何艷妮，焦偉華，林厚文，洪麗莉*

1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院，西安 710100；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海 200127

金櫻葉為薔薇科薔薇屬植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的嫩葉。其性平味辛，主治金瘡、癰腫、潰瘍、燙火傷等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金櫻葉乙醇提取物能明顯促進(jìn)大鼠深度燙傷創(chuàng)面愈合，且無明顯瘢痕，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，可使肉芽組織內(nèi)新生毛細(xì)血管增生活躍[2]。金櫻葉的主要成分為三萜類、酚酸類和黃酮類化合物[1-3]。金櫻葉資源豐富，藥用悠久，療效確切可靠，但目前國內(nèi)外有關(guān)金櫻葉化學(xué)成分和生物活性的報道較少。為了進(jìn)一步闡明金櫻葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，作者對金櫻葉的化學(xué)成分做了進(jìn)一步研究，從乙醇提取物分離鑒定了9個化合物，見圖1。其中，化合物2、3、6、9為首次從薔薇屬植物中分離得到，化合物1、5、8具有不同程度的抗炎作用。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELAN-1000型，Eyela)；高效薄層層析板(HPTLC，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；色譜柱(YMC-Pack Pro C18RS，250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC-Pack ODS-A，250 mm×20 mm，5 μm； Agilent-Eclipse XDB C18，250 mm×9.4 mm，5 μm；Waters)；核磁共振儀(Bruker AVANCE-600，Bruker AVANCE-300，Bruker AMX-500)；ELISA試劑盒(Biosoerce, Invitrogen)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷均為色譜純，購自Promptar Limited Company，其他試劑均為分析純，購自上?；瘜W(xué)試劑公司。

金櫻葉采摘于安徽省黃山，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院李紅方老師鑒定為薔薇科薔薇屬植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的嫩葉。

2 提取分離

取金櫻子干燥嫩葉7.5 kg，粉碎后用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇[4]回流提取3次，得到取提物5.5 L，取提取物1 L，用水稀釋后經(jīng)大孔樹脂色譜柱分離，以乙醇-水(體積分?jǐn)?shù)為0、30%、50%、95%)梯度洗脫，按洗脫梯度分段，得到A(19.4 g)、B(3.2 g)、C(0.3 g)。B部分經(jīng)ODS柱色譜以甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫(體積分?jǐn)?shù)10%～100%，20 mL·min-1)，經(jīng)HPLC分離得到化合物1(24.3 mg)、2(7.2 mg)、3(24.5 mg)、4(7.5 mg)、5(20.1 mg)。A部分經(jīng)大孔樹脂色譜乙醇-水(體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、95%)梯度洗脫、ODS柱色譜甲醇-水(體積分?jǐn)?shù)為33%～100%，20 mL·min-1；體積分?jǐn)?shù)為10%～100%，25 mL·min-1)梯度洗脫[5]，經(jīng)HPLC分離得到化合物6(16.4 mg)、7(8.0 mg)、8(2.1 mg)、9(3.5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定形粉末，HR-ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z671.377 4 [M+Na]+，結(jié)合1H、13C-NMR譜，確定其分子式為C36H56O10。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.22(1H, t,J=3.5 Hz, H-12), 5.21(1H, d,J=7.8 Hz, H-1′), 4.90(1H, brd,J=1.2 Hz, Ha-29), 4.88(1H, brd,J=1.8 Hz, Hb-29), 1.05(3H, s, CH3-27), 1.04(3H, s, CH3-30), 0.93(3H, s, CH3-25), 0.70(6H, s，CH3-26), 0.53(3H, s, CH3-24)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.0(C-28), 153.0(C-19), 136.9(C-13), 127.5(C-12), 110.0(C-29), 94.5(Glc-1′), 77.9(Glc-5′), 76.8(Glc-3′), 75.8(C-3),72.5(Glc-2′), 69.7(Glc-4′), 67.7(C-2), 64.1(C-23), 60.8(Glc-6′), 51.3(C-18), 48.9(C-17), 48.8(C-20), 47.3(C-9), 47.1(C-1), 46.4(C-5), 42.7(C-4), 42.3(C-8), 39.1(C-14), 37.6(C-10), 36.3(C-22), 32.3(C-7), 30.2(C-21), 28.2(C-15), 25.9(C-30), 25.1(C-16), 23.4(C-11), 19.3(C-27), 17.6(C-6), 17.2(C-25), 16.8(C-26), 13.9(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[3]基本一致，故鑒定化合物1為 isopinfaenoicacid-28-O-β-D-glucopyrann-oside。

