臧晴晴，劉飛飛，宏 偉，高 燕

1.淮南市食品藥品檢驗(yàn)中心，淮南 232000；2. 山東泰和醫(yī)藥科技有限公司，濟(jì)南 250000

蓮芝消炎片由穿心蓮干浸膏和山芝麻干浸膏制成[1-3]，具有清熱解毒、涼血消腫等功效，臨床常用于治療肺胃有熱、火毒內(nèi)盛引起的咳嗽氣喘、扁桃體炎、喉痹咽痛等。蓮芝消炎片現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊(cè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中暫時(shí)只規(guī)定了性狀、化學(xué)反應(yīng)和薄層鑒別項(xiàng)目，暫無(wú)含量測(cè)定等指標(biāo)，尚不足以全面控制其質(zhì)量[4-5]。為了更加全面地評(píng)價(jià)蓮芝消炎片的質(zhì)量，提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮芝消炎片進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究[6-15]，建立了蓮芝消炎片的HPLC特征指紋圖譜鑒別方法，并對(duì)其2種主要成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行了含量測(cè)定[16-22]，為蓮芝消炎片的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研究提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜儀；Waters 2489液相色譜儀；島津LC-20AD液相色譜儀；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，SQP)；優(yōu)普系列超純水機(jī)(型號(hào)：UPT-II-10T，成都超純科技有限公司)；超聲波清洗器(ELMA S120H)。

1.2 試藥

穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110797-202010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110854-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈[色譜純，批號(hào)19125211，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、甲醇(分析純，批號(hào)20210107，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 樣品來(lái)源

不同來(lái)源的22批蓮芝消炎片批號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 22批蓮芝消炎片樣品批號(hào)及來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Chromcore C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相A(乙腈)，B(水)，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫比例

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取樣品粉末0.25 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，精密稱(chēng)定，超聲處理30 min，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為全面考察樣品中的成分，首先采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在200～280 nm之間色譜峰較多，且吸收較好。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，在225 nm檢測(cè)波長(zhǎng)處，樣品出峰數(shù)量較多，峰形較好且基線(xiàn)平穩(wěn)。因此，選用225 nm作為蓮芝消炎片HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。蓮芝消炎片紫外全波長(zhǎng)掃描3D色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 蓮芝消炎片紫外全波長(zhǎng)掃描3D色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以1號(hào)峰(穿心蓮內(nèi)酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.03%，峰面積RSD均小于0.02%，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其相似度均為1，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。以1號(hào)峰(穿心蓮內(nèi)酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.03%，峰面積RSD均小于0.02%，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其相似度均為1，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以1號(hào)峰(穿心蓮內(nèi)酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.06%，峰面積RSD均小于0.05%，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其相似度均為1，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4耐用性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)：611073)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在不同品牌不同型號(hào)的液相色譜儀及色譜柱上進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示同一臺(tái)儀器不同的液相色譜柱(Agilent 1260，Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C18)或相同色譜柱不同的儀器(Chromcore C18，Agilent 1260、Waters 2489、島津LC-20AD)，供試品峰形和分離度均良好，表明此方法耐用性較好。

2.5 供試品HPLC指紋圖譜的測(cè)定

2.5.1共有峰確定 取22批蓮芝消炎片按2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄所有色譜圖。結(jié)果顯示6個(gè)共有峰的保留時(shí)間RSD均小于0.20%。以穿心蓮內(nèi)酯作為參照峰S，計(jì)算6個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果制定以下技術(shù)參數(shù)：峰1(1.00±10%)、峰2(1.07±10%)、峰3(1.13±10%)、峰4(1.52±10%)、峰5(1.68±10%)、峰6(1.74±10%)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜峰

2.5.2相似度評(píng)價(jià) 以22批樣品的共有模式圖譜作為參照?qǐng)D譜，在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中(2004A版本)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖3，相似度結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 2種主要成分含量測(cè)定

