陳 坤，李 江，彭 霜，董 蕓，陳凌云，余曉玲

1.達(dá)州中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，達(dá)州 635000；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，昆明 650500；4.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所，普洱 665000

參威骨痹方是由10余味藥材組成的中藥復(fù)方。處方中，小紅參為君藥，是云南特色民族藥[1]，來源于茜草科茜草屬云南茜草RubiayunnanensisDiels的干燥根莖[2]，具有活血化瘀、痛經(jīng)止痛、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功效，用于痛經(jīng)、閉經(jīng)、風(fēng)寒濕痹等[3-5]。威靈仙為治療骨痹的常用中藥，能祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛。白芍等中藥輔助君藥養(yǎng)血、活血、通絡(luò)、除痹；懷牛膝、桑寄生等中藥具有補(bǔ)肝益腎、健骨強(qiáng)筋功效；桂枝、秦艽等中藥祛風(fēng)止痛、除濕散寒，全方共奏活血化瘀定痛、補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)除濕之功效，臨床上主要用于風(fēng)濕痹癥[1]，用藥后癥狀改善明顯，有效率達(dá)82%[6]。但為更適宜臨床用藥需求，使患者順應(yīng)性更好，避免臨時(shí)煎服等缺點(diǎn)，本方擬開發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑參威骨痹片。課題組前期已經(jīng)完成參威骨痹片的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，且對其藥效學(xué)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明參威骨痹片對膝關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α有明顯的有抑制作用，提示對骨關(guān)節(jié)炎有治療效果[1]。而本文旨在闡述參威骨痹片提取工藝的優(yōu)選方法，為參威骨痹片的生產(chǎn)提取提供數(shù)據(jù)支持。

層次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)為主觀賦權(quán)法，是通過分析復(fù)雜系統(tǒng)中涉及的因素及其相互關(guān)系，構(gòu)造復(fù)雜系統(tǒng)AHP法的結(jié)構(gòu)模型，將各層次的要素成對比較，得出某一層次相對重要性的比較尺度，建立判斷矩陣，以最大特征值和特征向量得到相應(yīng)排序，從而確定權(quán)重向量[7-8]。信息熵權(quán)重法(Entropy Weight Method，EWM)為客觀賦權(quán)法，用于衡量指標(biāo)的離散程度，離散度越大，指標(biāo)對綜合評價(jià)的影響就越大[9]。熵是不確定性的度量。信息量越大，不確定性和熵就越小。信息量越小，不確定性和熵就越大[10]。AHP法源于決策者的主觀抉擇，而熵權(quán)法則側(cè)重于數(shù)據(jù)本身所蘊(yùn)含的客觀信息，科學(xué)的權(quán)重系數(shù)應(yīng)該是主客觀相結(jié)合的結(jié)果，AHP-EWM聯(lián)合使用，既避免了AHP法的主觀抉擇，又有效利用數(shù)據(jù)本身的客觀信息，使得到的權(quán)重系數(shù)更為合理，更符合實(shí)際運(yùn)行的需要[11-12]。本文以參威骨痹片提取為例，用AHP-EWM法確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，有利于保證改進(jìn)劑型的臨床療效，為中藥復(fù)方提取、劑型改進(jìn)提供新思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀、C18色譜柱、分析天平、電子天平、數(shù)顯恒溫水浴鍋參照《熵權(quán)法聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選復(fù)方龍血竭雙層膜中黃連提取工藝》一文中儀器設(shè)備[10]。

1.2 試藥

龍膽苦苷(批號為110770-201013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%)、芍藥苷(批號為110736-201842，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%)均購于中國食品藥品檢定研究院；各飲片由云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(昆明市中醫(yī)醫(yī)院)提供，并由云南中醫(yī)藥大學(xué)陳凌云教授進(jìn)行鑒定[小紅參(批號210501)、獨(dú)活(批號210201)、桑寄生(批號210501)、威靈仙(批號210401)、防風(fēng)(批號210301)、當(dāng)歸(批號210501)、秦艽(批號210501)、桂枝(批號210501)、鹽杜仲(批號210401)、川芎(批號210502)、牛膝(批號210201)、茯苓(批號210501)、甘草(批號210501)、白芍(批號210501)、燈盞細(xì)辛(批號210302)、熟地黃(批號210501)]；乙腈(色譜純，批號6081001004，美國Sigma-Aldrich公司)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

