楊慧明, 沈 沖, 孟 琴

面向微流控肺芯片的水凝膠薄膜制備及其性能研究

楊慧明, 沈 沖, 孟 琴

(浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

微流控肺芯片是一種肺細胞的三維培養(yǎng)裝置，其核心部件為一層聚二甲基硅氧烷(PDMS)多孔薄膜，但其存在硬度高、疏水性強、細胞相容性差等缺陷。為更好地模擬人體肺泡，擬制備一種基于甲基丙烯?；髂z(Gel-MA)和丙烯酸酯化聚醚F127(F127-DA)的共聚水凝膠薄膜，替代PDMS用于肺芯片構(gòu)建。結(jié)果顯示，利用表面張力將等體積比的Gel-MA和F127-DA單元溶液在聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜圓孔內(nèi)形成液膜，隨后紫外引發(fā)共聚反應(yīng)，制得共聚水凝膠薄膜，平均厚度為35 μm，并具有多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該水凝膠薄膜的楊氏模量為13.55 kPa、斷裂延伸率為57.05%，力學(xué)性能可滿足肺芯片的構(gòu)建需要；此外，水凝膠薄膜對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺泡上皮細胞(HPAEpiC)具有良好相容性；同時，該水凝膠薄膜的氧氣擴散系數(shù)為1.40′10-3cm2×min-1，說明其氧氣傳遞性能良好?？傊?，該水凝膠薄膜的各項指標(biāo)與肺泡的性質(zhì)均較為接近，從而為構(gòu)建符合人體生理學(xué)的新型微流控肺芯片提供了新材料。

肺芯片；水凝膠薄膜；力學(xué)性能；細胞相容性；氧氣傳遞性能

1 前 言

隨著微制作技術(shù)的快速發(fā)展，基于微流控的器官芯片受到極大關(guān)注。肺芯片作為一種器官芯片，能夠在體外精確模擬肺泡的三維微環(huán)境，可用于構(gòu)建符合患者自身條件的疾病模型，從而實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)治療[1-3]。

肺芯片的核心部件是由一層滲透膜和膜兩側(cè)肺上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞組成的氣液屏障[4]。滲透膜需具備一定的彈性和可滲透性，常見的材料有聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)和聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等高分子材料。其中，PDMS制備的多孔柔性膜是最常見的滲透膜，其厚度約為10 μm，微孔直徑為8～10 μm[5-8]，許多研究者利用其構(gòu)建了由氣壓驅(qū)動的可呼吸肺芯片，可模擬細菌入侵肺泡過程[9]，已被用于肺癌轉(zhuǎn)移[10]和肺血栓發(fā)生機理[11]等方面的研究。但是，PDMS滲透膜的楊氏模量遠大于人體肺組織[12-13]，且由于其疏水性強導(dǎo)致細胞相容性差；此外，該材料不透水，需在膜上制備工藝繁雜的微孔陣列，以便細胞養(yǎng)分運輸和信號交流，因此PDMS并非良好的構(gòu)建材料[14]。

與上述高分子材料不同，水凝膠具有軟而濕、傳遞性能好的特點，更加貼合體內(nèi)細胞生存環(huán)境[15-19]。研究表明，相對于表面硬度大的材料，在較軟的水凝膠上，間充質(zhì)干細胞展現(xiàn)出較多的絲狀偽足，細胞骨架更為分散[20-21]；而且細胞對藥物及外界刺激的反應(yīng)也受到基底硬度影響。例如，3D水凝膠細胞培養(yǎng)能更加真實地反映肺癌轉(zhuǎn)移中的細胞侵襲過程，可用于抗癌藥物的研發(fā)[22]。然而，目前為止，尚未見到采用水凝膠薄膜構(gòu)建肺芯片的報道，這是因為大多數(shù)水凝膠的機械強度差[23-25]，旋涂法[26]和相界面法[27]等制得的微米級水凝膠薄膜由于缺少硬質(zhì)材料的支撐常難以鋪展，不能承受拉力且易溶脹變形，從而限制了其應(yīng)用。

為此，本研究利用由丙烯酸酯化聚醚F127(F127-DA)與甲基丙烯?；髂z(Gel-MA)制備的共聚水凝膠單元溶液的表面張力，在開孔的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上共聚制備了不會溶脹的水凝膠薄膜。該水凝膠薄膜以PET硬質(zhì)膜為支撐，依靠二苯甲酮(BP)的光活性實現(xiàn)水凝膠與PET之間的鍵合，從而得到滿足肺芯片構(gòu)建要求的水凝膠薄膜。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