2.6.1對(duì)照品溶液的確定 根據(jù)各樣品的特征圖譜，發(fā)現(xiàn)在22 批樣品中，峰1(穿心蓮內(nèi)酯)和峰6(脫水穿心蓮內(nèi)酯)的峰高較高且峰面積較大，在蓮芝消炎片的總化學(xué)成分中占比較大。因此，測(cè)定峰1和峰6的含量對(duì)控制其整體質(zhì)量具有重要意義。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)檢測(cè)分析，確定了峰1為穿心蓮內(nèi)酯，峰6為脫水穿心蓮內(nèi)酯。

表3 22批樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

圖3 22批蓮芝消炎片的共有模式及HPLC指紋圖譜

表4 22批蓮芝消炎片的相似度結(jié)果

2.6.2溶液的配制 分別取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯適量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品粉末0.25 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.6.3線(xiàn)性關(guān)系與范圍 取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行回歸，結(jié)果顯示線(xiàn)性關(guān)系良好，見(jiàn)表5。

表5 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯線(xiàn)性關(guān)系與范圍

2.6.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰的保留時(shí)間RSD分別為0.02%、0.02%，峰面積RSD分別為0.47%、0.47%，表明儀器適用性良好。

2.6.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算6份樣品的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量RSD分別為1.48%、1.51%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰的保留時(shí)間RSD分別為0.03 %、0.03%，峰面積RSD分別為1.53%、1.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取18號(hào)樣品(批號(hào)611073)，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別精密加入含穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算含量和加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.6.822批樣品含量測(cè)定 取22批樣品精密稱(chēng)定，按2.6.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)采用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)樣品溶液在200～280 nm之間色譜峰較多，且吸收較好。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，在225 nm波長(zhǎng)處，基本能反映出蓮芝消炎片主要成分的整體情況。因此，選用225 nm作為蓮芝消炎片HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的考察

本實(shí)驗(yàn)共考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液4種流動(dòng)相體系，分別進(jìn)行不同梯度的摸索。結(jié)果顯示以乙腈-水作為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，樣品出峰較好，基線(xiàn)較穩(wěn)定且分離度良好。進(jìn)一步考察，確定了2.1項(xiàng)下的流動(dòng)相體系。

3.3 色譜柱及柱溫的考察

本實(shí)驗(yàn)選用Agilent 1260高效液相色譜儀，分別考察了Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C183種色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示，各色譜柱之間分離效果相差不大，證明本方法耐用性良好。同時(shí)，對(duì)不同的柱溫(25、30、35、40 ℃)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示30 ℃分離效果較好。

3.4 相似度及含量測(cè)定評(píng)價(jià)

本研究對(duì)22批不同來(lái)源的蓮芝消炎片進(jìn)行了相似度分析，結(jié)果顯示，不同來(lái)源的樣品之間所含成分基本一致。其中13號(hào)、14號(hào)樣品相似度較低，其他20批樣品相似度均在0.90以上。在含量測(cè)定結(jié)果中，13、14、15號(hào)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量相較于其他樣品也相對(duì)偏低，這可能是由于不同廠(chǎng)家對(duì)原藥材的采集加工與炮制不同所致，生產(chǎn)制備工藝過(guò)程也可能對(duì)含量有影響。同時(shí)穿心蓮成分在高溫下易分解也對(duì)藥品質(zhì)量存在一定程度的影響。相同廠(chǎng)家不同批次或同一廠(chǎng)家相同批次間相似度和含量略有差別，不同廠(chǎng)家間主成分含量部分批次差別較大，詳見(jiàn)表7。另外，指紋圖譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18～22號(hào)樣品有7個(gè)共有峰，其他樣品則有6個(gè)共有峰，這可能與不同的制備工藝導(dǎo)致藥物成分損失有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究建立了蓮芝消炎片的HPLC指紋圖譜并對(duì)其2種主要成分進(jìn)行了含量測(cè)定，所建立指紋圖譜方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)，完善了蓮芝消炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步的研究提供了科學(xué)依據(jù)。