王炳熙，趙浩東，陳金龍

(中國藥科大學 藥學院，江蘇 南京 210009)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)導致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在2019年12月開始在全球爆發(fā)并迅速蔓延，2020年3月11日世界衛(wèi)生組織(WTO)正式宣布COVID-19疫情已構成全球大流行[1]。截至2021年1月12日，中國確診患者已累計9萬余例，全球確診已超過8 900萬例，死亡人數(shù)接近200萬，疫情已影響全球220多個國家和地區(qū)[1]，對全人類的生命健康造成了極大威脅。

SARS-CoV-2與重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)同屬β冠狀病毒，但SARS-CoV-2更具傳染性[2]。SARS-CoV-2在氣溶膠、冷凍食物表面仍可存活數(shù)小時至數(shù)天，因此，可通過呼吸道飛沫、氣溶膠、直接或間接接觸、糞口傳播或者冷鏈運輸?shù)韧緩?，實現(xiàn)物傳人、動物傳人和人傳人，繼而在全球范圍內廣泛傳播[3-7]。Guan等[8]研究指出：COVID-19的潛伏期一般為1～14 d，中位潛伏期為3 d，極少數(shù)患者的潛伏期最長可達24 d。處于潛伏期的患者通常沒有明顯的癥狀，但已具備傳染性。COVID-19患者的臨床癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽、乏力、肌痛、腹瀉及并發(fā)多器官衰竭[9-12]。目前，尚無特效藥可用于治療COVID-19，瑞德西韋、氯喹、羥氯喹、利托那韋/洛匹那韋和干擾素-β等西藥已被證實對SARS-CoV-2感染具有一定的療效[13-14]；中醫(yī)藥是我國特有的衛(wèi)生資源，對COVID-19患者進行早期干預，可有效緩解病情的發(fā)展，中西醫(yī)結合治療則可達到相輔相成、雙管齊下的效果[15]。顯然，阻斷COVID-19最有潛力的方法是開發(fā)疫苗，目前中國的新冠疫苗已上市，并在國內外被推廣使用，其安全性和有效性日益得到多國衛(wèi)生部門和專業(yè)人士的認可[16]。此外，值得強調的是，開發(fā)準確、快速的COVID-19檢測手段在整個疫情防控過程中同樣具有重要意義，不僅有利于早發(fā)現(xiàn)、早隔離潛在的COVID-19患者，也可用于預后效果的評估。筆者簡要介紹SARS-CoV-2的病原學特征，并回顧國內外對COVID-19檢測技術的研究與應用進展，以期為COVID-19的早期確診與防控提供幫助。

1 SARS-CoV-2的病原學特征

SARS-CoV-2是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，每個SARS-CoV-2粒子直徑為60～140 nm，與分別在2002和2012年引起流行病的SARS-CoV和MERS-CoV同屬β冠狀病毒[2，17]。復旦大學張永振教授及其團隊在疫情初期，利用基因測序技術確定了SARS-CoV-2的基因組序列，全長為29 903 bp(GenBank序列號為MN908947)[18]。經基因比對后發(fā)現(xiàn)：SARS-CoV-2與SARS-CoV相似度高達79.6%，與MERS-CoV的相似度僅有40%，重要的是，SARS-CoV-2與一種寄生于蝙蝠中的冠狀病毒的序列一致性高達96%[19-20]。

與其他冠狀病毒相似，SARS-CoV-2主要包括4種結構蛋白，即：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)[21]，詳見圖1。S蛋白與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶2(ACE2)結合，以促進膜的融合，其他3種蛋白則在病毒的組裝過程中起著關鍵作用[22]。ACE2在肺部、心臟、腎臟、睪丸、肝臟和腦等器官中分布廣泛，其中，肺部是病毒主要的靶器官，因此，COVID-19患者常表現(xiàn)出一些與肺部感染相關的常見癥狀，例如：發(fā)燒、咳嗽、咳痰、疲勞、呼吸急促、喉嚨疼痛或頭痛。在嚴重情況下，還會引發(fā)肺炎、嚴重的急性呼吸道綜合征、腎衰竭和死亡[9-12]。雖然SARS-CoV-2的致死率不及SARS-CoV，但其對ACE2的結合親和力明顯強于SARS-CoV[23]，因此，SARS-CoV-2具有更強的傳播性。除了可以根據胸部CT和病毒分離培養(yǎng)的手段確診COVID-19外，病毒RNA和蛋白質(如S蛋白、N蛋白等)亦可作為對COVID-19檢測的靶標[9]。此外，也可以通過患者免疫應答所產生的IgM、IgG等抗體來了解患者的感染史[9]。截至2021年1月12日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準用于檢測SARS-CoV-2的試劑共54個(表1)，主要涉及核酸檢測、抗體檢測和抗原檢測。此外，國內外研究人員為了能更便捷、快速檢測SARS-CoV-2，已開發(fā)出多種新型生物傳感器，但目前這些技術仍處于實驗室研究階段，還未能得到廣泛使用。

