程繼業(yè)，姚 玲，周震宇，金偉斌，顧曉風(fēng)

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，蘇州 215104

美羅培南(meropenem)是一種半合成的廣譜碳青霉烯類抗生素，具有抗菌活性強(qiáng)、對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、副作用小等特點(diǎn)，對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較強(qiáng)的抗菌活性[1]，臨床用于混合感染和各種嚴(yán)重感染[2-5]，尤其多用于入住重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit，ICU)需進(jìn)行高強(qiáng)度的抗感染治療的患者[6]。本品對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟的毒副作用較小，臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)發(fā)生率低，但本品屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，在水溶液中不穩(wěn)定，易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì)，國內(nèi)外研究表明，包括聚合物在內(nèi)的高分子雜質(zhì)與β-內(nèi)酰胺類抗生素的變態(tài)反應(yīng)有密切聯(lián)系[7-9],因此建立聚合物雜質(zhì)的檢測方法對(duì)保障本品質(zhì)量十分重要。

《中國藥典》2020年版、《美國藥典》2021年版均收載了該品種，但均未單獨(dú)設(shè)置聚合物檢查項(xiàng)[10-11]。《歐洲藥典》10.0版在美羅培南原料的有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下，將美羅培南二聚體(雜質(zhì)B)作為特定雜質(zhì)控制[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道用Sephadex G-10葡聚糖凝膠色譜柱、TSK G2000SW/600以及G2000SWxl凝膠柱對(duì)美羅培南原料和制劑的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行測定[13-15]。G-10色譜法操作耗時(shí)，定量準(zhǔn)確度較低，已逐漸被高效凝膠色譜法代替[14,16]。相比G-10柱，2個(gè)G2000高效凝膠柱方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)美羅培南聚合物的分離，并通過質(zhì)譜法對(duì)分離得到的主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，為美羅培南二聚體和異構(gòu)體雜質(zhì)，由于缺少雜質(zhì)對(duì)照品，選擇以主成分外標(biāo)法[14]或自身對(duì)照法[15]對(duì)聚合物總量進(jìn)行控制。

本品為2021年國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，產(chǎn)品來自包括原研廠家在內(nèi)的11個(gè)生產(chǎn)廠家，涉及包括《中國藥典》在內(nèi)的7個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，只有YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)收載了聚合物檢查方法，在對(duì)應(yīng)企業(yè)產(chǎn)品分析中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)存在分析時(shí)間長、方法專屬性差、色譜柱效低、分離度差等問題[17-19]。本文在上述標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上選擇更高效的TSK G2000 SWxl色譜柱，優(yōu)化色譜條件，建立美羅培南聚合物雜質(zhì)的分析方法，對(duì)國內(nèi)上市的11家企業(yè)的33批產(chǎn)品進(jìn)行分析，并與基于《中國藥典》2020版及《歐洲藥典》10.0版開發(fā)的有關(guān)物質(zhì)方法測定結(jié)果進(jìn)行比較，探討高效凝膠色譜法(HPSEC)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)在測定抗生素聚合物方面的優(yōu)劣，為本品國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(配DAD檢測器，Empower Pro工作站)；梅特勒托利多XSE205DU電子天平；Millipore Milli-Q超純水儀。

1.2 試藥

美羅培南對(duì)照品(中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，批號(hào)130506，按美羅培南計(jì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.8%)；美羅培南雜質(zhì)A對(duì)照品(批號(hào)20200723，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.95%)，美羅培南雜質(zhì)B對(duì)照品(批號(hào)20201110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.49%)，均購自杭州卓越科技生物有限公司；注射用美羅培南(共33批，11個(gè)廠家，A～K)；三乙胺(Fisher Chemical，色譜純)；乙腈(Honeywell，色譜純)；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPSEC色譜條件與測定法

色譜柱為TOSOH TSK G2000 SWxl (30 cm×7.8 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為0.01 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39，pH7.0)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