柱溫設(shè)定為30 ℃；流動相為乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)；流速為1 mL·min-1。梯度洗脫(0～2 min，12.0%A；2～3 min，12.0%～15.0%A；3～6 min，15.0%A；6～7 min，15.0%～20.0%A；7～15 min，20.0%A；15～16 min，20.0%～60.0%A)[13]。波長切換：0～15 min在230 nm處測定芍藥苷，15～30 min在275nm處測定龍膽苦苷；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰、龍膽苦苷峰計(jì)算分別不低于2 000、3 000。

2.2 溶液的配制

對照品溶液的制備：取芍藥苷、龍膽苦苷對照品，精密稱定，加甲醇溶解并分別稀釋成274、312 μg·mL-1的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：取處方比例藥材，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)安排，回流提取，濾液適當(dāng)濃縮，用250 mL量瓶定容，精密吸取10 mL，置于干燥蒸發(fā)皿中，揮干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，超聲30 min，加甲醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液的制備：按照處方比例分別制成缺白芍、秦艽的陰性樣品及兩藥均缺的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專屬性考察 參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，對照品溶液和供試品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷色譜峰保留時(shí)間一致，且陰性對照品溶液在相應(yīng)位置處無相同吸收峰，表明專屬性良好。見圖1。

2.3.2線性與范圍 按2.2項(xiàng)下方法配制混合對照品溶液，得芍藥苷、龍膽苦苷對照品溶液質(zhì)量濃度分別為688.80、735.60 μg·mL-1。并精密吸取1、2、5、5、8 mL混合對照品儲備液，分別定容至25、25、25、10、10 mL量瓶中，得芍藥苷對照品溶液質(zhì)量濃度分別為27.55、55.10、137.76、344.40、551.04 μg·mL-1及龍膽苦苷對照品溶液質(zhì)量濃度分別為30.144、60.288、150.72、376.8、602.88 μg·mL-1，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，以峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，分別得芍藥苷、龍膽苦苷線性回歸方程分別為y=0.105 2x+0.469 8(r=0.999 9)，y=0.141x+0.492 7(r=0.999 9)，結(jié)果表明，芍藥苷和龍膽苦苷分別在進(jìn)樣質(zhì)量濃度27.55～688.80 μg·mL-1、30.144～735.60 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.3精密度 參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。計(jì)算得芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD值分別為0.02%、0.13%(n=6)。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

注：A.芍藥苷、龍膽苦苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺秦艽陰性對照溶液；D.缺白芍陰性對照溶液；E.兩藥均缺陰性對照溶液；1.芍藥苷；2.龍膽苦苷。

2.3.4穩(wěn)定性 參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。經(jīng)計(jì)算，混合對照品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.23%、0.39%，供試品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為1.35%、1.17%。結(jié)果表明，混合對照品溶液與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性 參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。并計(jì)算含量，得RSD值分別為1.77%、1.54%(n=6)，結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性好。

2.3.6準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份已知含量的供試品溶液共9份，每份1 mL，分別按1∶0.5，1∶1，1∶1.5比例，參照文獻(xiàn)中穩(wěn)定性考察方法[10]進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)。計(jì)算得芍藥苷、龍膽苦苷得平均回收率分別為99.65%、99.54%，RSD 值分別為0.38%、0.75%。表明該方法加樣回收率良好[10]。見表1。

表1 芍藥苷、龍膽苦苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 干膏得率

參照文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)行提取物干膏制備實(shí)驗(yàn)，計(jì)算干膏得率。