圖1 SARS-CoV-2的結構以及COVID-19檢測的潛在相關靶向位點[21]Fig.1 The structure of SARS-CoV-2 and related targeting sites that can be used for the COVID-19 detection[21]

表1 國家藥品監(jiān)督管理局批準的SARS-CoV-2檢測試劑注冊信息

2 分子生物學檢測

2.1 核酸檢測

SARS-CoV-2的RNA在患者出現(xiàn)癥狀前的2～3 d即可被檢測到，且根據患者感染的嚴重程度，可在發(fā)病后仍存留25～50 d[24]。因此，以核酸為基礎的病毒檢測手段在疫情防控中發(fā)揮著重要作用，尤其是在無癥狀患者的確診和康復患者的出院評判方面。

2.1.1 熒光定量PCR(qRT-PCR)技術

目前qRT-PCR已逐漸成為診斷是否感染SARS-CoV-2的金標準[25]。qRT-PCR是一種基因擴增技術，首先，將目標RNA(在COVID-19檢測中為SARS-CoV-2 RNA)逆轉錄為互補DNA(cDNA)，然后設計引物和熒光猝滅探針進行特異性擴增，從而獲得有關SARS-CoV-2存在的定量結果[26-27]。該方法具有可靠性好、特異性強、自動化程度高以及能有效解決PCR產物污染問題等特點。目前，由不同制造商開發(fā)的17種基于qRT-PCR的COVID-19試劑盒已獲得國家藥監(jiān)局的批準，檢測靶標涉及ORF1ab、N、E和S等基因[28-29]。Haddar等[30]對用于SARS-CoV-2 RNA檢測的幾種商業(yè)qRT-PCR試劑盒的分析性能進行了評估。研究結果表明：雖然循環(huán)數(shù)閾(Ct)的差異比較分散，但試劑盒之間的結果相似，符合率達到95%以上，可以滿足臨床對SARS-CoV-2的常規(guī)診斷。

然而，基于qRT-PCR的檢測方法同樣面臨著一些困難，例如：耗時費力的擴增過程、需要特殊的熱循環(huán)設備以及需要專業(yè)的技術人員在特定的實驗室內進行操作，這些都限制了該方法在現(xiàn)場篩查和低資源地區(qū)的使用[31]。此外，由于SARS-CoV-2 RNA容易變異以及樣本采集、保存和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩氐母蓴_，qRT-PCR的檢測可能存在較高的假陰性率，檢出率僅為30%～50%[32]。因此往往需要重新采集患者的樣本，更換采樣部位或者收集多個部位的樣本進行混樣檢測或同時檢測，從而避免假陰性檢測結果的干擾。

2.1.2 等溫擴增技術

等溫擴增技術是一類在恒溫條件下的核酸擴增技術，能有效克服反轉錄·聚合酶鏈反應(RT-PCR)所需要的復雜熱循環(huán)設備方面的不足。筆者主要介紹環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、重組酶聚合酶擴增技術(RPA)、恒溫擴增芯片和基于CRISPR/Cas酶的檢測技術在COVID-19檢測中的應用。目前，國家藥品監(jiān)督管理局已批準了5個等溫擴增類SARS-CoV-2核酸檢測試劑。