普朗尼克F127、四甲基偶氮唑藍(MTT)和丙烯酰氯均購自美國Sigma公司；用于微生物學(xué)的明膠購自阿拉丁(上海)有限公司；甲基丙烯酸酐購自上海麥克林生化科技有限公司；光引發(fā)劑Irgacure 2959購自德國巴斯夫公司；達爾伯克氏(DMEM)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS) 均購自美國賽默飛公司；胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購自上海生物工程有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺泡上皮細胞(HPAEpiC) 均購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；PET膜購自上海億偉機電五金有限公司；其余藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 水凝膠單元及其溶液的制備

F127-DA的制備：稱取13 g普朗尼克F127溶于50 mL四氫呋喃，完全溶解后將體系置于0 ℃冰浴，向溶液中加入1 920 μL三乙胺(TEA)，然后以1 mL×min-1的速率向體系滴加質(zhì)量濃度為130 mg×L-1的丙烯酰氯-四氫呋喃溶液15 mL，密封上述反應(yīng)體系。冰浴條件下反應(yīng)1 h后將反應(yīng)體系升至室溫，然后繼續(xù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后高速離心去除三乙基氯化銨，上清液蒸干溶劑后用乙醚清洗殘留的雜質(zhì)，旋蒸去除乙醚可得到白色粉末狀F127-DA[28]，反應(yīng)原理如圖1(a)所示。

Gel-MA的制備：稱取10 g明膠溶于100 mL水，于50 ℃下溶解充分后逐滴加入3 mL甲基丙烯酸酐，滴加速率為0.5 mL×min-1，在50 ℃、密封條件下反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后向體系加入5倍體積的水稀釋以終止反應(yīng)。將溶液裝入截留分子質(zhì)量8 000～14 000的透析袋中，40 ℃熱水透析3 d后凍干，得到Gel-MA固體產(chǎn)物，反應(yīng)原理如圖1(b)所示。

圖1 F127-DA和Gel-MA合成路線圖

單元溶液的制備：稱取3 g F127-DA固體溶于17 mL水，得到兩者質(zhì)量比為0.15的單元溶液；稱取2 g Gel-MA固體溶于18 mL水，得到兩者質(zhì)量比為0.1的單元溶液。在上述2種單元溶液中各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的光引發(fā)劑Irgacure 2959。

2.3 水凝膠薄膜的制備

水凝膠薄膜的制備：將開孔PET膜用含有BP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的丙酮溶液處理30 min，并用乙醇沖洗多余的BP溶液，烘干后浸入Gel-MA與F127-DA單元溶液體積比(Gel-MA):(F127-DA)=1:1的共聚水凝膠(Gel-MA/F127-DA(1/1))單元溶液中，利用溶液的表面張力在開孔處形成一層液膜，拭去多余溶液后紫外照射固化。

2.4 細胞培養(yǎng)

將HUVEC和HPAEpiC于DMEM細胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%的FBS)中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。選擇處于對數(shù)生長期的細胞，取HUVEC和HPAEpiC的細胞液10 μL接種于水凝膠薄膜表面，細胞密度為3 000個×μL-1。置于12 孔板內(nèi)，緩慢添加培養(yǎng)基1.5mL進行培養(yǎng)，每隔2 d更換培養(yǎng)基。

2.5 測試表征

水凝膠薄膜厚度測量：水凝膠膜沿徑向剪開后，貼在載玻片上。使用IX71型倒置顯微鏡(奧林巴斯株式會社)觀察其厚度的徑向分布，直徑十等分固定取11個點，并利用標(biāo)尺測量其厚度。

細胞活率測定：HUVEC和HPAEpiC培養(yǎng)至第5天后通過MTT法測定細胞活率。具體做法是：加入0.3 mg×mL-1的MTT溶液，經(jīng)37 ℃溫育4 h后，吸去溶液，并向其中加入HCl酸化的異丙醇，室溫震蕩1 h，最后，通過酶標(biāo)儀將所得溶液于570 nm下測定吸光度。其中，對照組為培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細胞。

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)表征：將水凝膠樣品真空干燥后研碎，與KBr粉末混合壓片。用IS5型傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)試驗，掃描波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1。