化合物2白色無定形粉末，ESI-MS中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z671.36 [M+Na]+。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)上可見36 個碳信號，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR及相對分子質(zhì)量推出分子式為C36H56O10，不飽和度為9。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.40(1H, t,J=3.5 Hz, H-12), 5.24(1H, d,J=7.8 Hz, H-1′), 3.49(1H, m, H-2), 1.81(2H, m, H-11), 1.59(3H, s, CH3-30), 1.50(3H, s, CH3-29), 0.94(3H, s, CH3-25), 0.90(3H, s, CH3-27), 0.75(3H, s, CH3-26), 0.53(3H, s, CH3-24)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.1(C-28), 137.2(C-12), 128.0(C-19), 126.8(C-13), 123.6(C-20), 94.4(Glc-1′), 78.0(Glc-3′), 77.9(Glc-5′), 75.8(C-3), 72.6(Glc-2′), 69.8(Glc-4′), 67.7(C-2), 64.1(C-23), 60.9(Glc-6′), 49.6(C-18), 48.8(C-5, C-9), 47.5(C-1), 46.4(C-17), 43.1(C-14), 42.6(C-4), 39.0(C-8), 37.5(C-10), 33.1(C-7), 32.1(C-22), 28.0(C-21), 27.6(C-15), 23.3(C-11), 23.0(C-16), 21.9(C-27), 20.4(C-30), 19.3(C-26), 17.6(C-25), 17.5(C-6), 17.0(C-29), 14.0(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[3]基本一致，故鑒定化合物2為2α,3β,23-三羥基烏蘇-12,19-二烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，該化合物為首次從薔薇屬植物中分離得到。

化合物3淡黃色無定形粉末。13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)上可見36 個碳信號，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR推出分子式為C36H58O10，不飽和度為8。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.14(1H, d,J=8.0 Hz, H-1′), 3.78(1H, m, H-20), 2.36(1H, m, H-18), 1.77(1H, m, H-1), 1.58(1H, m, H-9), 1.26(3H,s, CH3-27), 1.08(3H, s, CH3-29), 0.91(3H, s, CH3-23), 0.89(3H, s, CH3-25), 0.84(3H, d,J=7.0 Hz, H-30), 0.70(3H, s, CH3-24), 0.66(3H, s, CH3-26)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.8(C-28), 138.4(C-13), 127.2(C-12), 94.3(Glc-1′), 82.5(C-3), 77.8(Glc-5′), 76.9(Glc-3′), 72.5(Glc-2′), 71.9(C-19), 69.7(Glc-4′), 67.4(C-2), 60.8(Glc-6′), 55.0(C-5), 53.4(C-18), 47.5(C-17), 47.3(C-1), 46.9(C-9), 41.4(C-20), 41.3(C-14), 40.2(C-8), 39.1(C-4), 37.7(C-10), 36.8(C-22), 32.7(C-7), 29.0(C-23), 28.2(C-15), 26.6(C-29), 26.0(C-21), 25.3(C-16), 24.0(C-27), 23.5(C-11), 18.3(C-6), 17.3(C-24), 16.6(C-25), 16.7(C-26), 16.4(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[6]基本一致，故鑒定化合物3為 2α,3β,19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物4淡黃色無定形粉末，ESI-MS中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z689.40 [M+Na]+。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)上可見36 個碳信號，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR及相對分子質(zhì)量推出分子式為C36H58O10，不飽和度為8。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.17(1H, t,J=3.0 Hz, H-12), 5.14(1H, t,J=8.0 Hz, H-1′), 3.70(1H, m, H-2), 3.41(1H, d,J=2.4Hz, H-3), 1.26(3H, m, CH3-27), 1.08(3H, s, CH3-29), 0.91(3H, s, CH3-23), 0.89(3H, s, CH3-25), 0.84(3H, d,J=7.0 Hz, CH3-30), 0.70(3H, s, CH3-24), 0.66(3H, s, CH3-26)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.8(C-28), 138.4(C-13), 127.2(C-12), 94.3(Glc-1′), 77.8(Glc-3′), 76.9(Glc-5′), 76.1(C-3), 72.5(Glc-2′), 71.9(C-19), 69.7(Glc-4′), 69.4(C-23), 64.9(C-2), 60.9(Glc-6′), 53.4(C-18), 47.5(C-17), 46.8(C-9), 43.5(C-5), 42.7(C-4), 41.8(C-1), 41.4(C-8, C-20, C-14), 37.8(C-10), 36.8(C-22), 32.4(C-7), 28.2(C-15), 26.6(C-29), 26.0(C-21), 25.3(C-16), 24.2(C-27), 23.4(C-11), 17.7(C-6), 17.0(C-26), 16.7(C-24, C-25), 16.4(C-30)。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7]比對，鑒定化合物4為苦莓苷F1。