2.1.2.1 LAMP

LAMP在2000年由Notomi[33]首次提出，是一種不依賴任何專門的儀器設備，即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測的技術，其檢測成本遠低于qRT-PCR，可以在60～65 ℃、15～60 min內實現(xiàn)109～1010倍的恒溫核酸擴增。LAMP的最大亮點在于檢測結果的可視化。在DNA擴增過程中，大量的焦磷酸從脫氧核糖核酸三磷酸(dNTPs)中被釋放出來，與反應液中的Mg2+反應，產生大量的白色焦磷酸鎂沉淀，其渾濁程度可作為檢測指標，肉眼即能進行判斷[34]。Tomita等[35]通過使用一種鈣黃綠素熒光復合物，在焦磷酸鎂存在的情況下，發(fā)出明亮熒光來改善終點檢測的效果。此外，擴增過程中溶液的pH也發(fā)生了明顯變化，因此，也可通過對pH敏感的染料進行可視化檢測[36]。通過對76例疑似COVID-19患者的鼻咽拭子樣本進行逆轉錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)測試，以評估其臨床效果，結果表明：該方法的靈敏度與qRT-PCR相當，特異性為97.6%[37]。但開發(fā)RT-LAMP技術的挑戰(zhàn)在于反應條件(如：時間、溫度等)的優(yōu)化和引物的設計，由于存在病毒引物結合區(qū)突變的影響，在設計引物時，需注意避開這些突變位點，以提高檢測率[29-38]。成都博奧晶芯生物科技有限公司聯(lián)合清華大學、四川大學華西醫(yī)學院將LAMP與微流控芯片技術相結合，設計開發(fā)出了一款包括檢測SARS-CoV-2在內的“6項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒”，該試劑盒于2020年3月26日獲國家藥品監(jiān)督管理局批準上市，可在1.5 h內對SARS-CoV-2，A、B型流感以及現(xiàn)存的其他病毒進行區(qū)分。最近，Lau等[39]在傳統(tǒng)的RT-LAMP 4個引物的基礎上，再加入2個群體引物，以提高反應效率，以羥基萘酚藍(HNB)的顏色變化來檢測LAMP的擴增產物，該設計將RT-LAMP的反應時間縮短至24 min，檢出限僅為1個拷貝數(shù)(copy)，因此，該技術對低病毒載量感染的檢測具有重要意義。

2.1.2.2 RPA

RPA將重組蛋白與DNA聚合酶結合使用，在37～42 ℃恒溫范圍內，能快速擴增目標DNA或RNA，所需時間少于30 min，且可支持對樣品進行多重化的定量分析[40]。RPA試劑以凍干形式保存，便于貯藏和運輸，檢測過程無需任何儀器，是一種非常有前途，可用于現(xiàn)場診斷的等溫核酸檢測方法。Amer等[41]已經證明了RPA可被應用于其他冠狀病毒的檢測，例如牛冠狀病毒(BCoV)。目前，已開發(fā)出不少基于逆轉錄重組酶聚合酶常溫擴增(RT-RPA)的檢測手段，用于快速診斷是否感染SARS-CoV-2。例如Behrmann等[42]在exo探針設計原理的基礎上進行改進，提出內部猝滅(exo-IQ)探針原理，消除了exo探針只能用于序列之間2～5 nt內且必須包含2個胸腺嘧啶的限制。所提出的RPA外顯子探針是長度至少為46 nt的寡核苷酸，其內部結構由熒光基團和猝滅基團組成，并由一個嘌呤/嘧啶(AP)位點隔開[42]。一旦探針與其靶序列雜交，核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的AP核酸內切酶活性就會切割AP位點，從而導致熒光基團和猝滅基團在空間上的分離，使得熒光強度隨之增加，熒光強度增加的程度則與RPA產物的量直接相關[42]。該方法的運行時間為15～20 min，對于高病毒濃度的RNA樣品，在7 min內即可獲得結果，是迄今為止最快速的，基于核酸檢測的檢測COVID-19的方法之一[42]。

2.1.2.3 基于成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關蛋白(CRISPR/Cas)系統(tǒng)的檢測技術

