yǎng)，12 h明暗交替。

2 方法

2.1 中樞興奮作用酒精劑量探索

以往研究多為酒精中毒對機體或動物的影響，而酒精引起中樞興奮作用的劑量參考較少。結(jié)合本課題組前期研究以及初步預實驗劑量摸索，最終設定了0.8 、1.3、1.5、1.6 μg·kg-14個酒精劑量組，通過自發(fā)活動檢測，以尋找引起小鼠中樞興奮作用酒精的合適劑量。

2.2 動物分組及處理

實驗動物隨機分為對照組、酒精組、L-SeMC低劑量組、L-SeMC中劑量組、L-SeMC高劑量組。各組動物禁食12 h，對照組與酒精組小鼠灌胃給予蒸餾水，其余3組小鼠分別給予L-SeMC 10.4、13.0、39.0 μg·kg-1。30 min后，對照組灌胃給予蒸餾水，其余組灌胃給予酒精1.5 g·kg-1，給藥容積均為0.01 mL·g-1。15 min后，進行自發(fā)活動檢測、跳臺實驗和避暗實驗。

2.3 自發(fā)活動檢測

清理擦拭自主活動儀各個通道，將小鼠放置在通道內(nèi)適應1 min后開始檢測，記錄5 min內(nèi)小鼠在水平方向的活動次數(shù)和垂直方向的站立次數(shù)。

2.4 跳臺實驗

將小鼠置于跳臺箱內(nèi)，讓小鼠在箱內(nèi)自由活動2 min適應環(huán)境，再通電(28 V)對小鼠進行訓練5 min，小鼠被電擊會跳至安全臺上躲避電擊，并形成相關(guān)記憶。24 h后進行正式實驗，將小鼠置于跳臺箱安全臺上，以小鼠初次離開安全臺的時間為潛伏期，5 min內(nèi)離開跳臺的次數(shù)為錯誤次數(shù)。

2.5 避暗實驗

將小鼠置于避暗箱內(nèi)，讓小鼠在明、暗室自由活動2 min適應環(huán)境，再將暗室通電(28 V)對小鼠進行訓練5 min，小鼠被電擊后會從暗室躲避回到明室，形成相關(guān)記憶。24 h后進行正式實驗，將小鼠置于明室后，以小鼠初次進入暗室的時間為潛伏期，5 min內(nèi)進入暗室的次數(shù)為錯誤次數(shù)。

2.6 生化指標檢測

行為學實驗結(jié)束后，處死動物，取動物全血和肝臟組織。血液以6 000 r·min-1離心5 min，分離出血清，取血清100 μL，按試劑盒要求，檢測血清中ALT和AST的水平。取肝臟組織稱定質(zhì)量，按每0.1 g組織1 mL提取液的比例進行研磨，提取組織蛋白，以12 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，按試劑盒要求，取100 μL檢測肝臟組織中MDA含量。對蛋白上清液進行蛋白質(zhì)量濃度檢測，取18 μL蛋白上清液，按試劑盒要求檢測SOD的活性。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 酒精對中樞興奮小鼠自發(fā)活動的影響

與空白對照組比較，0.8 g·kg-1酒精攝入對小鼠5 min活動次數(shù)和站立次數(shù)無顯著影響(P>0.05)。而1.3、1.5、1.6 g·kg-1酒精攝入15 min后，小鼠5 min活動次數(shù)均明顯增多(P<0.01)，且1.5 g·kg-1酒精攝入5 min站立次數(shù)也明顯增加(P<0.05)。上述結(jié)果提示，1.5 g·kg-1酒精是較為合適的引起小鼠中樞興奮的劑量。見表1。

表1 不同劑量酒精對中樞興奮小鼠自發(fā)活動的影響

3.2 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動的影響

與空白對照組比較，酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，5 min活動次數(shù)明顯增多(P<0.01)，但5 min站立次數(shù)無明顯變化(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC均可顯著減少小鼠5 min活動次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，5 min站立次數(shù)也明顯減少(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果提示，L-SeMC對酒精致小鼠中樞興奮自發(fā)活動有明顯抑制作用。見表2。

表2 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠自發(fā)活動的影響

3.3 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學習記憶的影響(跳臺法)

與空白對照組比較，小鼠灌胃1.5 g·kg-1酒精15 min后，跳臺實驗中小鼠潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05)，13.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05)，減少錯誤次數(shù)(P<0.05)，而39.0 μg·kg-1L-SeMC對潛伏期和錯誤次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明，10.4、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學習記憶功能的影響。見表3。

表3 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學習記憶的影響(跳臺法)

3.4 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學習記憶的影響(避暗法)

與空白對照組比較，灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，避暗實驗中小鼠潛伏期顯著縮短(P<0.05)，錯誤次數(shù)增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4 μg·kg-1L-SeMC可顯著延長潛伏期(P<0.05)，減少錯誤次數(shù)(P<0.05)。而13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC對潛伏期和錯誤次數(shù)無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明，10.4 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學習記憶功能的影響。見表4。