化合物5白色無定形粉末，ESI-MS中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z671.39 [M+Na]+。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6) 上可見36 個碳信號，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR及相對分子質(zhì)量推出分子式為C36H56O10, 不飽和度為9。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.26(1H, t,J=4.2 Hz, H-12), 5.24(1H, d,J=8.4 Hz, H-1′), 3.49(1H, m, H-2), 3.17(1H, m, H-3), 1.70(1H, s, H-29), 1.03(3H, s, CH3-30), 1.00(3H, s, CH3-26), 0.89(3H, s, CH3-27), 0.77(3H, s, CH3-25), 0.54(3H, s, CH3-24)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 173.6(C-28), 138.1(C-13), 135.3(C-19), 133.0(C-18), 125.6(C-12), 94.3(Glc-1′), 77.8(C-3), 76.9(Glc-3′), 75.8(Glc-5′), 72.7(Glc-2′), 69.8(Glc-4′), 67.7(C-2), 64.2(C-23), 61.0(Glc-6′), 49.0(C-17), 47.7(C-5), 47.5(C-9), 46.5(C-20), 44.4(C-14), 42.7(C-4), 38.8(C-8), 37.4(C-10), 34.5(C-1), 34.0(C-16), 33.9(C-7), 30.1(C-22), 28.1(C-11), 26.2(C-21), 23.1(C-15), 21.9(C-27), 19.3(C-29), 18.7(C-30), 18.0(C-26), 17.8(C-25), 17.5(C-6), 14.1(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]基本一致，故化合物5鑒定為2α,3β,23-三羥基烏蘇-12,18-二烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，為首次從薔薇屬植物中分離得到。

化合物6黃色無定形粉末，分子式為C22H22O12。1H-NMR(600 MHz, methanol-d4)δ: 7.70(1H, s, H-2′), 7.56(1H, d,J=8.4 Hz, H-6′), 6.85(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.36(1H, s, H-8), 6.17(1H, s, H-6), 5.22(1H, d,J=7.8 Hz, Glc-1′), 3.36(1H, d,J=9Hz, H-4′), 3.34(3H, s, Glc-OCH3-4′)。13C-NMR (150MHz, DMSO-d6)δ: 179.4(C-4), 166.3(C-7), 162.9(C-5), 159.0(C-2), 158.5(C-9), 149.9(C-4′), 145.9(C-3′), 135.6(C-3), 123.2(C-6′), 123.1(C-1′), 117.6(C-2′), 116.0(C-5′), 105.6(C-10), 104.4(Glc-1′), 100.0(C-6), 94.8(C-8), 78.3(Glc-5′), 78.1(Glc-3′), 75.7(Glc-2′), 71.2(Glc-4′), 62.6(Glc-6′), 49.9(Glc-4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定化合物6為5,7,3′,4′-四羥基-4′′-O-甲基-3-O-β-D-葡萄糖黃酮苷，化合物6為該首次從薔薇屬植物中分離得到。

化合物7黃色無定形粉末，分子式為C27H30O16。1H-NMR(600 MHz, methanol-d4)δ: 7.66(1H, d,J=2.4 Hz, H-2′), 7.61(1H, dd,J=2.4, 8.4 Hz, H-6′), 6.86(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.40(1H, d,J=2.4 Hz, H-6), 6.40(1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 5.10(1H, d,J=7.8 Hz, Glc-1′), 4.51(1H, d,J=1.6 Hz, Rha-1′), 3.79(1H, dd,J=3.7, 10.8 Hz, Glc-6′), 3.40(1H, dd,J=3.0, 10.5 Hz, Glc-6′), 1.16(3H, d,J=6.0 Hz, Rha-6′)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 179.4(C-4), 166.1(C-7), 163.0(C-5), 159.3(C-9), 158.5(C-2), 149.8(C-4′), 145.8(C-3′), 135.6(C-3), 123.6(C-1′), 123.1(C-6′), 117.7(C-5′), 116.1(C-2′), 105.6(C-10), 100.0(C-6), 104.7(Glc-1′), 102.4(Rha-1′), 94.9(C-8), 78.2(Glc-3′), 77.2(Glc-5′), 75.7(Glc-2′), 73.9(Glc-4′), 72.2(Rha-3′), 72.1(Rha-2′), 71.4(Rha-4′), 69.7(Rha-5′), 68.6(Glc-6′), 17.9(Rha-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[10]基本一致，故鑒定化合物7為蘆丁。