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因檢測技術是用于SARS-CoV-2 RNA檢測的，另一項先進的分子診斷技術，較為經典的是張鋒團隊于2017年開發(fā)的，基于CRISPR/Cas13a與PRA擴增耦聯(lián)的SHERLOCK技術[43]，該技術已被應用于SARS-CoV-2的檢測[44]，其原理是：Cas13a在crRNA引導下，識別SARS-CoV-2的S基因和ORF1ab基因后，會被激活出附帶的、對非特異性dsRNA酶的切割活性，因此能夠切割RNA報告分子，導致熒光基團與猝滅基團分離，并釋放出熒光信號[43]。為了能更便捷、直觀讀取檢測結果，該團隊將結果呈現(xiàn)形式改進為試紙條式，檢測過程無需其他設備，1 h內即可定性判斷是否感染病毒[43]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已對該技術頒布了緊急使用許可。

Chen等[45]研究發(fā)現(xiàn)：Cas12酶在crRNA的引導下，與目標序列結合后，同樣可被激活出非特異性的切割活性，與Cas13不同的是，Cas12識別的是DNA而不是RNA，因此無需將擴增的DNA產物轉錄為RNA，該技術被命名為DETECTR。Broughton等[46]重新配置了DETECTR平臺，使其適用于SARS-CoV-2的檢測，可在40 min內得到檢測結果。該團隊通過RT-LAMP擴增病毒RNA，然后打開測試管加入CRISPR/Cas12試劑，最后通過將側流條插入試管中來讀取檢測結果。然而，將核酸擴增和Cas檢測過程分開成2個獨立步驟的操作，不僅使測試過程復雜化，還會造成潛在的交叉污染，因此，Chen等[47]將Cas12酶預先置于測試管蓋的內壁上，并加入礦物油覆蓋RT-LAMP試劑，以防止反應溶液揮發(fā)或擴增子擴散，待擴增結束后，通過搖晃的方式使Cas12酶與擴增子反應液充分混合，而不是重新打開測試管添加CRISPR/Cas酶試劑。Ding等[48]則進一步提出了一種多合一雙重CRISPR-Cas12a(AIOD-CRISPR)的檢測技術，利用2個單獨的crRNA生成一對Cas12a-crRNA，該方法的亮點在于：將核酸擴增和對Cas12a酶檢測的所需組分全部混合在同一個反應器中，只需在單一溫度(37 ℃)中進行孵育(圖2)。因此，一個低成本的暖手器也可被用作AIOD-CRISPR分析的孵化器，其檢測過程僅為20 min，可檢測低至5個copies的病毒N基因RNA[48]。

圖2 AIOD-CRISPR分析系統(tǒng)的工作示意[48]Fig.2 Schematic work of the AIOD-CRISPR assay system[48]

該方法已通過測試28個COVID-19臨床拭子樣本得到驗證，與RT-PCR測定的結果相一致。目前，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術還處于新興階段，雖然已開發(fā)的方法無法實現(xiàn)定量分析，但其為開發(fā)低成本、快速準確的即時診斷方法開辟了未來可能的途徑。

2.2 高通量測序(NGS)

NGS又名下一代測序，通過對疑似樣本中所有核酸或來自特定靶標的核酸進行測序和分析，從而獲得樣本中所有病原微生物或其靶標序列[49]。利用該技術可在第一時間獲取未知病毒的基因組序列信息，有利于對病毒的鑒定、溯源和診斷，為突發(fā)疫情的防控和后續(xù)研究提供幫助。在本次疫情初期，除了復旦大學張永振教授聯(lián)合悉尼大學Edward Holmes教授對患者的支氣管肺泡灌洗液(肺分泌物)進行轉錄組測序，獲得了SARS-CoV-2的全基因組序列，并將該測序結果發(fā)布于病毒學網站(virological.org)，系全球最早公布該病毒序列的團隊以外[18]；Zhou等[50]、Lu等[51]所在的研究團隊也通過宏基因測序和納米孔靶向測序(NTS)等技術對SARS-CoV-2感染者的全長基因組進行了分析。目前病例確診方式之一就是：“病毒基因測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源”[17]。NGS的優(yōu)勢在于高通量、高靈敏度和高準確性，但其檢測成本較高、檢測時間較長、需要專業(yè)人員對測序結果進行解讀，因而不能被廣泛應用。針對RT-PCR核酸檢測的陰性結果，但臨床表型高度疑似的患者，可利用NGS進一步確認[52]。為了提高臨床實用性，武漢大學劉天罡教授等組建的聯(lián)合團隊開發(fā)出NTS測序平臺(MinLON)，是目前最小的便捷式測序儀[53]。MinlON可全面覆蓋病毒基因組上主要的基因區(qū)域，在6～10 h內能同時檢測SARS-CoV-2在內的多種常見呼吸道病毒，并監(jiān)測病毒的突變[53]。

