侯文赫，郭子微，郭彩珍，張建成，穆霄鵬，王鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

原花青素（proanthocyanidin，PA）又稱縮合單寧，是植物中重要的多酚類化合物，在枝皮、葉片、根、果實及花朵中均有分布[1]。原花青素由類黃酮代謝途徑合成，大部分的原花青素由CC和EC聚合而成，通常以低聚體（聚合度為2～4）和高聚體（聚合度≥5）的形式存在。原花青素生理功能具有多樣性，除在植物防御機制中起作用，還可影響果實的品質(zhì)及風味，可以使果實呈現(xiàn)澀味，其組分和含量直接影響果實風味[2]。前人在葡萄[3]、蔓越莓[4]、柿[5]等水果上已經(jīng)開展了原花青素的積累合成及抗氧化能力的研究。原花青素具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，根據(jù)聚合程度不同分為單體、低聚體和高聚體。其中，低聚原花青素（OPC）抗氧化活性強于高分子原花青素（PPC）[6]。原花青素具有較高的醫(yī)療價值和保健功能。李書藝等[7]研究指出，原花青素可以有效抑制DNA損傷；劉丹丹等[8]研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可有效調(diào)節(jié)糖尿病大鼠體內(nèi)的鐵代謝紊亂，減輕氧化損傷，對胰腺具有一定保護作用。因此，原花青素逐漸成為植物學、食品科學、醫(yī)學等領(lǐng)域研究的熱點[9-10]。

歐李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）屬薔薇科櫻桃屬矮生櫻亞屬植物[11]。作為第3代功能水果，除具有的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟效益外，還具有極強的適應性、良好的生態(tài)價值和藥用價值。果實中富含類黃酮、多酚、氨基酸、有機酸等營養(yǎng)和保健物質(zhì)[12]。目前，關(guān)于歐李原花青素的研究較少，白東海[13]在研究歐李果實中的黃酮類物質(zhì)的組分及含量時，發(fā)現(xiàn)原花青素的種類及含量豐富，因此，有必要深入研究歐李果實原花青素的積累機制和生物活性。

本研究采用高效液相色譜法測定了不同歐李品種果實發(fā)育期原花青素成分及其變化規(guī)律，分析了原花青素的抗氧化活性，可以作為改進歐李品質(zhì)和開發(fā)的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 10個歐李品種（晉歐1號、10-32、02-16、7號、6號、5號、08-16、09-01、Y04-26、DS-1）均采自山西農(nóng)業(yè)大學歐李種質(zhì)資源圃，分別于幼果期、硬核期、轉(zhuǎn)色期、成熟期采集果實樣品。每個歐李品種10株為1個小區(qū)，重復3次，每個時期每株采集中上部5個果實。采后立刻裝入冰盒，去柄、去核，液氮處理速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑 色譜級甲醇、乙醇、單寧酸、兒茶素（CC）、表兒茶素（EC）、原花青素B1（PCB1）、原花青素B2（PCB2）、原花青素A1（PCA1）、原花青素A2（PCA2）標準品均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Thermo公司）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（Waters公司，中國上海）；紫外可見分光光度計（V-5200，上海元析儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原花青素總量測定 采用鹽酸-香草醛法[14]：稱取歐李果實研磨樣0.3 g，5 mL浸提液提?。?0%鹽酸-乙醇溶液，25 ℃超聲提取1 h），然后以5 000 r/min 離心15 min，定容。取0.5 mL樣品稀釋液與3.0 mL 4%香草醛甲醇液和1.5 mL 37%鹽酸充分混勻，30 ℃水浴20 min，500 nm處測吸光度，以蒸餾水為對照。兒茶素制作標準曲線，結(jié)果以每100 g鮮樣含有的兒茶素毫克數(shù)表示。

1.3.2 單寧含量測定 采用Folin-Ciocalteau法[15]并稍作修改：準確稱取0.25 g的研磨樣，加提取溶劑浸提（乙醇濃度30%、提取溫度60 ℃、提取時間4 h，固液比1∶30），120 00 r/min，離心15 min，取上清液，搖勻定容。將1 mL樣品稀釋液，與0.5 mL FD試劑（磷鉬鎢酸試劑）和7.5 mL蒸餾水混勻靜置3 min，之后加入1 mL飽和碳酸鈉混勻，反應1 h。用單寧酸標準品制作標準曲線，760 nm處測定吸光值，結(jié)果以每克鮮樣中含有的單寧酸百分含量表示。