掃描電子顯微鏡(SEM)表征：水凝膠樣品置于1～4 LD Plus型冷凍干燥機(德國Christ公司)冷凍干燥48 h，對樣品表面噴金處理，使用SU-8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)對水凝膠進行表面分析。

機械強度表征：拉伸試驗前記錄水凝膠片的截面積，并測量夾具間樣品原始長度。用Zwick/Roell Z020型萬能力學(xué)試驗機(德國Zwick公司)測定應(yīng)力～應(yīng)變曲線，以斷裂強度對應(yīng)的應(yīng)變計算楊氏模量。測定條件：溫度為25 ℃、濕度為50%、拉伸速率為4 mm×min-1。

水凝膠氧氣擴散系數(shù)的測定：3D打印樹脂擴散池的傳質(zhì)面積為0.785 cm2，液池體積為3.3 mL。水凝膠膜厚度為2mm，夾在氣室和液室之間。插入DO-957型溶解氧電極(上海雷磁儀器公司)后將擴散池置于密閉的環(huán)境中，通過N2吹掃獲得無氧環(huán)境，避免測量誤差；氣室通空氣，液室為經(jīng)N2吹掃后不含氧氣的水。測定條件為25 ℃、濕度100%。根據(jù)菲克定律計算氧氣擴散系數(shù)，如式(1)所示。

式中：為氧氣質(zhì)量，g；為時間，min；為液池體積，mL；為液池內(nèi)氧氣質(zhì)量濃度，g×mL-1；￠-為空氣和液池中的氧氣質(zhì)量濃度差，g×mL-1；O2為氧氣擴散系數(shù)，cm2×min-1；為傳質(zhì)面積，cm2；為水凝膠厚度，cm。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

細胞覆蓋率統(tǒng)計：采用5點取樣法，利用網(wǎng)格目鏡統(tǒng)計細胞覆蓋面積與視野比值，作為細胞覆蓋率。所有實驗重復(fù)3次，每次實驗設(shè)置3個平行樣。顯示結(jié)果為平均值，當(dāng)出現(xiàn)偏離原假設(shè)值的概率(P值)小于0.05時，說明對比組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 水凝膠薄膜的制備

圖2(a)為邊長1 cm的正方形PET膜，利用打孔器在其中心開孔，孔的直徑分別為2、3和4 mm。圖2(b)是以經(jīng)BP處理的PET膜(開孔直徑為4 mm、厚度為25 μm)為支架、加載水凝膠單元溶液后再紫外照射制得的水凝膠薄膜。當(dāng)BP被紫外照射后，通過系間竄越迅速由單線態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)[29]。此時，BP能夠奪取PET的氫原子產(chǎn)生表面自由基[30]，引發(fā)水凝膠和PET之間的鍵合。

圖2 系列孔徑的PET膜與水凝膠薄膜

水凝膠薄膜厚度與PET膜厚度呈正相關(guān)，與開孔直徑呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果如圖3(a)所示。使用開孔直徑為4 mm、厚度為25 μm的PET膜可制得平均厚度為35 μm的水凝膠薄膜。圖3(b)為以水凝膠薄膜直徑為主軸、圓心為原點得到的水凝膠薄膜厚度徑向分布。受重力影響，薄膜具有中間厚、邊緣薄的特征，且邊緣厚度接近PET膜厚。圖4為水凝膠薄膜徑向剖面的顯微鏡照片。

圖3 厚度可調(diào)的水凝膠膜的制備及水凝膠膜厚度的徑向分布

3.2 水凝膠薄膜的結(jié)構(gòu)與形貌

圖5為F127-DA水凝膠、Gel-MA/F127-DA(1/1)及其原料的FI-TR譜圖。由圖可見，F(xiàn)127-DA水凝膠在1 731 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，表明F127端羥基與丙烯酰氯反應(yīng)生成了酯羰基。1 642 cm-1為酰胺I帶的吸收峰，主要由C═O伸縮振動引起；1 530 cm-1附近為酰胺II帶的吸收峰，由C─N伸縮振動和N─H彎曲振動耦合引起。Gel-MA的酰胺特征峰明顯強于純明膠Gel的相應(yīng)峰，表明甲基丙烯基團被接枝到了明膠分子鏈。

圖4 水凝膠膜徑向厚度的顯微鏡照片

圖5 水凝膠及其原料的FT-IR圖

(a) Gel (b) Gel-MA (c) F127 (d) F127-DA (e) Gel-MA/F127-DA(1/1)