3 免疫學檢測

3.1 抗體檢測

SARS-CoV-2侵入人體后，人體會產生相應的特異性抗體進行防御[54]。通常情況下，IgM抗體會在機體發(fā)生初次免疫應答時產生，而多在癥狀發(fā)作后的3～5 d出現(xiàn)表征，并于2周左右達到峰值。IgM抗體維持時間短、濃度低并且親和力較低，當其接近消失時，IgG的含量達到高峰。IgG產生時間晚，但維持時間長、濃度和親和力均顯著高于IgM[54-56]。目前將血清抗體的檢測作為確診SARS-CoV-2的依據之一，即將血清SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體呈陽性；血清SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉陽性；恢復期較急性期血清濃度升高至4倍以上作為評判標準[17]。目前，國家藥品監(jiān)督管理局已批準了26個抗體檢測試劑盒，檢測目標均為IgM/IgG，檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、膠體金免疫層析法(GIGA)和化學發(fā)光免疫分析法(CILA)等。

3.1.1 ELISA

ELISA是一種將抗原-抗體特異性反應和酶對底物高效催化作用相結合的，高敏感性免疫學實驗技術[57]。原理是將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，與加入的受檢樣品中的抗原或抗體形成特異性的抗原-抗體復合物，再與之后加入的被酶標記過的抗原或抗體在固相載體上形成三元復合物，最后加入酶，反應底物繼而發(fā)生顯色[58]。利用病毒重組S蛋白、Rp3 N蛋白等作為ELISA包被抗原的方法已被證明具有良好的準確性和選擇性[59-60]。通常情況下，ELISA需要通過比色法或分光光度計來進行定性或半定量分析，存在過程繁瑣、檢測速度慢等方面的不足。近期，Kasetsirikul等[61]提出了一種簡單且廉價的，基于比色紙的ELISA檢測方法，由于紙基質的高表面體積比，每次僅需幾微升的人血清即可完成，將1～2 h的常規(guī)ELISA操作時間縮短到30 min以內，可檢測到每微升10 ng(0.124 μ/mL)的SARS-CoV-2人源抗體。

3.1.2 GICA

GICA是以膠體金作為示蹤標志物，應用于抗原抗體檢測的一種免疫標記技術，該方法無需對樣品進行特殊處理，僅需一滴血即可在15 min內通過肉眼進行觀察，從而獲得檢測結果[62]。Wang等[63]將膠體金標記的病毒N蛋白和兔IgG抗體固定于結合墊，檢測線處同時固定抗人IgM和IgG抗體，質控線處則固定抗兔IgG抗體。10 μL人血清樣品從加樣處隨緩沖液向試紙另一端移動，樣品中的待測抗體與結合墊上膠體金標記的N蛋白結合，形成抗原抗體復合物，隨后該復合物被檢測線上的抗人IgM和IgG抗體捕獲而顯色[63]。若待測樣品中不含待測抗體，則只有質控線處顯色，該課題組在上述試劑盒的基礎上，將抗IgM和抗IgG抗體分為2條檢測線(圖3)，在一定程度上提升了檢測的靈敏度。但由于樣本量太小，該方法得到初步結果的靈敏度和特異性可能被高估。

圖3 膠體金免疫層析法同時檢測IgM/IgG的試劑盒工作示意[63]Fig.3 Schematic work of the detection kit for IgM/IgG by GICA[63]

3.1.3 CILA

CILA是將高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，磁微?；瘜W發(fā)光法則是引入納米磁微粒作為固定載體，以捕獲待測樣本中的IgM/IgG抗體[64-65]。這是一種比較先進的免疫檢測技術，其自動化程度高，相比ELISA和GICA，CILA具有更高的靈敏度和特異性[66-68]，但其需依賴大型儀器設備、成本更高、不適用于大規(guī)模的篩查[69]。