取本品內(nèi)容物，相當(dāng)于美羅培南100 mg，置于50 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，溶液應(yīng)臨用新制。

測定法：取供試品溶液室溫放置1 h，精密量取20 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，美羅培南雜質(zhì)峰(相對(duì)保留時(shí)間約為0.8)與美羅培南峰的分離度應(yīng)不小于3.0，美羅培南峰的理論板數(shù)應(yīng)不低于5 000，色譜圖見圖1。精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，雜質(zhì)峰按峰面積歸一化法計(jì)算。

2.2 RP-HPLC色譜條件與測定法

色譜柱為SUMIPAX ODS A-212(150 cm×6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為1 mL·L-1三乙胺溶液[取三乙胺1.0 mL，加水900 mL，用磷酸溶液(1→10)調(diào)pH值至5.0±0.1，加水稀釋至1 000 mL]-乙腈(93.5∶6.5)；流速為1.6 mL·min-1；柱溫為40 ℃；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

取本品內(nèi)容物，用1 mL·L-1三乙胺溶液溶解并定量稀釋制成5 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液，溶液應(yīng)臨用新制。精密量取供試品溶液1 mL，置于200 mL量瓶中，用1 mL·L-1的三乙胺溶液稀釋制至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

測定法：取美羅培南對(duì)照品適量，加1 mL·L-1的三乙胺溶液溶解并定量稀釋成0.5 mg·mL-1的溶液，置于水浴中加熱1 h，放冷，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，美羅培南峰保留時(shí)間約為7 min，出峰順序依次為美羅培南開環(huán)物(雜質(zhì)A)、美羅培南與美羅培南二聚體(雜質(zhì)B)，雜質(zhì)A與美羅培南峰的分離度應(yīng)符合要求。再精密量取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄至主成分保留時(shí)間的3.5倍。如有雜質(zhì)峰，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算，其中雜質(zhì)A 結(jié)果乘以1.6。

2.3 HPSEC法專屬性實(shí)驗(yàn)用溶液配制

空白輔料溶液：本品處方中美羅培南與碳酸鈉的比例約為500∶104，據(jù)此配制空白輔料溶液。取碳酸鈉適量，加水溶解制成0.04 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

酸破壞溶液：稱取美羅培南對(duì)照品約200 mg，置于100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。量取儲(chǔ)備液10 mL，加入1 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，室溫放置100 min，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液至pH 7，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

堿破壞溶液：量取儲(chǔ)備液10 mL，加入1 mL 0.1 mol·L-1氫氧化鈉，室溫放置15 min，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶液至pH 7，同法濾過。

氧化破壞溶液：量取儲(chǔ)備液10 mL，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為30%過氧化氫溶液，室溫放置30 min，同法濾過。

高溫破壞溶液：量取儲(chǔ)備液10 mL，水浴60 ℃，保溫放置4 h，放冷，同法濾過。

光照破壞溶液：量取儲(chǔ)備液10 mL，置于光照實(shí)驗(yàn)箱中，可見光4 500±500 lx/紫外光200 W·hr·m-2條件下放置20 h，同法濾過。

2.4 HPSEC法的專屬性考察

本次國評(píng)品種中，3個(gè)企業(yè)適用的國家標(biāo)準(zhǔn)YBH00182011、YBH02162016、YBH02582015指定了不同的凝膠色譜柱：1)TSKG2000 SW/600(600 mm×7.5 mm，10 μm)、2)Shodex SUGAR ks-801(300 mm×8.0 mm，6 μm)、3)賽分Cef-SEC(300 mm×7.8 mm，5 μm)，對(duì)應(yīng)的典型色譜圖見圖2，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均存在分析時(shí)間長、檢測結(jié)果偏高、方法專屬性差和色譜柱效低的問題。綜合實(shí)驗(yàn)多種色譜柱后，本研究選擇填料粒徑更小、柱效更高的TSK G2000 SWxl (300 mm×7.8 mm，5 μm) 進(jìn)行方法優(yōu)化并驗(yàn)證。分別取2.3項(xiàng)下空白輔料溶液及破壞溶液按HPSEC法色譜條件分析，記錄色譜圖。

