付 佳,賈倩倩,韓省力,賀浪沖*
1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院,西安 710061;2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021
中藥用于人類疾病的預(yù)防和治療已有數(shù)千年的歷史,其具有多組分、化學(xué)成分復(fù)雜的特點,其有效成分是中藥藥效學(xué)的基礎(chǔ),是新藥開發(fā)的重要來源[1-3]。北豆根(RhizomaMenispermi)是防己科植物蝙蝠葛的干燥根莖,具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛之功效,其單方制劑北豆根片、北豆根膠囊主要用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎和慢性支氣管炎等疾病[4]。據(jù)報道,北豆根還具有抗腫瘤作用,生物堿成分是其發(fā)揮抗腫瘤作用的活性組分[5-8]。
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜糖蛋白,EGFR家族通過激活一系列重要的細胞過程,包括細胞分裂、生長、分化、代謝、黏附、運動和死亡,在細胞介導(dǎo)的生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。據(jù)報道,EGFR在許多類型的癌癥中都有過表達,包括頭頸部、胰腺、乳腺、結(jié)腸、膀胱、腎臟、膀胱、卵巢和膠質(zhì)瘤[10-16]。由于EGFR的表達與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成密切相關(guān),因此EGFR已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點[17]。
細胞膜色譜是賀浪沖教授于1996年獨創(chuàng)的一種研究受體與藥物相互作用的新型親和色譜技術(shù)[18],主要用于中藥活性成分篩選、藥物受體相互作用和中藥注射液質(zhì)量控制等[19-24]。SNAP-tag是一種蛋白標(biāo)簽,其無論在體內(nèi)還是體外,都可特異性并快速與其配體苯甲基鳥嘌呤發(fā)生反應(yīng),以共價鍵結(jié)合,主要應(yīng)用于胞內(nèi)標(biāo)記、蛋白純化和蛋白固定等領(lǐng)域[25-28]。為提高細胞膜色譜柱的質(zhì)量,我們在前期工作中用SNAP-tag技術(shù)制備了一種新型的EGFR胞內(nèi)端朝外SNAP-tag-EGFR/CMC模型,提高了細胞膜色譜柱的穩(wěn)定性和篩選的特異性[29]。本研究將該模型用于靶向篩選中藥北豆根中EGFR的潛在抗腫瘤活性成分并研究藥物受體的相互作用。
HPLC-IT-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司,配有LC-20AD色譜泵2臺、SIL-20AC自動進樣器、CBM-20A控制器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LCMS-IT-TOF質(zhì)譜儀、電噴霧離子源和LCMS Solution工作站)。
氨基鍵合的硅膠為填充劑(博納艾杰爾科技公司);北豆根購自中藥材市場,經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)的干燥根莖;蝙蝠葛堿(批號JOT-10324,質(zhì)量分數(shù)≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);蝙蝠葛蘇林堿(批號DST200520-024,質(zhì)量分數(shù)≥98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司);CCK8試劑盒(上海陶素生化科技有限公司)。
一維條件:SNAP-tag-EGFR/CMC柱(10 mm×2.0 mm, 5 μm);流動相為50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氫二鈉溶液;柱溫為37 ℃;流速為0.2 mL·min-1;進樣量為5 μL;檢測波長為282 nm。二維條件:色譜柱為島津Shim-pack GISS-HP C18色譜柱(150 mm × 3.0 mm, 3.0 μm);流動相A為體積分數(shù)0.05%的三乙胺水溶液,流動相B為乙腈;流速為0.3 mL·min-1;梯度洗脫程序為0~60 min,20%~60% B;進樣量為5 μL,二極管陣列檢測器。
MS條件:離子化模式為電噴霧電離,霧化氣和干燥氣均為高純氮氣(N2,體積分數(shù)>99.999%),霧化氣流速為1.5 L·min-1,干燥氣壓力為109 kPa,曲線脫溶劑管線(CDL)溫度為200 ℃,加熱模塊溫度為200 ℃,接口電壓為4.5 kV,檢測電壓為1.57 kV,碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)氣為高純氬氣(Ar,體積分數(shù)>99.999%),CID能量為50%,正負離子掃描模式,掃描范圍為m/z50~1 000。
將蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對照品均配制成1 mg·mL-1的儲備液,待分析時用甲醇稀釋至適宜質(zhì)量濃度。
北豆根供試品的制備:稱取0.3 g北豆根粉末,用50 mL甲醇超聲提取1 h,減壓蒸餾得到北豆根總提取物,分析時用甲醇溶解,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,得供試品溶液。
細胞膜色譜柱制備方式與前期制備方式相同[29]。用胰蛋白酶將SNAP-tag-EGFR HEK293細胞消化,并用PBS(pH 7.4)洗滌2次。將5 mL Tris-HCl(pH 7.4)加入細胞懸液中,并用超聲波細胞粉碎機破碎細胞,其參數(shù)設(shè)置為:功率為200 W,每次工作3 s后停2 s,重復(fù)工作8次。然后將混懸液離心(1 000 r·min-1,10 min)。取上清液以12 000 r·min-1離心20 min得到細胞膜。然后將細胞膜重懸于5 mL PBS中,并緩慢添加到0.04 g苯甲基鳥嘌呤修飾的硅膠固定相中。并于37 ℃震蕩(1 500 r·min-1)孵育30 min。用PBS漂洗3次,洗去未反應(yīng)的細胞膜。用濕法裝柱得到SNAP-tag-EGFR細胞膜色譜柱。