與分子生物學檢測相比，抗體檢測能以較低的成本提供更快的結果，更適合于即時檢測。臨床評估結果表明：ELISA、GICA和CILA這3種抗體檢測手段被應用于COVID-19患者的診斷時，均具有良好的靈敏度和特異性[70-71]，但由于SARS-CoV-2進入機體后，需經過一定時間的潛伏期才會產生IgM與IgG抗體，這種滯后性容易導致較差的敏感性，因此，抗體檢測并不能替代RT-PCR對COVID-19的早期診斷[71]。此外，抗體檢測還存在一些干擾因素，例如：SARS-CoV-2與其他微生物支原體、病毒(尤其是其他冠狀病毒)等之間的交叉反應性、用藥情況、血液中的非特異性IgM、類風濕因子以及溶血所致的高濃度血紅蛋白等[72-75]，這些因素均會造成假陽性結果的出現(xiàn)?；谝陨显?，抗體檢測尚不宜作為判斷是否感染COVID-19的唯一依據，其更適合在核酸檢測陰性時作為輔助手段，為醫(yī)生提供重要的免疫學依據或用于評價疫苗的功能和接種效果。

3.2 抗原檢測

由于機體產生抗病毒的抗體存在滯后性，抗體檢測不能適用于人群篩查和感染初期的診斷，因此，開發(fā)用于病毒抗原的檢測方法對于遏制疾病大流行具有重要意義。FDA已于美國時間2020年5月11日發(fā)布了首個COVID-19抗原檢測試劑Sofia 2 SARS Antigen FIA的緊急使用授權(EUA)通知[76]。我國藥品監(jiān)督管理局則于2020年11月3日首次審批通過了2個抗原檢測試劑盒，分別為北京金沃夫生物工程科技有限公司開發(fā)的新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗原檢測試劑盒(乳膠法)和廣州萬孚生物技術股份有限公司開發(fā)的新型冠狀病毒(2019-nCoV)抗原檢測試劑盒(膠體金法)[77]。乳膠法的原理是抗體或抗原致敏乳膠微球形成免疫乳膠，與相應的抗原或抗體產生特異性的凝聚反應，以檢測響應抗原或抗體的存在[78]。膠體金抗原檢測的原理則類似于膠體金抗體檢測法，不同之處在于抗原檢測是將能夠結合待測抗原的抗體分別固定于免疫層析檢測試紙條的檢測線與結合墊上，其中結合墊上的抗體被膠體金所標記，質控線則固定的是二抗[79]。已有研究人員對國際上已獲批的抗原檢測試劑盒的測試效果進行了評估[80-81]，結果顯示：大多數(shù)抗原檢測試劑盒的效果不如“金標準”qRT-PCR，不建議將其作為是否感染SARS-CoV-2的一線測試試劑，主要原因是抗原檢測不能像PCR一樣對病毒抗原進行成倍擴增，在病毒載量低的情況下容易出現(xiàn)假陰性結果。而我國剛獲批的2種抗原試劑盒的效果還有待更深入的臨床評估。

Dai等[82]利用生物信息學和免疫信息學方法，預測了病毒N蛋白的潛在免疫優(yōu)勢區(qū)域?；诖蠖鄶?shù)流感病毒的N蛋白序列與SARS-CoV-2相似性較低，通過直接檢測N蛋白可以區(qū)分COVID-19和流感病毒感染。此外，考慮到SARS-CoV-2的全長N蛋白可能會與病毒感染患者的血清發(fā)生交叉反應[83]，選用短的重組蛋白來開發(fā)診斷抗體，在保證免疫敏感性的前提下，可以降低交叉反應的發(fā)生。Lin等[84]開發(fā)了一種微流控集成快速檢測分析平臺(圖4)，在15 min內可以同時檢測SARS-CoV-2的IgG、IgM和抗原3種生物標志物。該微流控免疫分析平臺具有集成且便捷的特點，有望被應用于COVID-19的即時檢測。目前，該方法已獲得中國醫(yī)療器械評估中心(CMDE)的批準和歐洲Conformite Europeenne(CE)的認證[84]。與實際應用中與其他對COVID-19的檢測方法相比，抗原檢測手段的主要顯著性優(yōu)勢在于：無需復雜儀器和專業(yè)人員的操作，成本低廉并且可以進行即時檢測。一旦研究出有效的抗體，抗原檢測容易實現(xiàn)批量生產，因此，抗原檢測具有廣闊的發(fā)展空間和實用價值。