①空白輔料在美羅培南及相關(guān)雜質(zhì)處無干擾峰；②各種破壞條件均容易使美羅培南產(chǎn)生雜質(zhì)，雜質(zhì)分布于保留時(shí)間(RT)10 min至美羅培南主峰附近。③酸、堿、高溫、光照條件下均產(chǎn)生RT 11.9 min的主要雜質(zhì)峰。用DAD檢測器獲得紫外光譜，發(fā)現(xiàn)酸、堿、高溫條件下的峰具有相同的光譜，而光照條件下不同，說明在RT 11.9 min處可能存在不同的雜質(zhì)。④氧化破壞試驗(yàn)產(chǎn)生雜質(zhì)較復(fù)雜，超出了色譜柱的分離能力，導(dǎo)致雜質(zhì)與美羅培南不能完全分離，其余破壞條件用DAD檢測器對(duì)美羅培南主峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢查，峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)符合要求。見圖3。

注：美羅培南與雜質(zhì)峰的分離度為4.1，美羅培南峰的理論板數(shù)為13 901。

注：A.(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH00182011，色譜柱TSK G2000 SW/600); B.(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH02582015，色譜柱Shodex SUGAR ks-801); C.(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH02162016，色譜柱賽分Cef-SEC)。

2.5 美羅培南特定雜質(zhì)色譜峰位確認(rèn)

由于抗生素聚合物雜質(zhì)制備難度較大，目前尚無法定對(duì)照品。通過對(duì)本品雜質(zhì)研究文獻(xiàn)及國際藥典的查閱，確定美羅培南雜質(zhì)A及雜質(zhì)B是主要的相關(guān)雜質(zhì)，基本信息見表1。商業(yè)途徑獲得了這2個(gè)雜質(zhì)對(duì)照品，并對(duì)其在色譜過程中的峰位進(jìn)行確認(rèn)。

分別稱取雜質(zhì)A、B適量，用水溶解制成0.04 mg·mL-1的溶液，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。結(jié)果雜質(zhì)A與雜質(zhì)B保留時(shí)間基本重合(11.9 、11.7 min)，無法分離，也解釋了在樣品測試時(shí)不同廠家產(chǎn)品該位置處的色譜峰形不一致，可能由雜質(zhì)相對(duì)含量不同所致。雜質(zhì)A、雜質(zhì)B紫外光譜見表1，推測酸、堿、高溫條件下11.9 min的雜質(zhì)可能為雜質(zhì)A，光照條件下11.9 min的雜質(zhì)與雜質(zhì)B的紫外光譜存在差異，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢查顯示大于閾值，表明該峰位處存在多種成分。

發(fā)現(xiàn)本方法的專屬性問題后，我們又對(duì)3個(gè)法定方法的分離能力進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果情況相同，即法定方法均不能分離美羅培南的2個(gè)主要降解雜質(zhì)，方法擬控制的聚合物雜質(zhì)實(shí)際是二聚體和小分子雜質(zhì)總量。查閱至2022年1月美羅培南聚合物研究的文獻(xiàn)，普遍認(rèn)為分子排阻色譜分析美羅培南主峰前的雜質(zhì)峰是聚合物，均未述及小分子雜質(zhì)存在以及聚合物峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)問題，可以認(rèn)為，目前使用HPSEC進(jìn)行美羅培南聚合物分析的方法存在一定專屬性缺陷。

注：A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.高溫破壞；E.光照破壞。

如前所述，本品種7個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)中，YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 收載了聚合物項(xiàng)目，且使用的色譜柱類型、定量方法各不相同，為了以相同方法和尺度對(duì)各廠家樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，我們?nèi)允褂眯陆ǖ姆椒?，以雜質(zhì)總量為指標(biāo)，對(duì)方法其他參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證并評(píng)價(jià)各批次產(chǎn)品。