不同體積比((Gel-MA)/(F127-DA)為1/3、1/2、1/1、2/1)的Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠的SEM形貌如圖6所示。由圖可見，Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠表面呈三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔道分布較為均勻。由于Gel-MA分子質(zhì)量較低，Gel-MA添加比例增大會導(dǎo)致孔道變小。當(dāng)Gel-MA與F127-DA的單元溶液體積比為2:1時，多孔結(jié)構(gòu)幾乎不存在，呈現(xiàn)出凹凸不平的表面。

圖6 不同體積比的Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠的SEM圖

3.3 水凝膠的機械強度

力學(xué)性能是影響水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵因素。圖7為不同體積比的Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠的應(yīng)力～應(yīng)變曲線，表1是共聚水凝膠的力學(xué)性能。結(jié)果表明，隨Gel-MA添加比例增大，水凝膠的楊氏模量、斷裂延伸率和抗張強度逐漸降低。由表1可見，Gel-MA與F127-DA單元溶液體積比(Gel-MA):(F127-DA)從0 (純F127-DA)變?yōu)?:1時，水凝膠的楊氏模量和抗張強度由23.68和26.86 kPa降至9.87和3.08 kPa，相應(yīng)的斷裂延伸率從119.84%降至31.18%。影響水凝膠力學(xué)強度的因素主要有3個方面：水凝膠結(jié)構(gòu)、介質(zhì)組成和含水量[31]。F127-DA只有端基存在丙烯基團，聚合過程中會形成長的大分子鏈，具有較高的韌性。而未加修飾的明膠基水凝膠力學(xué)強度低，具有軟而脆的特點[32]。因此，Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠的強度與Gel-MA添加比例呈負(fù)相關(guān)。

圖7 不同體積比的Gel-MA /F127-DA共聚水凝膠的應(yīng)力～應(yīng)變曲線

表1 不同體積比的Gel-MA /F127-DA共聚水凝膠的力學(xué)性能

人肺的彈性模量隨著肺部擴張程度的變化而不斷改變。在正常呼吸過程中，肺的楊氏模量為12～20 kPa[33-34]。(Gel-MA):(F127-DA)為1:3、1:2和1:1的共聚水凝膠的楊氏模量均與其接近。而(Gel-MA):(F127-DA)=2:1的水凝膠楊氏模量只有9.87 kPa，強度較弱。此外，PDMS預(yù)聚體與固化劑的濃度比在10:1時，其楊氏模量約為700kPa，其硬度遠超肺組織的楊氏模量[13]，因此不適宜用作微流控肺芯片的構(gòu)建材料。

3.4 水凝膠薄膜的細胞相容性

細胞必須先在材料表面貼附，才能遷移、增殖和分化。細胞在PDMS膜表面基本不貼附，通常需要表面功能化來增強細胞相容性[35]。而水凝膠一般具有良好的細胞相容性[36]，因此，本研究對Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠的細胞相容性進行了考察。圖8是HUVEC在不同配比水凝膠薄膜表面培養(yǎng)3 d后在倒置顯微鏡下觀察到的貼壁狀況。由圖可見，HUVEC在F127-DA水凝膠表面幾乎不貼壁生長，這是因為F127的聚環(huán)氧乙烷鏈段具有抗細胞黏附特性[37]；Gel-MA/F127-DA(1/1)的表面細胞生長狀況最佳，貼壁后的細胞呈梭形。為了量化細胞在水凝膠薄膜表面的貼壁程度，對HUVEC和HPAEpiC的生長覆蓋率進行了統(tǒng)計，結(jié)果見圖9(a)、(b)。由圖可見，Gel-MA/F127-DA(1/1)共聚水凝膠的細胞覆蓋率最高，且HUVEC的生長速度快于HPAEpiC。圖9(c)為HUVEC和HPAEpiC相對于培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細胞的活率。由圖可見，細胞活率即細胞相容性，與Gel-MA添加比例呈正相關(guān)，Gel-MA/F127-DA(1/1)共聚水凝膠的細胞生長狀況與細胞培養(yǎng)皿(對照組)接近。這是由于Gel-MA結(jié)構(gòu)上具有細胞黏附位點及基質(zhì)金屬蛋白酶水解位點，促進細胞的生長[38]，使F127-DA的抗黏附性影響降低。