圖4 SARS-CoV-2的IgG/IgM/抗原熒光免疫微流控檢測平臺工作示意[84]Fig.4 Schematic illustration of the microfluidic immunoassays for IgG/IgM/antigen detection of SARS-CoV-2[84]

4 新型生物傳感器

4.1 基于局域表面等離子共振(LSPR)的生物傳感器

LSPR是一種光現(xiàn)象，當光線的入射光子頻率與導電納米粒子的整體振動頻率相匹配時，光譜上會出現(xiàn)一個強共振吸收峰[85]。最近，Moitra等[86]針對SARS-CoV-2的N基因設計了一種特異性巰基修飾的，反義寡核苷酸所覆蓋的金納米顆粒(AuNPs)，該AuNPs僅在SARS-CoV-2存在時會發(fā)生聚集，并顯示出表面等離子共振的變化，核糖酶核酸酶H(RNase H)的添加進一步促進了AuNPs的團聚，在10 min內即可從視覺上觀察到沉淀，因此，可由此判斷是否感染SARS-CoV-2，其檢測限為0.18 ng/mol。

Qiu等[87]將等離子光熱效應與LSPR結合，構建了一種雙功能等離子生物傳感器，互補DNA功能化的二維金納米島(AuNIs)。通過核酸雜交對SARS-CoV-2的特定序列進行高靈敏檢測。當以等離子共振頻率照射時，AuNIs表面產生的等離子熱能能提供穩(wěn)定的熱源，以增強SARS-CoV-2與互補DNA的相互作用，從而提高靈敏度和選擇性，檢測限低至0.22 pmol/L，該生物傳感器出色的傳感性能允許其在多基因混合物中準確測定出特定的靶標物。

4.2 基于場效應晶體管(FET)的生物傳感器

FET的生物傳感器因具有免標記、靈敏度高和易于集成等優(yōu)勢，引起了眾多研究人員的關注。Seo等[88]開發(fā)了一種用抗病毒S蛋白的，具有特異性抗體覆蓋的石墨烯FET(圖5)，當S蛋白與石墨烯表面的抗體結合時，石墨烯FET的電導/電阻可以發(fā)生改變，從而能夠獲得檢測結果。該FET設備的檢測限因樣品而異：磷酸鹽緩沖液和臨床運輸介質中的病毒S蛋白檢測質量濃度分別為每毫升1和100 fg時，培養(yǎng)基和鼻咽拭子樣本的病毒檢測限分別為每毫升1.6×10 PFU和2.42×102copies[88]。該傳感平臺的優(yōu)點是樣品不需要進行預處理，且具有區(qū)分SARS-CoV-2和MERS-CoV抗原的能力。

圖5 COVID-19 FET傳感器操作程序的示意[88]Fig.5 Schematic procedure of COVID-19 FET sensor operation[88]

4.3 基于電化學的生物傳感器

電化學生物傳感器通過電勢、電流、離子濃度、電導率、電容或阻抗的變化程度來反映目標檢測物的含量[89]。Fabiani等[90]開發(fā)了一種電化學免疫測定法，以磁珠作為固定載體， 堿性磷酸酶作為免疫標記的二抗，使用碳黑納米材料修飾的絲網印刷電極檢測酶促產物1-萘酚，可快速、智能的檢測唾液中的病毒S或N蛋白。該方法使用的樣品無需進行預處理，S和N蛋白的檢測限分別為每毫升19和8 ng，儀器的小型化和便捷性，使其有潛力作為第一個無創(chuàng)且高靈敏進行唾液檢測SARS-CoV-2的電化學免疫分析方法[90]。Alafeef等[91]創(chuàng)新性地將金納米顆粒與石墨烯結合，設計了一種紙基電化學傳感芯片。其中，金納米顆粒用針對病毒N蛋白的特異性硫醇修飾的單鏈DNA(ssDNA)進行封端，將其沉積于石墨烯導電膜上，以形成傳感探針，進一步被固定于基于紙張的電化學平臺上，可在5 min內檢測樣品量低至每毫升6.9 copies，該設備的讀數(shù)還可通過智能設備實時讀取[91]。這一方法的巧妙之處在于設計了4種可同時靶向于病毒N基因的2個獨立區(qū)域的ssDNA，具有良好的靈敏度和特異性，能夠準確地將COVID-19陽性樣品與陰性樣品或其他冠狀病毒樣品進行區(qū)分，因此，即使病毒的基因組發(fā)生突變，該傳感器仍具有可行性。