表1 美羅培南雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的基本信息

2.6 HPSEC法相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1溶液穩(wěn)定性 取供試品溶液，室溫放置，不同時(shí)間分析，考察總雜質(zhì)4 h的變化情況，結(jié)果總雜質(zhì)含量由0.14%升高到0.40%，說明水溶液不穩(wěn)定，應(yīng)臨用新制。

2.6.2方法重復(fù)性 取1批產(chǎn)品，按2.1項(xiàng)下方法制備5份供試品，進(jìn)樣分析。結(jié)果雜質(zhì)峰保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.1%，與主峰分離度RSD為1.1%，雜質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.03，方法重復(fù)性好。

2.6.3線性與雜質(zhì)A、雜質(zhì)B校正因子的測定 取美羅培南對(duì)照品，按2.1項(xiàng)下方法，配制系列溶液(相當(dāng)于供試品溶液中美羅培南質(zhì)量濃度的0.1%～150%)；取美羅培南雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對(duì)照品，同法配制系列溶液(相當(dāng)于供試品溶液中美羅培南質(zhì)量濃度的0.1%～2%)，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程，并計(jì)算校正因子。

美羅培南：y=12 103.0x-47 992.7，線性范圍為1.82～2 724.65 μg·mL-1，r=1.000 0。

雜質(zhì)A：y=1 805.1x-597.7，線性范圍為2.05～41.00 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為6.705。

雜質(zhì)B：y=5 609.2x-3 536.7，線性范圍為2.01～40.20 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為2.158。

2.6.4檢測限與定量限 分別取美羅培南、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，依法測定，按信噪比約3和10時(shí)的待測物質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限。結(jié)果見表2。

表2 檢測限與定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.5定量方式的考察 選取3個(gè)企業(yè)各1批樣品按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并分別精密量取1 mL置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為自身對(duì)照溶液，進(jìn)樣測定。各批樣品分別按峰面積歸一化和峰面積自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)總量百分?jǐn)?shù)。結(jié)果，企業(yè)A(批號(hào)2434C)為0.15%、0.16%；企業(yè)D(批號(hào)20047911)為0.39%、0.40%；企業(yè)H(批號(hào)9200301043)為0.26%、0.26%。2種定量方式所得結(jié)果一致，考慮到本品溶液狀態(tài)下的不穩(wěn)定性，選擇歸一化法進(jìn)行定量計(jì)算。

2.6.6方法耐用性 使用同一批樣品，對(duì)流動(dòng)相pH(6.8、7.2)、流速(0.7、0.9 mL·min-1)、色譜柱溫度(25、35 ℃)小范圍變化對(duì)檢測結(jié)果的影響進(jìn)行考察。結(jié)果，美羅培南理論板數(shù)、與雜質(zhì)峰分離度、雜質(zhì)總量檢測結(jié)果等主要參數(shù)無明顯變化。

2.7 RP-HPLC法的雜質(zhì)校正因子的測定

《中國藥典》2020年版未規(guī)定美羅培南雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的校正因子，歐洲藥典10.0版規(guī)定雜質(zhì)A校正因子1.6，YBH02582015標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定雜質(zhì)A校正因子1.62，雜質(zhì)B校正因子1.98。本文基于2個(gè)藥典方法，對(duì)雜質(zhì)的校正因子進(jìn)行確認(rèn)。

取美羅培南對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法，配制系列溶液；取美羅培南雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法，配制系列溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程，并計(jì)算校正因子。

美羅培南：y=6.104 5x-0.108 9，線性范圍為0.40～40.38 μg·mL-1，r=1.000 0。

雜質(zhì)A：y=3.859 0x-0.737 3，線性范圍為0.99～39.49 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為1.582。