將北豆根提取物進樣5 μL至SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中,使第一維SNAP-tag-EGFR/CMC柱上保留組分通過富集柱的富集和十通切換閥的切換,進入第二維HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)中進行進一步的分離及結(jié)構(gòu)分析、鑒定,得到一維保留組分的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。為進一步驗證二維在線聯(lián)用系統(tǒng)“識別”-“分析”-“鑒定”結(jié)果的可靠性,使被識別組分的混合對照品進入SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)中進行進一步的驗證。
為進一步驗證潛在活性成分與EGFR(PDB ID:2ITY)的受體-抑制劑結(jié)合作用,用SYBYL-X2.0程序進行分子對接分析。從PDB.org下載EGFR的結(jié)構(gòu)文件,去除水分子和共晶配體,在蛋白質(zhì)中加入氫。用Sybyl/Sketch模塊構(gòu)建蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的三維結(jié)構(gòu),并用Powell方法進行優(yōu)化。
用前沿分析法研究蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿與EGFR相互作用力的大小。流動相A為50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH7.4);流動相B為含有不同濃度藥物的50 mmol·L-1磷酸氫二鈉(pH 7.4);流速為0.2 mL·min-1;柱溫為37 ℃。先用A相平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱1 h,再將最低濃度的待測藥物溶液作為流動相連續(xù)進樣,形成突破曲線達到平臺后停止,換用A相緩沖液繼續(xù)平衡SNAP-tag-EGFR/CMC柱,待達到平衡后再進行該藥物的下一個濃度的分析,分別獲得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol·L-1條件下的待測藥物的突破曲線,待測藥物的KD值由公式(1)獲得。
(1)
mLapp:在給定的摩爾濃度的配體條件下,達到突破曲線的中點所需的配體的摩爾數(shù)(mol);
[A]:流動相中配體的濃度(mol·L-1);
mL:細胞膜色譜柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)(mol);
KD:平衡解離常數(shù)(mol·L-1)。
根據(jù)公式(1),以1/mLapp對1/[A]作圖呈良好的線性關(guān)系,回歸曲線截距的導(dǎo)數(shù)為CMC柱上的結(jié)合受體的總摩爾數(shù)mL,斜率和截距的比值為平衡解離常數(shù)KD值。
用CCK-8試劑盒,按照說明書對用SNAP-tag-EGFR/CMC模型篩選出的活性成分的效果進行評價。將密度為1.5×104細胞·孔-1的細胞接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h后,用不同濃度(5、25、50、100 μmol·L-1)的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿處理細胞48 h,用含10 μL CCK-8試劑盒溶液的無血清培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育2 h。用微孔板吸光度讀取器在450 nm處讀取吸光度。
北豆根提取物樣品經(jīng)SNAP-tag-EGFR/CMC與HPLC-IT-TOF-MS二維在線聯(lián)用系統(tǒng)分析,結(jié)果見圖1。圖1A為北豆根提取物在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的色譜圖,包含保留組分R1和非保留組分R0;圖1B為北豆根提取物直接進入HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖;將保留組分R1富集切換進入HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)進一步的分離得到2個組分,見圖1C;通過對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析,推測保留組分可能為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿,圖1D為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式。
為驗證上述篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,用同樣的方法對蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對照品溶液進行分析。結(jié)果見圖2,蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對照品與北豆根提取物的保留組分R1具有相同的保留行為和質(zhì)譜圖譜。因此,我們確定北豆根中潛在活性成分為蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿。
