付 佳，賈倩倩，韓省力，賀浪沖*

1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，西安 710021

中藥用于人類疾病的預(yù)防和治療已有數(shù)千年的歷史，其具有多組分、化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn)，其有效成分是中藥藥效學(xué)的基礎(chǔ)，是新藥開發(fā)的重要來源[1-3]。北豆根(RhizomaMenispermi)是防己科植物蝙蝠葛的干燥根莖，具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛之功效，其單方制劑北豆根片、北豆根膠囊主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎和慢性支氣管炎等疾病[4]。據(jù)報(bào)道，北豆根還具有抗腫瘤作用，生物堿成分是其發(fā)揮抗腫瘤作用的活性組分[5-8]。

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜糖蛋白，EGFR家族通過激活一系列重要的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、分化、代謝、黏附、運(yùn)動(dòng)和死亡，在細(xì)胞介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。據(jù)報(bào)道，EGFR在許多類型的癌癥中都有過表達(dá)，包括頭頸部、胰腺、乳腺、結(jié)腸、膀胱、腎臟、膀胱、卵巢和膠質(zhì)瘤[10-16]。由于EGFR的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān)，因此EGFR已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)[17]。

細(xì)胞膜色譜是賀浪沖教授于1996年獨(dú)創(chuàng)的一種研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技術(shù)[18]，主要用于中藥活性成分篩選、藥物受體相互作用和中藥注射液質(zhì)量控制等[19-24]。SNAP-tag是一種蛋白標(biāo)簽，其無論在體內(nèi)還是體外，都可特異性并快速與其配體苯甲基鳥嘌呤發(fā)生反應(yīng)，以共價(jià)鍵結(jié)合，主要應(yīng)用于胞內(nèi)標(biāo)記、蛋白純化和蛋白固定等領(lǐng)域[25-28]。為提高細(xì)胞膜色譜柱的質(zhì)量，我們?cè)谇捌诠ぷ髦杏肧NAP-tag技術(shù)制備了一種新型的EGFR胞內(nèi)端朝外SNAP-tag-EGFR/CMC模型，提高了細(xì)胞膜色譜柱的穩(wěn)定性和篩選的特異性[29]。本研究將該模型用于靶向篩選中藥北豆根中EGFR的潛在抗腫瘤活性成分并研究藥物受體的相互作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HPLC-IT-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司，配有LC-20AD色譜泵2臺(tái)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LCMS-IT-TOF質(zhì)譜儀、電噴霧離子源和LCMS Solution工作站)。

1.2 試藥

氨基鍵合的硅膠為填充劑(博納艾杰爾科技公司)；北豆根購自中藥材市場(chǎng)，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)的干燥根莖；蝙蝠葛堿(批號(hào)JOT-10324，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；蝙蝠葛蘇林堿(批號(hào)DST200520-024，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；CCK8試劑盒(上海陶素生化科技有限公司)。

2 方法

2.1 條件

一維條件：SNAP-tag-EGFR/CMC柱(10 mm×2.0 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氫二鈉溶液；柱溫為37 ℃；流速為0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。二維條件：色譜柱為島津Shim-pack GISS-HP C18色譜柱(150 mm × 3.0 mm, 3.0 μm)；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.05%的三乙胺水溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速為0.3 mL·min-1；梯度洗脫程序?yàn)?～60 min，20%～60% B；進(jìn)樣量為5 μL，二極管陣列檢測(cè)器。

MS條件：離子化模式為電噴霧電離，霧化氣和干燥氣均為高純氮?dú)?N2，體積分?jǐn)?shù)>99.999%)，霧化氣流速為1.5 L·min-1，干燥氣壓力為109 kPa，曲線脫溶劑管線(CDL)溫度為200 ℃，加熱模塊溫度為200 ℃，接口電壓為4.5 kV，檢測(cè)電壓為1.57 kV，碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)氣為高純氬氣(Ar，體積分?jǐn)?shù)>99.999%)，CID能量為50%，正負(fù)離子掃描模式，掃描范圍為m/z50～1 000。

2.2 溶液的制備

將蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品均配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，待分析時(shí)用甲醇稀釋至適宜質(zhì)量濃度。

北豆根供試品的制備：稱取0.3 g北豆根粉末，用50 mL甲醇超聲提取1 h，減壓蒸餾得到北豆根總提取物，分析時(shí)用甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜柱制備

