陳 柯，陳 敏，鄒惠亮

湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，湖州 313000

清熱解毒口服液是用石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、甜地丁、黃芩、龍膽、板藍(lán)根、知母和麥冬制成的中藥制劑，為清熱劑，具有清熱解毒、養(yǎng)陰生津和涼血散結(jié)之功效，主要用于熱毒壅盛所致的發(fā)熱面赤、煩躁口渴、咽喉腫痛及流感、上呼吸道感染見(jiàn)上述證候者[1]。

方中重用石膏和知母，意在清熱生津。黃芩、梔子和龍膽共用，意在清瀉三焦火熱。玄參、麥冬配生地為臣以養(yǎng)陰清熱。佐以金銀花、連翹、板藍(lán)根和甜地丁退熱解毒以透邪熱。各藥合用，抑菌抗病毒之功效尤強(qiáng)，并能涼血以消腫痛[2]。

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的數(shù)據(jù)，截止2020年11月全國(guó)范圍內(nèi)清熱解毒口服液的生產(chǎn)企業(yè)共198家、批準(zhǔn)文號(hào)215個(gè)。受新型冠狀病毒肺炎影響，在全國(guó)198家生產(chǎn)企業(yè)中有80家、91個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)為2020年批準(zhǔn)，清熱解毒口服液有較好的市場(chǎng)前景。

清熱解毒口服液目前所用的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020年版一部，鑒別項(xiàng)下主要為5個(gè)薄層色譜，主要控制綠原酸、梔子苷、連翹苷、菝葜皂苷元與麥冬質(zhì)量，含量測(cè)定檢測(cè)黃芩苷并不能全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量[3-4]。清熱解毒口服液生產(chǎn)單位眾多，全國(guó)均有分布，各企業(yè)用的原料產(chǎn)地有巨大差異。本文建立指紋圖譜方法，結(jié)合聚類分析與主成分分析法，可體現(xiàn)各企業(yè)的原料差異性，主成分的缺失可能是某些企業(yè)未合規(guī)投料所致[5]，該方法能對(duì)清熱解毒口服液質(zhì)量進(jìn)行較全面地評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC20AD二元高壓高效液相色譜儀(島津公司)；XS205DU電子天平(梅特勒)。

1.2 試藥

對(duì)照品：綠原酸(批號(hào)110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%)，芒果苷(批號(hào)111607-201503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.4%)，龍膽苦堿(批號(hào)110770-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.6%)，黃芩苷(批號(hào)110715-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.4%)，哈巴俄苷(批號(hào)111730-201709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.9%)，連翹苷(批號(hào)110821-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.9%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)默克公司)；乙醇、甲酸(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純化水(實(shí)驗(yàn)室制備)。

藥材：石膏(批號(hào)1906003)，金銀花(批號(hào)：1907613，1909036，200229)，連翹(批號(hào)：19006067，1910024，200424)，黃芩(批號(hào)：1904023，1911016，200318)，知母(批號(hào)：1811074，1901030，1911006)，梔子(批號(hào)：19003018，1906008，200104)，玄參(批號(hào)：1903112)，地黃(批號(hào)1001019)，甜地丁(批號(hào)1902052)，龍膽(批號(hào)1903084)，板藍(lán)根(批號(hào)2002011)，麥冬(批號(hào)1904663)，均由浙江聯(lián)康醫(yī)藥有限公司提供。

制劑：收集浙江市場(chǎng)的清熱解毒口服液50批，涉及全國(guó)24家生產(chǎn)企業(yè)、24個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，其中北京1批、河北6批、河南17批、湖北6批、吉林2批、江西4批、四川11批、重慶1批、浙江2批，見(jiàn)表1。

表1 50批清熱解毒口服液樣品信息

表1(續(xù)) 50批清熱解毒口服液樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸溶液(B)體系進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～12 min，10%～12%A；12～20 min，18%A；20～38 min，18%～36%A；38～42 min，36%～80%A；42～50 min，80%A。檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm。流速為1.0 mL·min-1。柱溫為35 ℃[6-13]。

2.2 溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇配制成約0.20 mg·mL-1的溶液，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.2.2樣品制備 按《中國(guó)藥典》2020年版一部清熱解毒口服液項(xiàng)下制法，取1.2項(xiàng)下藥材，隨機(jī)組合不同批次藥材，按以下方法制備樣品15批，除石膏外，其余11味藥均制備了缺單味藥材的陰性對(duì)照樣品。

制備方法：按10%處方量取12味飲片，除金銀花、黃芩外，其余石膏等10味藥加溫水溫浸1 h，煎煮(待煮沸后，再加入金銀花和黃芩)2次，第1次1 h，第2次40 min，濾過(guò)，合并濾液，濾液濃縮至相對(duì)密度約為1.17(80 ℃)，加入乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～70%，冷藏48 h，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加入活性炭5 g，加熱30 min，濾過(guò)，濾液加水至100 mL，濾過(guò)，灌封，滅菌，即得[1]。

