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        基于SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜的北豆根中潛在抗腫瘤活性組分篩選及驗(yàn)證

        2023-01-16 13:15:18賈倩倩韓省力賀浪沖
        西北藥學(xué)雜志 2023年1期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞膜蝙蝠提取物

        付 佳,賈倩倩,韓省力,賀浪沖*

        1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院,西安 710061;2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021

        中藥用于人類疾病的預(yù)防和治療已有數(shù)千年的歷史,其具有多組分、化學(xué)成分復(fù)雜的特點(diǎn),其有效成分是中藥藥效學(xué)的基礎(chǔ),是新藥開發(fā)的重要來源[1-3]。北豆根(RhizomaMenispermi)是防己科植物蝙蝠葛的干燥根莖,具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛之功效,其單方制劑北豆根片、北豆根膠囊主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎和慢性支氣管炎等疾病[4]。據(jù)報(bào)道,北豆根還具有抗腫瘤作用,生物堿成分是其發(fā)揮抗腫瘤作用的活性組分[5-8]。

        表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜糖蛋白,EGFR家族通過激活一系列重要的細(xì)胞過程,包括細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、分化、代謝、黏附、運(yùn)動(dòng)和死亡,在細(xì)胞介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。據(jù)報(bào)道,EGFR在許多類型的癌癥中都有過表達(dá),包括頭頸部、胰腺、乳腺、結(jié)腸、膀胱、腎臟、膀胱、卵巢和膠質(zhì)瘤[10-16]。由于EGFR的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān),因此EGFR已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)[17]。

        細(xì)胞膜色譜是賀浪沖教授于1996年獨(dú)創(chuàng)的一種研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技術(shù)[18],主要用于中藥活性成分篩選、藥物受體相互作用和中藥注射液質(zhì)量控制等[19-24]。SNAP-tag是一種蛋白標(biāo)簽,其無論在體內(nèi)還是體外,都可特異性并快速與其配體苯甲基鳥嘌呤發(fā)生反應(yīng),以共價(jià)鍵結(jié)合,主要應(yīng)用于胞內(nèi)標(biāo)記、蛋白純化和蛋白固定等領(lǐng)域[25-28]。為提高細(xì)胞膜色譜柱的質(zhì)量,我們?cè)谇捌诠ぷ髦杏肧NAP-tag技術(shù)制備了一種新型的EGFR胞內(nèi)端朝外SNAP-tag-EGFR/CMC模型,提高了細(xì)胞膜色譜柱的穩(wěn)定性和篩選的特異性[29]。本研究將該模型用于靶向篩選中藥北豆根中EGFR的潛在抗腫瘤活性成分并研究藥物受體的相互作用。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        HPLC-IT-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司,配有LC-20AD色譜泵2臺(tái)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LCMS-IT-TOF質(zhì)譜儀、電噴霧離子源和LCMS Solution工作站)。

        1.2 試藥

        氨基鍵合的硅膠為填充劑(博納艾杰爾科技公司);北豆根購自中藥材市場(chǎng),經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)的干燥根莖;蝙蝠葛堿(批號(hào)JOT-10324,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);蝙蝠葛蘇林堿(批號(hào)DST200520-024,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);CCK8試劑盒(上海陶素生化科技有限公司)。

        2 方法

        2.1 條件

        一維條件:SNAP-tag-EGFR/CMC柱(10 mm×2.0 mm, 5 μm);流動(dòng)相為50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氫二鈉溶液;柱溫為37 ℃;流速為0.2 mL·min-1;進(jìn)樣量為5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。二維條件:色譜柱為島津Shim-pack GISS-HP C18色譜柱(150 mm × 3.0 mm, 3.0 μm);流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.05%的三乙胺水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;流速為0.3 mL·min-1;梯度洗脫程序?yàn)?~60 min,20%~60% B;進(jìn)樣量為5 μL,二極管陣列檢測(cè)器。

        MS條件:離子化模式為電噴霧電離,霧化氣和干燥氣均為高純氮?dú)?N2,體積分?jǐn)?shù)>99.999%),霧化氣流速為1.5 L·min-1,干燥氣壓力為109 kPa,曲線脫溶劑管線(CDL)溫度為200 ℃,加熱模塊溫度為200 ℃,接口電壓為4.5 kV,檢測(cè)電壓為1.57 kV,碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)氣為高純氬氣(Ar,體積分?jǐn)?shù)>99.999%),CID能量為50%,正負(fù)離子掃描模式,掃描范圍為m/z50~1 000。

        2.2 溶液的制備

        將蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品均配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液,待分析時(shí)用甲醇稀釋至適宜質(zhì)量濃度。