細(xì)胞膜色譜柱制備方式與前期制備方式相同[29]。用胰蛋白酶將SNAP-tag-EGFR HEK293細(xì)胞消化，并用PBS(pH 7.4)洗滌2次。將5 mL Tris-HCl(pH 7.4)加入細(xì)胞懸液中，并用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，其參數(shù)設(shè)置為：功率為200 W，每次工作3 s后停2 s，重復(fù)工作8次。然后將混懸液離心(1 000 r·min-1，10 min)。取上清液以12 000 r·min-1離心20 min得到細(xì)胞膜。然后將細(xì)胞膜重懸于5 mL PBS中，并緩慢添加到0.04 g苯甲基鳥嘌呤修飾的硅膠固定相中。并于37 ℃震蕩(1 500 r·min-1)孵育30 min。用PBS漂洗3次，洗去未反應(yīng)的細(xì)胞膜。用濕法裝柱得到SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜柱。

2.4 SNAP-tag-EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF-MS二維聯(lián)用系統(tǒng)篩選北豆根提取物中的活性組分

將北豆根提取物進(jìn)樣5 μL至SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中，使第一維SNAP-tag-EGFR/CMC柱上保留組分通過富集柱的富集和十通切換閥的切換，進(jìn)入第二維HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)中進(jìn)行進(jìn)一步的分離及結(jié)構(gòu)分析、鑒定，得到一維保留組分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。為進(jìn)一步驗(yàn)證二維在線聯(lián)用系統(tǒng)“識(shí)別”-“分析”-“鑒定”結(jié)果的可靠性，使被識(shí)別組分的混合對(duì)照品進(jìn)入SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.5 計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證潛在活性成分與EGFR(PDB ID:2ITY)的受體-抑制劑結(jié)合作用，用SYBYL-X2.0程序進(jìn)行分子對(duì)接分析。從PDB.org下載EGFR的結(jié)構(gòu)文件，去除水分子和共晶配體，在蛋白質(zhì)中加入氫。用Sybyl/Sketch模塊構(gòu)建蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的三維結(jié)構(gòu)，并用Powell方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.6 前沿分析

用前沿分析法研究蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿與EGFR相互作用力的大小。流動(dòng)相A為50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH7.4)；流動(dòng)相B為含有不同濃度藥物的50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH 7.4)；流速為0.2 mL·min-1；柱溫為37 ℃。先用A相平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱1 h，再將最低濃度的待測(cè)藥物溶液作為流動(dòng)相連續(xù)進(jìn)樣，形成突破曲線達(dá)到平臺(tái)后停止，換用A相緩沖液繼續(xù)平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱，待達(dá)到平衡后再進(jìn)行該藥物的下一個(gè)濃度的分析，分別獲得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol·L-1條件下的待測(cè)藥物的突破曲線，待測(cè)藥物的KD值由公式(1)獲得。

(1)

mLapp：在給定的摩爾濃度的配體條件下，達(dá)到突破曲線的中點(diǎn)所需的配體的摩爾數(shù)(mol)；

[A]：流動(dòng)相中配體的濃度(mol·L-1)；

mL：細(xì)胞膜色譜柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)(mol)；

KD：平衡解離常數(shù)(mol·L-1)。

根據(jù)公式(1)，以1/mLapp對(duì)1/[A]作圖呈良好的線性關(guān)系，回歸曲線截距的導(dǎo)數(shù)為CMC柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)mL，斜率和截距的比值為平衡解離常數(shù)KD值。

2.7 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

用CCK-8試劑盒，按照說明書對(duì)用SNAP-tag-EGFR/CMC模型篩選出的活性成分的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。將密度為1.5×104細(xì)胞·孔-1的細(xì)胞接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后，用不同濃度(5、25、50、100 μmol·L-1)的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿處理細(xì)胞48 h，用含10 μL CCK-8試劑盒溶液的無血清培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育2 h。用微孔板吸光度讀取器在450 nm處讀取吸光度。

3 結(jié)果

3.1 北豆根中目標(biāo)組分篩選

北豆根提取物樣品經(jīng)SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)分析，結(jié)果見圖1。圖1A為北豆根提取物在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的色譜圖，包含保留組分R1和非保留組分R0；圖1B為北豆根提取物直接進(jìn)入HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖；將保留組分R1富集切換進(jìn)入HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)一步的分離得到2個(gè)組分，見圖1C；通過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推測(cè)保留組分可能為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿，圖1D為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式。