1.3.3 原花青素組分及含量測定 參考覃國新等[16]的方法，準確稱取1.0 g歐李果實研磨樣于10 mL離心管中，加入0.5 mL 85%乙醇水溶液，30 ℃超聲提取30 min，在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，重復提取2次，合并上清液，蒸至近干，色譜級甲醇溶解并定容。將提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾到1.0 mL進樣瓶中，利用HPCL測定原花青素組分，每個樣品重復3次。檢測波長280 nm，進樣量10 μL，柱溫35 ℃。標準曲線繪制：分別精密稱取CC、EC、PCB1、PCB2、PCA1、PCA2對照品，用色譜級甲醇定容，配制成1 mg/mL的對照品儲備液，繪制標準曲線。樣品中的原花青素成分含量以mg/100 g表示。

1.3.4 抗氧化能力測定[17]精密稱取0.6 g研磨樣，加入6 mL 40%甲醇水溶液于10 mL 離心管中，超聲提取30 min ，12 000 r/min，離心10 min，回收上清，重復2次，定容[17]。

1.3.4.1 DPPH·清 除 法（DPPH法）[18]吸 取0.1 mmol/L DPPH溶液2.8 mL加入到0.2 mL上述待測液中，避光30 min，在517 nm波長處測定樣品的吸光度，以提取液替代待測液與DPPH溶液反應后作對照。

1.3.4.2 ABTS+清除法（ABTS法）[19]反應液由7 mmol/L ABTS與140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合而成，避光后用乙醇稀釋至吸光值為0.7左右；吸取3.9 mL反應液加入到0.1 mL上述的待測液中，混勻后避光10 min，于734 nm處測吸光值。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP法）[20]取0.1 mol/L乙酸鈉 緩 沖 液、20 mmol/L三氯化鐵溶液和10 mmol/L三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液，按10∶1∶1混合成為反應液；吸取4.9 mL反應液，加入到0.1 mL上述的待測液中，混勻后室溫避光10 min，然后在593 nm處比色，重復3次。結(jié)果均以Trolox的當量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件進行顯著性、相關(guān)性分析，采用Origin 2018、TBtools作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果實發(fā)育期原花青素及單寧含量變化

10個歐李品種果實發(fā)育期原花青素含量的動態(tài)變化如圖1所示。

圖1 10個歐李品種果實發(fā)育期原花青素含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of proanthocyanidin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

從圖1可以看出，10個歐李品種中原花青素含量存在差異，并且隨著果實發(fā)育進程推進原花青素含量逐漸減少，幼果期原花青素含量最高，成熟期最低；且在硬核期到轉(zhuǎn)色期這一階段果實中原花青素含量下降趨勢顯著（P＜0.05）。晉歐1號原花青素含量在整個果實發(fā)育期高于其他品種，幼果期為585.819 mg/100 g，成熟期含量降至89.448 mg/100 g。DS-1原花青素含量在整個果實發(fā)育期均低于其他品種，幼果期為394.305 mg/100 g，成熟期為35.761 mg/100 g。

由圖2可知，10個歐李品種的單寧含量有差異，隨著果實成熟逐漸降低。在幼果期，晉歐1號單寧含量最高，為3.07%；DS-1單寧含量最低，為2.09%；成熟時晉歐1號單寧含量為0.50%，DS-1單寧含量為0.43%。

圖2 10個歐李品種果實發(fā)育期單寧含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of tannin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

2.2 歐李果實發(fā)育期原花青素成分及含量的變化

由圖3可知，在晉歐1號和DS-1果實中均檢測到PCB1、PCB2、PCA1和PCA2及CC、EC，除PCB2外，其他組分含量均伴隨果實成熟而下降。在晉歐1號果實中，PCA1和PCB2含量在整個發(fā)育期基本保持穩(wěn)定，CC含量最高，為415.674 mg/100 g，PCB1含 量 次 之，為368.259 mg/100 g，最 少 的是PCA1，為6.673 mg/100 g。在DS-1果實中，PCB2含量在整個發(fā)育期基本保持穩(wěn)定，CC含量最高，為250.171 mg/100 g，PCB1含量（151.734 mg/100 g）次之，最少的是PCA2，為1.547 mg/100 g。晉歐1號果實中CC和EC含量分別在成熟期和轉(zhuǎn)色期低于DS-1，其余時期6種原花青素物質(zhì)含量均高于DS-1。晉歐1號幼果期CC和PCB1的含量顯著高于DS-1，分 別 是DS-1的2.43倍、1.66倍；而DS-1中PCA1的含量顯著高于晉歐1號，幼果期PCA1含量是晉歐1號的3.6倍，成熟期PCA1含量是晉歐1號的2.1倍。表明不同品種原花青素積累能力存在較大差異，可進一步研究其積累差異的生理機制。