2.2.3供試品溶液制備 精密量取制劑1 mL，置于50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇適量，振搖，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取編號(hào)S1的實(shí)驗(yàn)室樣品，按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，14個(gè)標(biāo)記峰的保留時(shí)間RSD在0.02%～0.60%之間，峰面積的RSD在0.07%～0.40%之間。表明該方法精密度良好。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取編號(hào)S1的實(shí)驗(yàn)室樣品，按2.2.3項(xiàng)下制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，每份連續(xù)進(jìn)樣3次，14個(gè)標(biāo)記峰的保留時(shí)間RSD在0.06%～0.70%之間，峰面積的RSD在0.04%～0.30%之間。表明該方法重復(fù)性良好。

取編號(hào)S1的實(shí)驗(yàn)室樣品，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別用島津LC20AD、AgilentLC1260和Waters e2695 3臺(tái)儀器進(jìn)樣，用Agilent Eclipse Plus-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，結(jié)果13個(gè)標(biāo)記峰與參照物峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.02%～0.40%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.05%～0.80%之間。表明該方法儀器間重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取編號(hào)S1的樣品，按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24、48、72 h檢測(cè)，14個(gè)標(biāo)記峰的保留時(shí)間RSD在0.06%～0.90%之間，峰面積的RSD在0.10%～1.20%之間。溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4耐用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱考察：取編號(hào)S1的樣品，按2.1項(xiàng)下色譜條件，用Agilent Eclipse Plus-C18、WelchUltimatePlus-C18、Cosmosil 5C18-MS-II 3根色譜柱對(duì)方法進(jìn)行考察。

除保留時(shí)間有差異外，不同色譜柱色譜峰重復(fù)性良好。3根色譜柱的13個(gè)標(biāo)記峰與參照物峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.06%～1.10%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.50%～1.20%之間。

2.4 指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià)

2.4.1指紋圖譜的構(gòu)建 取編號(hào)為S1的樣品與11批缺單味藥的陰性對(duì)照樣品，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，樣品色譜圖能反映黃芩等8味藥的特征。取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜、光譜分析，該色譜圖能較好地反映6個(gè)對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰，見(jiàn)圖1。

圖1 樣品、缺單味藥的陰性對(duì)照樣品與對(duì)照品溶液各峰的定位

2.4.2特征峰歸屬 取編號(hào)為Z1～Z50的制劑，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，取具有代表性樣品色譜圖與樣品色譜圖進(jìn)行分析，選擇14個(gè)在上述色譜圖中均出現(xiàn)的、峰高均大于最大峰峰高的5%的色譜峰為標(biāo)記峰。標(biāo)記峰歸屬為：峰1、2、9為金銀花，峰3為知母，峰4為龍膽，峰5、6為連翹，峰 7、10、11、12、14為黃芩，峰8為板藍(lán)根、峰13為玄參。

取編號(hào)為S1～S15的樣品，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)，用平均數(shù)法、時(shí)間窗口0.1、14個(gè)標(biāo)記峰，導(dǎo)入15批樣品色譜圖和2批代表性樣品色譜圖，生成對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖2。

注：1.綠原酸；3.芒果苷；4.龍膽苦堿；10.黃芩苷；13.哈巴俄苷。

2.4.3相似度評(píng)價(jià) 以黃芩苷為參照物，供試品指紋圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)與參照物色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并應(yīng)出現(xiàn)14個(gè)標(biāo)記峰，以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(S)、11、12、13、14號(hào)峰為標(biāo)記。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以標(biāo)記峰計(jì)算，與對(duì)照指紋圖譜相比較，相似度不得低于0.90。

將50批制劑色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，50批制劑中含14個(gè)標(biāo)記峰樣品共27批，其相似度均大于0.90，其他23批存在標(biāo)記峰缺失情況，無(wú)法進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，50批制劑評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 50批清熱解毒口服液相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

表2(續(xù)) 50批清熱解毒口服液相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5 聚類分析

將50批制劑色譜圖導(dǎo)入SPSS26.0和SIMCA14.1軟件，用組間連接法，以余弦距離法作為樣品間距離計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[14]。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 50批清熱解毒口服液的聚類分析

當(dāng)判斷距離為11時(shí)，所有樣品被分為6類，地域區(qū)分較為明顯，江西、湖北和河南一部分為1類，湖北同德堂和北京同仁堂各為1類，四川一部分、河南一部分和重慶為1類，黑龍江、河北、吉林和浙江為1類，四川一部分、河南一部分和浙江為1類，其采用的原料分布大致可分為6類，與指紋圖譜評(píng)價(jià)結(jié)果一致；當(dāng)判斷距離為2時(shí)，所有相同廠家生產(chǎn)的被歸為一類，符合實(shí)際情況。