表4 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠學習記憶的影響(避暗法)

3.5 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

與空白對照組比較，給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可不同程度降低血清ALT、AST水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明，3個劑量L-SeMC均可改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能。見表5。

表5 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝功能的影響

3.6 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

與空白對照組比較，酒精組小鼠灌胃給予1.5 g·kg-1酒精15 min后，肝臟組織MDA含量增加(P<0.01)，SOD活性減弱(P<0.01)。與酒精組比較，提前30 min灌胃給予不同劑量L-SeMC后再給予酒精，10.4、13.0、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著降低肝臟組織MDA含量(P<0.01)，增強SOD活性(P<0.01)。結(jié)果表明，3個劑量L-SeMC均可顯著改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷。見表6。

表6 L-SeMC對酒精致中樞興奮小鼠肝臟氧化損傷的影響

4 討論

硒是人體所需的重要微量元素，我國已批準的硒制品補劑主要有無機硒和有機硒。無機硒主要包括亞硒酸鈉、硒酸鈉等，有機硒主要包括富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白和富硒食用菌粉等[11]。無機硒需進行肝臟轉(zhuǎn)化才可被機體吸收，且毒性大，易引起中毒，實際應用受到嚴格限制。而有機硒如富硒酵母、硒蛋白和富硒食用菌粉等產(chǎn)品中硒含量不是固定的，且硒的有效補充劑量與中毒劑量較接近，因此這些有機硒的食用也存在一定的安全風險[12]。L-SeMC具有毒性低、生物利用率高、結(jié)構(gòu)明確、人體內(nèi)代謝機理清晰等特點，是新型的硒源供體，從安全性而言，更適用于在藥食類制品中針對相關(guān)疾病發(fā)揮作用。

硒對諸多酒精誘導的疾病有重要的治療作用，特別是對酒精引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護作用[13]。大量研究表明，過量酒精攝入可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂、學習記憶能力下降，主要是因為酒精能迅速透過血腦屏障進入腦組織，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒害作用，同時還可改變神經(jīng)細胞膜及突觸膜流動性，干擾神經(jīng)細胞遞質(zhì)合成、釋放和回攝，引起細胞和突觸功能障礙[14-15]。酒精的代謝主要依賴于肝臟的乙醇脫氫酶等關(guān)鍵酶，在其作用下酒精最終轉(zhuǎn)化為乙酸，進入三羧酸循環(huán)，該途徑可代謝肝臟中80%的酒精，發(fā)揮重要的解酒作用，因此提高乙醇脫氫酶活性可加速酒精的體內(nèi)代謝，在一定程度上可緩解酒精引起的疾病癥狀[16-17]。研究報道，復方枳椇子制劑和紫蘇籽肽復合硒可提高乙醇脫氫酶活力，提高解酒功能[18]。本研究中L-SeMC提供的甲基硒可快速發(fā)揮硒的生物學作用，降低酒精引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，可能與其改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能、加速酒精代謝有關(guān)。此外，L-SeMC在加速酒精代謝的同時，也可能直接通過其抗氧化作用保護腦組織。比如硒可通過增加谷胱甘肽過氧化物酶抑制脂質(zhì)過氧化，進而減輕ROS系統(tǒng)帶來的氧化損傷，這可能與L-SeMC改善受損的學習記憶能力有關(guān)[19-20]。本研究中L-SeMC可明顯改善酒精致中樞興奮小鼠肝臟的氧化損傷，發(fā)揮潛在護肝作用，加速酒精代謝，從而改善學習記憶。L-SeMC改善學習記憶能力與其劑量關(guān)系密切，本研究中10.4 、13.0 μg·kg-1L-SeMC可改善酒精致中樞興奮對學習記憶功能的降低，10.4 μg·kg-1對應L-SeMC的人體每日推薦劑量為80 μg，13.0 μg·kg-1對應L-SeMC的國標建議人體每日最大用量為100 μg。而3倍于人體每日最大用量的超大劑量L-SeMC 39.0 μg·kg-1對酒精致中樞興奮引起的學習記憶功能降低無明顯影響。以上結(jié)果提示，L-SeMC在一定范圍內(nèi)才能發(fā)揮保護作用。此外，10.4 、13.0 、39.0 μg·kg-1L-SeMC可顯著抑制酒精引起的小鼠中樞興奮自發(fā)活動，這說明酒精引起學習記憶能力下降可能與其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)關(guān)系不甚密切，而與酒精對大腦的直接作用有關(guān)。

綜上所述，L-SeMC作為一種新的硒供體，在一定的劑量范圍內(nèi)可改善酒精致中樞興奮對學習記憶功能的降低，抑制中樞興奮自發(fā)活動，其機制可能與改善酒精致中樞興奮小鼠的肝功能和肝臟氧化損傷有關(guān)，這為L-SeMC的應用和推廣提供了新的參考依據(jù)。