4.4 基于熱致液晶(LCs)的生物傳感器

某種能形成液晶的固體經加熱轉變成為既有雙折射性，又有流動性的液晶態(tài)，被稱為LCs[92]。當LC膜或液滴在其界面上吸附一些分子時，會發(fā)生取向性的變化，例如：ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)，使負載陽離子表面活性劑的LC產生不同的取向，從而導致不同的光學外觀變化(如暗色/亮色的變化)[93-94]?；谠撛?，開發(fā)出了一種可裸眼檢測病毒ssRNA的，基于LC的便捷式診斷套件[92]。研究人員在LC表面覆蓋了陽離子表面活性劑DTAB和帶負電荷的單鏈探針核酸ssDNAprobe，此時LC呈傾斜或平行取向，且具有亮色的光學外觀[92]。當樣本中存在SARS-CoV-2時，病毒ssRNA與ssDNAprobe雜交，使ssDNAprobe與DTAB的靜電作用減弱，導致DTAB重新覆蓋于LC表面，LC可在20 min內完全恢復為垂直取向并呈現(xiàn)暗色[92]。實驗結果顯示：30 fM的病毒ssRNA即可觸發(fā)LC的有序變換，使用3個錯配的病毒ssRNA進行實驗時，該方法的靈敏度降低了7個數(shù)量級，說明該方法對病毒ssRNA表現(xiàn)出良好的選擇性。此外，研究人員利用偏光顯微鏡原理設計組裝出的便捷式診斷試劑盒，并開發(fā)出基于機器學習的自動化判讀手機App，為人們在家中就可以實現(xiàn)快速、可靠的診斷COVID-19提供了一條新思路。

5 總結與展望

SARS-CoV-2的迅速蔓延造成了全球范圍內的公共衛(wèi)生危機，給全球經濟帶來了巨大影響，對COVID-19的快速、準確診斷是疫情防控的關鍵環(huán)節(jié)。目前，qRT-PCR作為COVID-19最常用的確診方法和指標，可靠性良好、但對設備和操作人員的要求較高、過程相對繁瑣且假陰性現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)。特異性抗體檢測則可以有效輔助qRT-PCR，但存在滯后性的特點，不適用于對潛伏期患者的診斷。相比之下，抗原檢測更適用于即時檢測，但因為不能對病毒進行擴增，其靈敏度和準確性容易受限。最近，國內外研究人員開發(fā)出的多種新型的生物傳感器，其靈敏度、特異性和便捷性等方面因各有優(yōu)勢，在即時檢測中具有很大的潛力。筆者認為對SARS-CoV-2的檢測技術需要綜合考慮以下幾個關鍵因素：

1)準確性和靈敏度。對人群進行準確篩查是疫情防控的首要步驟，而隨著時間推移，SARS-CoV-2基因組可能隨時發(fā)生變異，因此在開發(fā)檢測方法時，應做好篩選工作，避開突變位點或者設計多個靶點，以提高檢測方法的準確性和靈敏度。

2)檢測時間。對病毒的快速檢測可以提高篩查的效率，能更快確診感染患者并及時實施隔離和治療。

3)檢測成本和便捷性。降低檢測成本有利于在低資源環(huán)境下的疫情防控，開發(fā)基于智能手機或視覺化的先進傳感器則更適合于居家檢測。

4)穩(wěn)定性。不僅要求檢測方法具有穩(wěn)定性，其所需試劑也應具有穩(wěn)定性，即方便儲存和運輸。

5)安全性。開發(fā)檢測技術的本質目的在于助力疫情防控，要防止在檢測過程中樣品暴露所造成的潛在傳染危害。

相信隨著科學技術的不斷發(fā)展，更多新型、精準且快速的檢測技術也將會隨之出現(xiàn)，人類終將戰(zhàn)勝COVID-19疫情。