2.5 層次分析法(AHP)計(jì)算權(quán)重

層次分析法是一種定性與定量相結(jié)合的科學(xué)決策方式。它對定性問題進(jìn)行量化評價(jià)，依靠決策者的主觀經(jīng)驗(yàn)對各評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行判斷[15]。處方中，小紅參作為君藥，主要成分為蒽醌類化合物，其中明確的蒽醌類化合物有16個(gè)[16-19]，小紅參主要有抗癌作用[20]，小紅參含藥血清能夠明顯抑制T淋巴細(xì)胞對鏈球菌抗原的增殖作用、抑制NO的產(chǎn)生等[21]。臣藥白芍的有效成分為芍藥苷，白芍具有鎮(zhèn)痛、抗炎[22]、抗菌[23]、抗氧化[24]、抗癌[25]、抗抑郁[26]和抗肝纖維化[27]作用。此外，白芍對自身免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病和心腦血管疾病都有一定治療作用[28]；作為佐藥的秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類和黃酮類化合物，臨床上主要治療骨關(guān)節(jié)炎[29-30]；干膏得率可間接反映其他藥物的提取量，也是片劑制備的主藥原料。在遵循中醫(yī)藥君臣佐使配伍理論及現(xiàn)代藥理作用的基礎(chǔ)上，將3項(xiàng)指標(biāo)分成2個(gè)層次，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)椋荷炙庈?龍膽苦苷>干膏得率。用AHP理論中1～9標(biāo)度法對3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，列舉各評價(jià)指標(biāo)的判斷優(yōu)先矩陣，見表2。再按幾何平均法計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，得干膏得率、芍藥苷和龍膽苦苷的權(quán)重系數(shù)分別為15.132%、47.196%、37.672%。并對本次求得的各個(gè)權(quán)重系數(shù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，得CI(一致性指標(biāo))=0.027≠0，CR(隨機(jī)一致性比率)=0.052<0.1，說明評價(jià)指標(biāo)層的判斷矩陣和單排序結(jié)果通過了一致性檢驗(yàn)，所求得的權(quán)重系數(shù)有效[31-32]。

表2 3種指標(biāo)成分成對比較矩陣

2.6 信息熵權(quán)重法(EWM)計(jì)算權(quán)重

設(shè)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)為矩陣(Yij) ，將其用極值法[公式(1)]進(jìn)行處理 ，轉(zhuǎn)為(0，1) 之間的數(shù)值得到響應(yīng)原始矩陣[33-34]。根據(jù)公式(2) 、(3) 計(jì)算各指標(biāo)信息熵Hij=[0.997 6，0.996 5，0.998 5]，得干膏得率、芍藥苷、龍膽苦苷3個(gè)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為29.46%、48.95%、21.59%。

(1)

(2)

(3)

2.7 AHP-EWM混合加權(quán)法確定權(quán)重

經(jīng)計(jì)算，AHP與信息熵指標(biāo)權(quán)重相關(guān)系數(shù)為0.508，單因素方差分析結(jié)果為P=0.018(大于0.01小于0.05)，說明兩組權(quán)重?cái)?shù)據(jù)相關(guān)性顯著，而非極顯著。根據(jù)復(fù)方主治功效及組方比例的特點(diǎn)，用AHP法量化了評價(jià)指標(biāo)兩兩比較判斷的優(yōu)先信息，主觀評價(jià)了各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，基本體現(xiàn)了復(fù)方君臣佐使配伍規(guī)律及各成分對總體效果貢獻(xiàn)的主次順序[35]，而信息熵權(quán)法的權(quán)重完全依據(jù)客觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，能真實(shí)地反映提取制備過程有效部位量值傳遞變化的客觀規(guī)律，因此，科學(xué)的權(quán)重確認(rèn)原則應(yīng)兼顧主觀權(quán)重和客觀權(quán)重。實(shí)驗(yàn)用AHP-信息熵權(quán)法計(jì)算綜合權(quán)重Mi，計(jì)算公式為公式(4)。通過計(jì)算，3個(gè)評價(jià)指標(biāo)的綜合權(quán)重分別為12.49%、64.72%、22.79%。

Mi=Wi-AHPWi-EWM/∑Wi-AHPWi-EWM

(4)

2.8 提取工藝優(yōu)化

2.8.1因素水平設(shè)計(jì)與結(jié)果 參照文獻(xiàn)方法[10,14]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平(課題組前期已完成該批次白芍、秦艽藥材含量的測定，其中芍藥苷、龍膽苦苷含量分別為4.69%、3.27%)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素與水平見表3。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案、結(jié)果見表4[10,14]。