        北豆根供試品的制備:稱取0.3 g北豆根粉末,用50 mL甲醇超聲提取1 h,減壓蒸餾得到北豆根總提取物,分析時(shí)用甲醇溶解,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,得供試品溶液。

        2.3 SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜柱制備

        細(xì)胞膜色譜柱制備方式與前期制備方式相同[29]。用胰蛋白酶將SNAP-tag-EGFR HEK293細(xì)胞消化,并用PBS(pH 7.4)洗滌2次。將5 mL Tris-HCl(pH 7.4)加入細(xì)胞懸液中,并用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞,其參數(shù)設(shè)置為:功率為200 W,每次工作3 s后停2 s,重復(fù)工作8次。然后將混懸液離心(1 000 r·min-1,10 min)。取上清液以12 000 r·min-1離心20 min得到細(xì)胞膜。然后將細(xì)胞膜重懸于5 mL PBS中,并緩慢添加到0.04 g苯甲基鳥嘌呤修飾的硅膠固定相中。并于37 ℃震蕩(1 500 r·min-1)孵育30 min。用PBS漂洗3次,洗去未反應(yīng)的細(xì)胞膜。用濕法裝柱得到SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜柱。

        2.4 SNAP-tag-EGFR/CMC-online-HPLC-IT-TOF-MS二維聯(lián)用系統(tǒng)篩選北豆根提取物中的活性組分

        將北豆根提取物進(jìn)樣5 μL至SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中,使第一維SNAP-tag-EGFR/CMC柱上保留組分通過富集柱的富集和十通切換閥的切換,進(jìn)入第二維HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)中進(jìn)行進(jìn)一步的分離及結(jié)構(gòu)分析、鑒定,得到一維保留組分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。為進(jìn)一步驗(yàn)證二維在線聯(lián)用系統(tǒng)“識(shí)別”-“分析”-“鑒定”結(jié)果的可靠性,使被識(shí)別組分的混合對(duì)照品進(jìn)入SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

        2.5 計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

        為進(jìn)一步驗(yàn)證潛在活性成分與EGFR(PDB ID:2ITY)的受體-抑制劑結(jié)合作用,用SYBYL-X2.0程序進(jìn)行分子對(duì)接分析。從PDB.org下載EGFR的結(jié)構(gòu)文件,去除水分子和共晶配體,在蛋白質(zhì)中加入氫。用Sybyl/Sketch模塊構(gòu)建蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的三維結(jié)構(gòu),并用Powell方法進(jìn)行優(yōu)化。

        2.6 前沿分析

        用前沿分析法研究蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿與EGFR相互作用力的大小。流動(dòng)相A為50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH7.4);流動(dòng)相B為含有不同濃度藥物的50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH 7.4);流速為0.2 mL·min-1;柱溫為37 ℃。先用A相平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱1 h,再將最低濃度的待測(cè)藥物溶液作為流動(dòng)相連續(xù)進(jìn)樣,形成突破曲線達(dá)到平臺(tái)后停止,換用A相緩沖液繼續(xù)平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱,待達(dá)到平衡后再進(jìn)行該藥物的下一個(gè)濃度的分析,分別獲得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol·L-1條件下的待測(cè)藥物的突破曲線,待測(cè)藥物的KD值由公式(1)獲得。

        (1)

        mLapp:在給定的摩爾濃度的配體條件下,達(dá)到突破曲線的中點(diǎn)所需的配體的摩爾數(shù)(mol);

        [A]:流動(dòng)相中配體的濃度(mol·L-1);

        mL:細(xì)胞膜色譜柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)(mol);

        KD:平衡解離常數(shù)(mol·L-1)。

        根據(jù)公式(1),以1/mLapp對(duì)1/[A]作圖呈良好的線性關(guān)系,回歸曲線截距的導(dǎo)數(shù)為CMC柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)mL,斜率和截距的比值為平衡解離常數(shù)KD值。

        2.7 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

        用CCK-8試劑盒,按照說明書對(duì)用SNAP-tag-EGFR/CMC模型篩選出的活性成分的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。將密度為1.5×104細(xì)胞·孔-1的細(xì)胞接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后,用不同濃度(5、25、50、100 μmol·L-1)的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿處理細(xì)胞48 h,用含10 μL CCK-8試劑盒溶液的無血清培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育2 h。用微孔板吸光度讀取器在450 nm處讀取吸光度。

        3 結(jié)果

        3.1 北豆根中目標(biāo)組分篩選

        北豆根提取物樣品經(jīng)SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)分析,結(jié)果見圖1。圖1A為北豆根提取物在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的色譜圖,包含保留組分R1和非保留組分R0;圖1B為北豆根提取物直接進(jìn)入HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖;將保留組分R1富集切換進(jìn)入HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)進(jìn)一步的分離得到2個(gè)組分,見圖1C;通過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,推測(cè)保留組分可能為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿,圖1D為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式。