2.6 主成分分析

用SPSS26.0和SIMCA14.1軟件對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對(duì)50批制劑指紋圖譜所得14個(gè)共有峰和峰面積較大的24個(gè)非共有峰進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值及方差貢獻(xiàn)率，見(jiàn)表3、表4。前4個(gè)因子的累積方差貢獻(xiàn)率為90.056%，特征值均大于1，可代表14個(gè)共有峰及24個(gè)非共有峰的大部分信息。

表3 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

表4 主成分載荷矩陣

對(duì)上述主成分載荷值進(jìn)行計(jì)算，得出各主成分的線性模型，成分綜合得分Y=0.204X1+1.221X2+0.39X3+1.205X4+0.733X5+0.955X6+1.172X7+1.158X8+0.666X9+0.152X10+1.077X11+1.409X12+0.511X13+0.401X14+0.507X15+1.363X16+0.772X17+1.200X18+1.088X19+0.418X20+0.903X21+0.335X22+1.015X23+0.888X24+0.483X25+0.679X26+0.600X27+0.950X28+0.924X29+0.692X30+1.155X31+1.214X32+1.031X33+1.027X34+1.111X35+1.099X36+0.739X37+1.267X38,Y表示結(jié)合4個(gè)主成分得到的綜合得分，X1～X38分別表示14個(gè)標(biāo)記峰與24個(gè)非標(biāo)記峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，綜合得分越高說(shuō)明質(zhì)量越好。綜合得分見(jiàn)表5。序號(hào)28之后得分均為負(fù)值，與指紋圖譜結(jié)果相符合。

表5 50批清熱解毒口服液成分的綜合得分

3 討論

3.1 不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品價(jià)格與指紋圖譜結(jié)果的相關(guān)性

收集的50批制劑均為口服液或合劑，制劑規(guī)格均為每支(瓶)裝10 mL，其單價(jià)見(jiàn)表2，可發(fā)現(xiàn)一個(gè)比較有規(guī)律的現(xiàn)象。按本文所載方法相似度大于0.90的27批制劑平均單價(jià)為2.4元·支-1，其他23批平均單價(jià)為1.0元·支-1，兩者相差較大，是否預(yù)示著按本文所載方法檢測(cè)不符合要求的制劑的投料有不合規(guī)現(xiàn)象存在，有待后續(xù)進(jìn)一步調(diào)查。

3.2 投料合規(guī)性與指紋圖譜及聚類分析結(jié)果的相關(guān)性

結(jié)合產(chǎn)品處方，探索了指紋圖譜的檢測(cè)條件，按本文所載方法，清熱解毒口服液指紋圖譜應(yīng)有14個(gè)共有峰，收集的50批制劑中有23批標(biāo)記峰缺失，其他27批制劑均具有14個(gè)標(biāo)記峰，且相似度均大于0.90。同一生產(chǎn)企業(yè)的指紋圖譜基本一致，聚類分析在判別距離為2時(shí)也均歸為一類，證明在相同企業(yè)中采用的原料基本穩(wěn)定，其工藝也相對(duì)穩(wěn)定。

在23批有標(biāo)記峰缺失的制劑中，四川某制藥和河南某藥業(yè)的黃芩藥材對(duì)應(yīng)的峰有缺失，僅有黃芩苷主峰存在，而標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定僅考察黃芩苷含量，可能存在直接用黃芩苷或黃芩提取物投料行為，投料不合規(guī)，建議在標(biāo)準(zhǔn)中增加黃芩的TLC鑒別，考察是否用飲片投料。連翹對(duì)應(yīng)峰缺失，可能采用的連翹種類不同[15]。

河南某藥業(yè)和武漢某藥業(yè)知母藥材對(duì)應(yīng)峰缺失，可能其工藝有待改進(jìn)，知母中皂苷類成分易損失，建議增加知母皂苷的含量測(cè)定[16-17]。

3.3 方法的優(yōu)化

該方法中能體現(xiàn)梔子中所含色譜峰，但峰高小于最大峰峰高的5%，在個(gè)別批次實(shí)驗(yàn)室樣品中不能很好的體現(xiàn)，綜合考慮，不作為標(biāo)記峰，因此在對(duì)照?qǐng)D譜中，能體現(xiàn)黃芩、金銀花、玄參、連翹、龍膽、板藍(lán)根、知母7味藥材特征峰。本文方法無(wú)法體現(xiàn)地黃、麥冬、梔子和甜地丁4味藥材特性[18-21]，方法仍有缺陷，但能反映大部分藥材的特性，結(jié)合TLC鑒別，能較好地反映產(chǎn)品質(zhì)量。