圖8 不同體積比的Gel-MA/ F127-DA共聚水凝膠的HUVEC貼壁情況

圖9 不同水凝膠表面HUVEC和HPAEpiC的覆蓋率及活率

3.5 水凝膠薄膜的氧氣傳遞性能

在微流控肺芯片構(gòu)建過程中，氧氣傳遞性能關(guān)系到血管內(nèi)皮細胞是否能正常呼吸[39]。利用擴散池和溶解氧電極，測得純F127-DA和Gel-MA/F127-DA (1/1)的O2如表2所示。其中，Gel-MA/F127-DA(1/1) 共聚水凝膠的O2為1.40′10-3cm2×min-1，與純F127-DA水凝膠的O2相比較大，其原因在于Gel-MA的加入使F127-DA水凝膠呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)(見圖6)，從而使O2變大。

表2 水凝膠和肺的氧氣擴散性能

肺泡的O2通常采用CO彌散來表征，文獻報道的肺彌散系數(shù)co約為6.76 mL×(min×mmHg×L)-1，其含義為：單位肺容量下，單位時間、單位氣體分壓下通過彌散膜的氣體體積[40-41]?；趩蝹€肺泡是直徑為0.2 mm的球的假設(shè)、且血液溶解氧過程符合亨利定律，可計算得到肺泡的O2約為0.56′10-3cm2×min-1?？梢?，F(xiàn)127-DA和Gel-MA/F127-DA (1/1)共聚水凝膠的O2與肺泡的接近，說明此類水凝膠是良好的肺基質(zhì)替代材料。

4 結(jié) 論

以開孔的PET膜為支撐，制備Gel-MA/F127-DA共聚水凝膠薄膜，其平均厚度可達35 μm，并具有多孔結(jié)構(gòu)。該水凝膠薄膜具有良好的力學(xué)性能，其楊氏模量為13.55 kPa，抗張強度為7.73 kPa，斷裂延伸率為57.05%；其對HUVEC和HPAEpiC細胞具有良好的相容性，且氧氣傳遞性能良好，O2為1.40′10-3cm2×min-1。該水凝膠薄膜的各項性能均較為接近肺泡，為微流控肺芯片的仿生化構(gòu)建提供了新的解決方案。

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Preparation and properties of hydrogel film for microfluidic lung-on-chips

YANG Hui-ming, SHEN Chong, MENG Qin

(College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

The microfluidic lung-on-a-chip is a device for three-dimensional culture of lung cells. Its core component is a layer of polydimethylsiloxane (PDMS) porous film with high hardness, strong hydrophobicity and poor cytocompatibility. In order to better mimic alveoli, a hydrogel film based on methacrylylated gelatin (Gel-MA) and acrylated polyether F127 (F127-DA) was prepared to replace PDMS for construction of lung-on-chips. The results show that Gel-MA and F127-DA solutions of equal volume ratio are used to form a liquid film in the round holes of the polyethylene terephthalate (PET) film by surface tension, and the hydrogel film can then be prepared by UV-initiated copolymerization with average thickness of about 35 μm and porous three-dimensional network structure. The Young's modulus of this hydrogel is 13.55 kPa, the elongation at break is 57.05%, and the mechanical properties can meet the needs of constructing lung-on-chips. In addition, the hydrogel film has good cytocompatibility with HUVEC and HPAEpiC cells. Meanwhile, oxygen diffusion coefficient of the hydrogel is 1.40′10-3cm2×min-1, which indicates good oxygen transmission performance. The properties of this hydrogel film are close to those of alveoli, and it can be used to construct new microfluidic lung-on-chips with physiology in consideration.

lung-on-chips; hydrogel film; mechanical property; cytocompatibility; oxygen transfer capability

1003-9015(2022)06-0886-08

TQ050.4

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.06.014

2021-11-09；

2022-03-14。

國家自然科學(xué)基金(21978257)。

楊慧明(1996-)，男，河南新鄉(xiāng)人，浙江大學(xué)碩士生。

孟琴，E-mail：mengq@zju.edu.cn

楊慧明, 沈沖, 孟琴. 面向微流控肺芯片的水凝膠薄膜制備及其性能研究[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報, 2022, 36(6): 886-893.

：YANG Hui-ming, SHEN Chong, MENG Qin. Preparation and properties of hydrogel film for microfluidic lung-on-chips [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2022, 36(2): 886-893.