        為驗(yàn)證上述篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,用同樣的方法對(duì)蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果見圖2,蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品與北豆根提取物的保留組分R1具有相同的保留行為和質(zhì)譜圖譜。因此,我們確定北豆根中潛在活性成分為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿。

        3.2 前沿分析法評(píng)價(jià)活性成分與EGFR的親和強(qiáng)度

        藥物-受體相互作用與藥物的體內(nèi)作用機(jī)制研究以及藥效評(píng)價(jià)密切相關(guān),因此用SNAP-tag-EGFR/CMC模型結(jié)合前沿分析法研究活性成分與EGFR的親和強(qiáng)度。圖3為SNAP-tag-EGFR/CMC前沿分析法測(cè)得蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿的代表性突破曲線和回歸曲線,可見蝙蝠葛蘇林堿(圖3A)和蝙蝠葛堿(圖3C)的突破曲線達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間點(diǎn)均隨著各自濃度的增加而縮短(突破曲線左移)。由蝙蝠葛蘇林堿(圖3B)和蝙蝠葛堿(圖3D)的回歸曲線計(jì)算得到蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR相互作用的KD值分別為2.48×10-6、3.57×10-6mol·L-1,證明蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR均存在一定強(qiáng)度的相互作用,這與蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC模型上的保留時(shí)間一致。見圖4。

        注:A.北豆根提取物的SNAP-tag-EGFR細(xì)胞膜色譜圖;B.北豆根提取物直接進(jìn)樣HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖;C.保留組分R1經(jīng)過富集切換的HPLC-IT-TOF-MS色譜圖;D.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式;1.蝙蝠葛堿;2.蝙蝠葛蘇林堿。

        注:A.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為;B.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖;C.保留組分R1經(jīng)過富集切換在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖;1.蝙蝠葛堿;2.蝙蝠葛蘇林堿。

        注: A.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線;B.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線;C.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線;D.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線;藥物濃度分別為1×10-7、2×10-7、3×10-7、4×10-7、5×10-7、6×10-7、7×10-7、8×10-7、9×10-7 mol·L-1(從下到上),(n=3)。

        圖4 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為

        3.3 分子對(duì)接模擬活性成分與EGFR的相互作用

        分子對(duì)接能夠呈現(xiàn)蛋白質(zhì)-配體的作用位置及作用力類型,也能體現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點(diǎn),我們用分子對(duì)接研究蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR之間的相互作用。對(duì)接的通道模式研究表明,蝙蝠葛堿(圖5C)和蝙蝠葛蘇林堿(圖5D)均可以進(jìn)入球形空間模型中EGFR的活性口袋。如帶狀模型所示,蝙蝠葛堿(圖5A)與ASP800形成1個(gè)氫鍵。蝙蝠葛蘇林堿(圖5B)與MET793和GLN791形成2個(gè)氫鍵,表明北豆根中的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可與EGFR發(fā)生相互作用,為CMC靶向藥物活性組分篩選提供依據(jù)。見圖5。

        注:A.蝙蝠葛堿與EGFR對(duì)接的帶狀模式;B.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對(duì)接的帶狀模式;C.蝙蝠葛堿與EGFR對(duì)接的通道模式;D.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對(duì)接的通道模式。

        3.4 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

        我們用CCK8法檢測(cè)了蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在抑制作用。結(jié)果見圖6,當(dāng)蝙蝠葛堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時(shí),對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為5.18%±7.64%、43.09%±8.04%、80.59%±3.74%、83.83%±3.66%。當(dāng)蝙蝠葛蘇林堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時(shí),對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為7.38%±12.98%、40.90%±1.65%、73.70%±6.93%、86.40%±2.43%。在5~100 μmol·L-1的范圍內(nèi),蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。因此,蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可作為候選抗腫瘤化合物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

        4 討論

        由于中藥組成成分復(fù)雜,發(fā)揮治療作用的活性成分不明確,因此,用多種方法分離分析中藥及其復(fù)方中的活性成分一直是中藥防治疾病研究中一個(gè)有待解決的關(guān)鍵問題。細(xì)胞膜色譜為中藥活性成分的篩選研究提供了一種新的途徑。將CMC與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥活性組分的識(shí)別、篩選和鑒定。

        圖6 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對(duì)SNAP-tag-EGFR/HEK293細(xì)胞的增殖抑制作用 (n=3)

        用EGFR胞內(nèi)區(qū)朝外的SNAP-tag-EGFR/CMC模型與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng),篩選得到作用于EGFR的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿,可作為候選抗腫瘤化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。該色譜模型為研究中藥及其復(fù)雜體系活性成分靶向高效篩選與評(píng)價(jià)提供新方法,為受體-配體相互作用分析提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。

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