表3 實(shí)驗(yàn)因素與水平

表5 回歸模型的方差分析

2.8.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面圖和等高線圖可準(zhǔn)確直觀地反映出提取過程中各因素與響應(yīng)值的交互作用。對綜合評分進(jìn)行影響程度大小排列分析，分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)、提取時(shí)間交互作用顯著，加水倍數(shù)、提取時(shí)間、加水倍數(shù)和提取次數(shù)交互作用結(jié)果不顯著，結(jié)論與方差分析結(jié)果一致[10]。見圖2。

2.8.3提取工藝的驗(yàn)證 由上述結(jié)果可知，加水量為10 倍、提取時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為3 次為此次提取工藝優(yōu)化的最佳結(jié)果，綜合評分理論值為99.99。參照文獻(xiàn)中的提取工藝驗(yàn)證方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[10,14]。驗(yàn)證結(jié)果見表6。

圖2 響應(yīng)曲面圖和等高線圖

表6 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表6可知，干膏得率、芍藥苷及龍膽苦苷轉(zhuǎn)移率均合理，綜合評分接近預(yù)測值，工藝穩(wěn)定可行，具有重復(fù)性和可操作性，證明優(yōu)選條件可行[10]。

3 討論

在設(shè)計(jì)提取方法時(shí)，因本方為云南省名中醫(yī)江順奎教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床使用長期有效，又?jǐn)M制備院內(nèi)制劑，故全方用水提取。本方藥味較多，民族藥小紅參為本方君藥之一，化學(xué)成分多為不明確的蒽醌類化合物，因其含量指標(biāo)未被《中國藥典》收錄和量化，同時(shí)，課題組對復(fù)方提取液做了大黃酸、大黃素、大黃酚和蘆薈大黃素等常見蒽醌類化合物檢測，均未能檢出，故未作為評價(jià)指標(biāo)；另一味君藥威靈仙，依照2020年版《中國藥典》規(guī)定對齊墩果酸進(jìn)行含量測定，經(jīng)檢測，齊墩果酸存在陰性干擾，亦未納入評價(jià)指標(biāo)。本方中當(dāng)歸、川芎、獨(dú)活等含揮發(fā)油類，受熱易分解，且不易保存；尚含有桑寄生等《中國藥典》未收錄含量測定項(xiàng)的中藥，暫不作為評價(jià)指標(biāo)，而臣藥白芍具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，佐藥秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類和黃酮類化合物，臨床上主要作為治療骨關(guān)節(jié)炎的常用藥。綜合考慮，選擇臣藥白芍中的芍藥苷和佐藥秦艽中的龍膽苦苷作為評價(jià)指標(biāo)，考慮到本方藥味眾多，成分復(fù)雜，選擇芍藥苷、龍膽苦苷及干膏得率三者共同作為評價(jià)指標(biāo)。

參威骨痹方化學(xué)成分復(fù)雜，其評價(jià)指標(biāo)的有效性、可測性、特有性3個(gè)核心屬性則決定臨床療效。本文圍繞參威骨痹方的3個(gè)核心屬性首次用AHP-EWM法進(jìn)行其提取分析，若單純采取一種評價(jià)指標(biāo)，則并不能完全控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；若采用多標(biāo)志物統(tǒng)一評價(jià)，則各指標(biāo)之間的權(quán)重系數(shù)則會依靠人為的主觀抉擇。AHP法是根據(jù)行業(yè)專家對這3個(gè)核心要素重要性的認(rèn)識而打分確定，具有一定的主觀性；EWN法的評價(jià)完全居于數(shù)據(jù)本身的客觀性，兩法合用，使得到的權(quán)重系數(shù)更為合理，更符合實(shí)際運(yùn)行的需要，為后續(xù)參威骨痹片的成型工藝、藥效學(xué)及生物利用度研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本文所構(gòu)建的AHP-EWM法對于復(fù)方提取質(zhì)量的綜合評價(jià)具有較好的普適性，為中藥復(fù)方的提取評價(jià)提供新思路。