圖3 歐李果實原花青素成分與含量變化Fig.3 Changes in components and content of proanthocyanidins in Cerasus humilis fruits

2.3 歐李果實發(fā)育期抗氧化能力的變化

由圖4可知，DPPH自由基清除能力伴隨果實發(fā)育逐漸變?nèi)?。晉歐1號的DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在硬核期達到最高，為30.225 mg/g，成熟期最低，為8.241 mg/g；在DS-1中，DPPH自由基清除能力在果實發(fā)育過程中也表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，在幼果期最高，為31.055 mg/g，成熟期最低，為5.883 mg/g。幼果期和轉(zhuǎn)色期晉歐1號的DPPH自由基清除能力顯著高于DS-1（P＜0.05），硬核期和成熟期DS-1 DPPH·自由基清除能力顯著高于晉歐1號（P＜0.05）。說明不同品種間的DPPH自由基清除能力存在明顯差異。

圖4 歐李品種果實發(fā)育期3種抗氧化能力的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of three antioxidant activities in Cerasus humilis during fruit development period

由圖4可知，歐李果實ABTS+清除力在不同品種間的變化存在差異，在晉歐1號中，ABTS+清除能力在果實發(fā)育早期緩慢上升，硬核期達到最高，為130.152 mg/g；隨后開始下降，成熟期降為最低，為10.653 mg/g；而DS-1果實ABTS+清除力在果實發(fā)育過程中呈下降趨勢，幼果期最高，為133.641 mg/g；成熟期最低，為6.299 mg/g。晉歐1號和DS-1的ABTS+清除能力在硬核期存在顯著差異（P＜0.05），其他時期差異不顯著。

由圖4可知，歐李果實鐵離子還原能力在不同品種中的變化存在差異，在晉歐1號果實生長過程中呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，硬核期鐵離子還原能力達到最高，為62.055 mg/g，成熟期最低，為18.738 mg/g；而DS-1果實鐵離子還原能力在果實發(fā)育過程中呈下降趨勢，幼果期最高，為37.33 mg/g；成熟期最低，為8.204 mg/g。果實發(fā)育的整個階段晉歐1號的果實鐵離子還原能力顯著高于DS-1（P＜0.05）。

總體上，晉歐1號的ABTS、FRAP、DPPH自由基3種抗氧化活性均高于DS-1。2個品種的3種自由基清除能力隨果實發(fā)育整體呈下降趨勢。晉歐1號果實抗氧化能力在硬核期較高；而DS-1抗氧化活性在幼果期最高。

2.4 原花青素成分與抗氧化能力間的相關(guān)性分析

從圖5可以看出，晉歐1號果實中3種自由基清除能力與總原花青素和PCB1均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CC、EC均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；PCB2與DPPH自由基清除能力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），與另外2種抗氧化能力有相關(guān)性但不顯著，而PCA1和PCA2與3種自由基清除能力有相關(guān)性，但均不顯著。

圖5 晉歐1號原花青素與抗氧化能力的相關(guān)性Fig.5 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in Jin'ou 1

由圖6可知，DS-1果實中3種自由基清除能力與總原花青素和PCB1均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CC和EC呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），3種自由基清除能力與PCA2有較強相關(guān)性，但不顯著；與PCB2和PCA1也表現(xiàn)出較高的相關(guān)性，但不顯著。

圖6 DS-1原花青素與抗氧化能力的相關(guān)性Fig.6 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in DS-1