雜質(zhì)B：y=5.257 7x-3.073 4，線性范圍為0.38～38.20 μg·mL-1，r=0.999 1；校正因子為1.161。

2.8 樣品測定結(jié)果的比較

將國內(nèi)上市的11個(gè)企業(yè)共33批樣品分別按2.1、2.2項(xiàng)下方法測定，比較雜質(zhì)檢測結(jié)果，見表3。其中，HPSEC法由于雜質(zhì)A、雜質(zhì)B不能分離，未引入校正因子，結(jié)果由峰面積歸一化法計(jì)算；RP-HPLC法中，雜質(zhì)A校正因子為1.582，與《歐洲藥典》中1.6一致，雜質(zhì)B為1.161，《歐洲藥典》中并未規(guī)定，考慮到測試誤差等因素，雜質(zhì)B結(jié)果沒有校正。

《中國藥典》2020年版有關(guān)物質(zhì)規(guī)定最大單雜質(zhì)不得過0.5%，總雜質(zhì)不得過1.5%。RP-HPLC法項(xiàng)下33批產(chǎn)品均符合規(guī)定，其中企業(yè)D、F、H、I雜質(zhì)含量較高，接近限度，企業(yè)A、C雜質(zhì)含量明顯好于其他廠商，H通過一致性評(píng)價(jià)后企業(yè)的產(chǎn)品雜質(zhì)水平明顯低于本廠其他產(chǎn)品。本品制劑處方簡單，而雜質(zhì)方面仍與原研產(chǎn)品存在明顯差距。

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016規(guī)定聚合物雜質(zhì)限度1.0%、0.8%、1.5%，HPSEC法項(xiàng)下所有批次產(chǎn)品均符合規(guī)定，且大幅低于限度。HPSEC法總雜質(zhì)結(jié)果明顯低于RP-HPLC法，說明本法雜質(zhì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性較低，可能由于在254 nm波長處檢測靈敏度低導(dǎo)致雜質(zhì)漏檢以及雜質(zhì)A、雜質(zhì)B沒有引入校正因子。

表3 HPSEC和RP-HPLC 2種方法檢測雜質(zhì)結(jié)果比較

3 討論

3.1 HPSEC法的專屬性

本文在YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 3個(gè)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立了HPSEC法對(duì)美羅培南在不同降解條件下產(chǎn)生的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)合主要降解雜質(zhì)的光譜信息并與雜質(zhì)對(duì)照品峰位的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HPSEC法對(duì)分離聚合物和小分子雜質(zhì)的專屬性存在問題，這也是目前用凝膠色譜方法對(duì)美羅培南聚合物進(jìn)行分析的共性問題[20]。該問題的解決有待高效凝膠色譜柱填料技術(shù)的進(jìn)一步提高以及多種現(xiàn)代色譜、質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用[21]。

3.2 HPSEC法的研究現(xiàn)狀和建議

在已有文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)中，HPSEC法研究美羅培南聚合物通常在254 nm波長處檢測[7-9]，這對(duì)易于水解形成開環(huán)的雜質(zhì)響應(yīng)很低(見表1雜質(zhì)A紫外光譜)，本研究在此條件下測得雜質(zhì)A校正因子為6.7，二聚體雜質(zhì)B校正因子為2.2，而已有文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)均未采用校正因子，致使雜質(zhì)含量被低估?！吨袊幍洹?020年版、《美國藥典》2021版和《歐洲藥典》10.0版在美羅培南原料或制劑項(xiàng)下均未收載聚合物檢查項(xiàng)，而是通過有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)控制，通過本文2種方法的對(duì)比也表明反相液相色譜法能夠?qū)π》肿与s質(zhì)和聚合物雜質(zhì)同時(shí)控制，但方法仍需改進(jìn)，比如特定雜質(zhì)的校正因子已經(jīng)超出0.9～1.1的范圍應(yīng)予引入，使定量更準(zhǔn)確。因此，作者認(rèn)為在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[11-13]中采用HPSEC方法控制聚合物的必要性值得商榷。