化合物8黃色無定形粉末，ESI-MS中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z487.06 [M+Na]+，分子式為C21H20O12。1H-NMR(600 MHz, methanol-d4)δ:7.70(1H, s,J=1.8 Hz, H-2′), 7.58(1H, dd,J=2.4, 8.4 Hz, H-6′), 6.85(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.38(1H, s, H-8), 6.19(1H, s,J=2.4 Hz, H-6), 5.24(1H, d,J=7.2 Hz，Glc-1′)。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.5(C-4), 164.5(C-7), 161.1(C-5), 157.0(C-2), 156.6(C-9), 147.9(C-4′), 144.0(C-3′), 133.7(C-3), 121.3(C-6′), 121.2(C-1′), 115.6(C-2′), 114.1(C-5′), 103.7(C-10), 102.4(C-6), 98.1(C-8), 92.9(Glc-1′), 78.3(Glc-5′), 78.1(Glc-3′), 75.7(Glc-2′), 71.2(Glc-4′), 62.6(Glc-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]基本一致，故鑒定化合物8為槲皮苷。

化合物9淡黃色無定形粉末，ESI-MS中給出準(zhǔn)分子離子峰m/z545.21 [M+Na]+，分子式為C26H34O11。13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 147.4(C-3), 145.7(C-3′), 144.3(C-4), 144.2(C-4′), 137.1(C-1), 132.9(C-6′), 127.2(C-1′), 121.2(C-6), 116.5(C-5′), 115.7(C-5), 114.1(C-2), 112.0(C-2′), 104.3(Glc-1′), 77.0(Glc-3′), 76.9(Glc-5′), 73.8(Glc-2′), 70.3(Glc-4′), 67.8(C-9), 63.0(C-9′), 61.3(Glc-6′), 55.8(3-OCH3), 55.7(3′-OCH3), 45.7(C-7), 44.3(C-8), 37.7(C-8′), 32.7(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[12]基本一致，故鑒定化合物9為異落葉松脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷。

4 抗炎活性測試

用LPS法刺激NF-κB-293細(xì)胞模型檢測化合物1、2、3、4、5、6、8對熒光素酶表達(dá)的抑制作用。從液氮罐中快速取出凍存的 P5 代抗炎藥物篩選工具細(xì)胞株(NF-κB-luc 293 Cell Line)1支，待細(xì)胞復(fù)蘇后，取對數(shù)生長期P6代細(xì)胞，用胰酶消化制備細(xì)胞懸液，苔芬蘭染色，血小球計數(shù)板計數(shù)，完成細(xì)胞接種后培養(yǎng)24 h，對細(xì)胞進(jìn)行換液，使用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；用DMSO溶解化合物，按照1 、10 、100、200 μg·mL-1的質(zhì)量濃度添加到培養(yǎng)基，37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞4 h后加入LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1)，正常條件培養(yǎng)細(xì)胞48 h，采用熒光素酶活性檢測。實驗結(jié)果見圖2，由圖 2 可知化合物5對由LPS引起的NF-κB-293細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)能夠發(fā)揮明顯抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。

用ELISA法檢測化合物1、5、8對LPS刺激的RAW264.7W細(xì)胞上清液中炎癥因子 IL-1β、TNF-α和IL-10的抑制作用，結(jié)果見表1?；衔?在質(zhì)量濃度分別為30、300 μg·mL-1時分別對炎癥因子IL-1β和TNF-α有明顯的抑制作用；化合物5對炎癥因子IL-1β、TNF-α的抑制作用強于IL-10，但是平均質(zhì)量濃度卻高于對照組，有待更深入的研究；化合物8對3種炎癥因子均有強烈的抑制作用，且呈一定的劑量依賴性。

圖2 化合物抗炎活性篩選結(jié)果

表1 化合物對炎癥因子IL-1β、TNF-α 和 IL-10的抑制作用

5 討論

在民間，金櫻葉被廣泛用作治療燒燙傷的草藥，但迄今為止，對金櫻葉的化學(xué)成分研究的報道并不多[13-17]。為了進(jìn)一步探討其活性成分，本研究運用色譜分離技術(shù)，從金櫻葉的體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇提取物中共分離鑒定了9個化合物，化合物2、3、6、9為首次從薔薇屬植物中分離得到。對化合物進(jìn)行體外抗炎及ELISA法活性篩選，結(jié)果表明，化合物1、5、8能夠不同程度地抑制炎癥因子 IL-1β、TNF-α和 IL-10的釋放。本研究為進(jìn)一步闡明金櫻葉的有效成分和作用機制奠定了基礎(chǔ)。