藥物-受體相互作用與藥物的體內(nèi)作用機制研究以及藥效評價密切相關(guān),因此用SNAP-tag-EGFR/CMC模型結(jié)合前沿分析法研究活性成分與EGFR的親和強度。圖3為SNAP-tag-EGFR/CMC前沿分析法測得蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿的代表性突破曲線和回歸曲線,可見蝙蝠葛蘇林堿(圖3A)和蝙蝠葛堿(圖3C)的突破曲線達到平臺期的時間點均隨著各自濃度的增加而縮短(突破曲線左移)。由蝙蝠葛蘇林堿(圖3B)和蝙蝠葛堿(圖3D)的回歸曲線計算得到蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR相互作用的KD值分別為2.48×10-6、3.57×10-6mol·L-1,證明蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR均存在一定強度的相互作用,這與蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC模型上的保留時間一致。見圖4。
注:A.北豆根提取物的SNAP-tag-EGFR細胞膜色譜圖;B.北豆根提取物直接進樣HPLC-IT-TOF-MS的色譜圖;C.保留組分R1經(jīng)過富集切換的HPLC-IT-TOF-MS色譜圖;D.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的結(jié)構(gòu)式;1.蝙蝠葛堿;2.蝙蝠葛蘇林堿。
注:A.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對照品溶液在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為;B.蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿混合對照品溶液直接進樣在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖;C.保留組分R1經(jīng)過富集切換在HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)上的色譜圖;1.蝙蝠葛堿;2.蝙蝠葛蘇林堿。
注: A.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線;B.蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線;C.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的突破曲線;D.蝙蝠葛堿在SNAP-tag-EGFR/CMC的回歸曲線;藥物濃度分別為1×10-7、2×10-7、3×10-7、4×10-7、5×10-7、6×10-7、7×10-7、8×10-7、9×10-7 mol·L-1(從下到上),(n=3)。
圖4 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿在SNAP-tag-EGFR/CMC柱上的保留行為
分子對接能夠呈現(xiàn)蛋白質(zhì)-配體的作用位置及作用力類型,也能體現(xiàn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點,我們用分子對接研究蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿與EGFR之間的相互作用。對接的通道模式研究表明,蝙蝠葛堿(圖5C)和蝙蝠葛蘇林堿(圖5D)均可以進入球形空間模型中EGFR的活性口袋。如帶狀模型所示,蝙蝠葛堿(圖5A)與ASP800形成1個氫鍵。蝙蝠葛蘇林堿(圖5B)與MET793和GLN791形成2個氫鍵,表明北豆根中的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可與EGFR發(fā)生相互作用,為CMC靶向藥物活性組分篩選提供依據(jù)。見圖5。
注:A.蝙蝠葛堿與EGFR對接的帶狀模式;B.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對接的帶狀模式;C.蝙蝠葛堿與EGFR對接的通道模式;D.蝙蝠葛蘇林堿與EGFR對接的通道模式。
我們用CCK8法檢測了蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對SNAP-tag-EGFR/HEK293細胞生長的潛在抑制作用。結(jié)果見圖6,當(dāng)蝙蝠葛堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時,對SNAP-tag-EGFR/HEK293細胞生長的抑制率分別為5.18%±7.64%、43.09%±8.04%、80.59%±3.74%、83.83%±3.66%。當(dāng)蝙蝠葛蘇林堿的濃度分別為5、25、50、100 μmol·L-1時,對SNAP-tag-EGFR/HEK293細胞生長的抑制率分別為7.38%±12.98%、40.90%±1.65%、73.70%±6.93%、86.40%±2.43%。在5~100 μmol·L-1的范圍內(nèi),蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿對SNAP-tag-EGFR/HEK293細胞的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。因此,蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿可作為候選抗腫瘤化合物進行進一步研究。
由于中藥組成成分復(fù)雜,發(fā)揮治療作用的活性成分不明確,因此,用多種方法分離分析中藥及其復(fù)方中的活性成分一直是中藥防治疾病研究中一個有待解決的關(guān)鍵問題。細胞膜色譜為中藥活性成分的篩選研究提供了一種新的途徑。將CMC與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng)可實現(xiàn)對中藥活性組分的識別、篩選和鑒定。
圖6 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對SNAP-tag-EGFR/HEK293細胞的增殖抑制作用 (n=3)
用EGFR胞內(nèi)區(qū)朝外的SNAP-tag-EGFR/CMC模型與HPLC-IT-TOF-MS構(gòu)成二維聯(lián)用系統(tǒng),篩選得到作用于EGFR的活性組分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿,可作為候選抗腫瘤化合物進行進一步的研究。該色譜模型為研究中藥及其復(fù)雜體系活性成分靶向高效篩選與評價提供新方法,為受體-配體相互作用分析提供了一個強大的平臺。