3 結(jié)論與討論

在果實發(fā)育過程中，10個歐李品種果實的總原花青素和單寧含量下降，成熟時晉歐1號原花青素含量最高，DS-1含量最低。不同水果和不同品種果實中原花青素組分及含量會直接影響其風味和品質(zhì)。ZHENG等[21]檢測了不同柿品種原花青素含量的變化，隨著果實成熟原花青素含量呈下降趨勢，磨盤柿含量最高，其次為羅田甜柿。嚴娟等[22]對3種肉色桃的原花青素含量和積累趨勢研究發(fā)現(xiàn)，不同肉色桃的原花青素含量存在差異，紅肉桃原花青素含量最高，白肉桃次之，黃肉桃最低；且隨著果實發(fā)育原花青素含量呈下降趨勢。本試驗對10個歐李品種果實的原花青素研究發(fā)現(xiàn)，果實發(fā)育過程中原花青素含量呈下降趨勢，原花青素含量因品種而異。晉歐1號原花青素的含量最高，DS-1最低；10個歐李品種果實的單寧含量也隨著果實的成熟逐漸降低，晉歐1號單寧含量也最高，DS-1單寧含量比較低，由此可知，在歐李果實中原花青素及單寧含量在果實發(fā)育過程中均呈下降趨勢，且不同品種間原花青素和單寧含量存在差異，除此之外，10個歐李品種果實的原花青素和單寧含量均在硬核期到轉(zhuǎn)色期含量顯著下降。本研究表明，原花青素可影響果實澀度，推測不同歐李品種原花青素含量的差異可能是導致果實澀度差異的原因。

晉歐1號和DS-1果實中原花青素主要單體物質(zhì)為兒茶素和表兒茶素，主要的聚合物為PCB1、PCB2、PCA1和PCA2，其中，兒茶 素和原 花青素B1含量最高，品種間差異顯著。原花青素大部分由兒茶素和表兒茶素單體聚合而成，通常以聚合狀態(tài)的形式積累，根據(jù)聚合程度的不同，一般將聚合度為2～4的稱為低聚體，聚合度≥5的稱為高聚體。目前聚合度高的原花青素分離、純化的方法尚在研究中，還未能工業(yè)化生產(chǎn)[23]。山楂中分離所得的原花青素主要成分為兒茶素、表兒茶素及原花青素二聚體[24]；蘇葉萍等[25]分離出了葡萄籽中的3種原花青素單體、9種二聚體和5種四聚體；板栗中鑒定出原花青素種類有兒茶素、表兒茶素、B型原花青素二聚體[26]。本研究檢測了歐李果實中幾種原花青素單體和二聚體，發(fā)現(xiàn)原花青素B1和兒茶素在果實原花青素組分中占有較高的比例。由此推測，大部分果實中原花青素主要單體物質(zhì)為兒茶素和表兒茶素，化合物種類較多，且二聚體含量較高于其他多聚體，且結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，由于原花青素二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此，推測原花青素二聚體可能影響歐李果實澀度等方面，還需進一步研究。

目前，可用于抗氧化活性的檢測方法有很多，由于抗氧化反應的多樣性和復雜性，當檢測具體某一樣品的抗氧化活性時，由于樣品在不同檢測方法中可能作為抗氧化劑或促氧化劑[27]。因此，本研究中選擇了3種體外抗氧化活性檢測方法，其中ABTS、DPPH通過檢測自由基清除能力反映樣品的抗氧化活性，鐵離子還原能力（FRAP）通過檢測樣品的還原能力來體現(xiàn)樣品的抗氧化活性。FRAP、DPPH·法是評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏的方法，而ABTS也具有簡便、靈敏和快捷的優(yōu)點[28]。抗氧化能力是原花青素最重要的性質(zhì)[29]，LIU等[30]對葡萄籽的研究發(fā)現(xiàn)，原花青素具有檢測自由基的能力，原花青素的抗氧化活性與聚合度密切相關(guān)。而OPC擁有很強的抗氧化活性，尤其是二聚體抗氧化活性最強，目前在醫(yī)學上有很多重要作用[31]。LING等[32]、KIM等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，原花青素低聚體具有良好的生物活性，具有清除自由基（如DPPH、·OH和O2-·等）和抑制脂肪氧化酶活性的能力；徐瀟吟等[34]研究發(fā)現(xiàn)，歐李果實原花青素通過提高抗氧化物酶活性，起到抑制氧化的作用。本研究表明，歐李果實中原花青素含量豐富，且原花青素二聚體含量占有較高比例，故歐李果實抗氧化能力較強，2個品種抗氧化能力隨著果實成熟而降低，抗氧化能力與原花青素B1呈顯著正相關(guān)，與兒茶素、表兒茶素呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。原花青素在天然抗氧化劑和功能食品領(lǐng)域具有很大的開發(fā)應用價值。