為驗(yàn)證上述篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，用同樣的方法對(duì)蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果見圖2，蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品與北豆根提取物的保留組分R1具有相同的保留行為和質(zhì)譜圖譜。因此，我們確定北豆根中潛在活性成分為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿。

3.2 前沿分析法評(píng)價(jià)活性成分與EGFR的親和強(qiáng)度

藥物-受體相互作用與藥物的體內(nèi)作用機(jī)制研究以及藥效評(píng)價(jià)密切相關(guān)，因此用SNAP-tag-EGFR/CMC模型結(jié)合前沿分析法研究活性成分與EGFR的親和強(qiáng)度。圖3為SNAP-tag-EGFR/CMC前沿分析法測(cè)得蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿的代表性突破曲線和回歸曲線，可見蝙蝠葛蘇林堿(圖3A)和蝙蝠葛堿(圖3C)的突破曲線達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)均隨著各自濃度的增加而縮短(突破曲線左移)。由蝙蝠葛蘇林堿(圖3B)和蝙蝠葛堿(圖3D)的回歸曲線計(jì)算得到蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR相互作用的KD值分別為2.48×10-6、3.57×10-6mol·L-1，證明蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR均存在一定強(qiáng)度的相互作用，這與蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC模型上的保留時(shí)間一致。見圖4。

注：A.北豆根提取物的SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜圖；B.北豆根提取物直接進(jìn)樣HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖；C.保留組分R1經(jīng)過富集切換的HPLC-IT-TOF-MS色譜圖；D.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式；1.蝙蝠葛堿；2.蝙蝠葛蘇林堿。

注：A.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為；B.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖；C.保留組分R1經(jīng)過富集切換在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖；1.蝙蝠葛堿；2.蝙蝠葛蘇林堿。

注： A.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線；B.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線；C.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線；D.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線；藥物濃度分別為1×10-7、2×10-7、3×10-7、4×10-7、5×10-7、6×10-7、7×10-7、8×10-7、9×10-7 mol·L-1(從下到上)，(n=3)。

圖4 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為

3.3 分子對(duì)接模擬活性成分與EGFR的相互作用

分子對(duì)接能夠呈現(xiàn)蛋白質(zhì)-配體的作用位置及作用力類型，也能體現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點(diǎn)，我們用分子對(duì)接研究蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR之間的相互作用。對(duì)接的通道模式研究表明，蝙蝠葛堿(圖5C)和蝙蝠葛蘇林堿(圖5D)均可以進(jìn)入球形空間模型中EGFR的活性口袋。如帶狀模型所示，蝙蝠葛堿(圖5A)與ASP800形成1個(gè)氫鍵。蝙蝠葛蘇林堿(圖5B)與MET793和GLN791形成2個(gè)氫鍵，表明北豆根中的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可與EGFR發(fā)生相互作用，為CMC靶向藥物活性組分篩選提供依據(jù)。見圖5。

注：A.蝙蝠葛堿與EGFR對(duì)接的帶狀模式；B.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對(duì)接的帶狀模式；C.蝙蝠葛堿與EGFR對(duì)接的通道模式；D.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對(duì)接的通道模式。

3.4 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

我們用CCK8法檢測(cè)了蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在抑制作用。結(jié)果見圖6，當(dāng)蝙蝠葛堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時(shí)，對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為5.18%±7.64%、43.09%±8.04%、80.59%±3.74%、83.83%±3.66%。當(dāng)蝙蝠葛蘇林堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時(shí)，對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為7.38%±12.98%、40.90%±1.65%、73.70%±6.93%、86.40%±2.43%。在5～100 μmol·L-1的范圍內(nèi)，蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。因此，蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可作為候選抗腫瘤化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 討論

由于中藥組成成分復(fù)雜，發(fā)揮治療作用的活性成分不明確，因此，用多種方法分離分析中藥及其復(fù)方中的活性成分一直是中藥防治疾病研究中一個(gè)有待解決的關(guān)鍵問題。細(xì)胞膜色譜為中藥活性成分的篩選研究提供了一種新的途徑。將CMC與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥活性組分的識(shí)別、篩選和鑒定。

圖6 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞的增殖抑制作用 (n=3)

用EGFR胞內(nèi)區(qū)朝外的SNAP-tag-EGFR/CMC模型與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng)，篩選得到作用于EGFR的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿，可作為候選抗腫瘤化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。該色譜模型為研究中藥及其復(fù)雜體系活性成分靶向高效篩選與評(píng)價(jià)提供新方法，為受體-配體相互作用分析提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。