張靜 于慧玲 趙鵬偉 尹華夏 劉曉熙

作者單位：010000 呼和浩特 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

膠質(zhì)瘤是一種起源于腦或脊柱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，約占成年人常見(jiàn)惡性原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的75%[1]。盡管手術(shù)技術(shù)和輔助治療不斷發(fā)展，但高級(jí)別膠質(zhì)瘤的治療效果仍然較差，惡性原發(fā)性腦腫瘤目前仍是最難治療的惡性腫瘤之一，其5年總生存率低于35%[1-2]。因此，目前亟需探索更有效的治療策略以改善這類(lèi)患者的預(yù)后。近年來(lái)，中醫(yī)藥抗腫瘤治療取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。柴胡具有十分復(fù)雜的化學(xué)活性成份，以柴胡皂苷類(lèi)最具代表性，其主要包含柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d（saikosaponin d，Ssd）等單體成分。藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)柴胡皂苷d是柴胡皂苷提取物中藥理活性最強(qiáng)的單體[3]，其在抗腫瘤方面具有顯著的生物活性[4]。自噬與腫瘤的形成和發(fā)展緊密相關(guān)，目前已有研究顯示柴胡皂苷d能調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬[5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能有效促進(jìn)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[6]?；诖?，本研究進(jìn)一步觀察柴胡皂苷d能否誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞發(fā)生自噬并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。柴胡皂苷d購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（HPLC≥96.3%）。FBS、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。GAPDH、Beclin1、LC3A/B、mTOR、p-mTOR抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。AKT、p-AKT抗體均購(gòu)自武漢三鷹技術(shù)有限公司。GAPDH、LC3、Beclin1、AKT、mTOR引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液、CCK-8試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。0.1%結(jié)晶紫染料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞用含有10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代處理。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，以4×103/孔接種于96孔板中，待培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別加入含柴胡皂苷d的終濃度為0 μmol/L（Control組）、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L 的 100 μL完全培養(yǎng)基并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。然后按照每100 μL加入10 μL的CCK-8試劑依次加入96孔板中，培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。細(xì)胞抑制率（%）=[（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%，未經(jīng)柴胡皂苷d處理的細(xì)胞抑制率設(shè)定為0。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配制成1×104/mL的細(xì)胞懸液，按1∶20比例稀釋至500/mL后接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁后，分別加入含柴胡皂苷d終濃度為0 μmol/L、8 μmol/L的2 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1周。待細(xì)胞形成明顯集落（細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)）后用0.1%結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，以5×105/孔接種到6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%后進(jìn)行劃痕，用1 mL無(wú)菌槍頭垂直于孔板底部劃1～3條直線，分別加入含柴胡皂苷d終濃度為0 μmol/L、8 μmol/L的2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后拍照，用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞的遷移距離。

1.2.5 Western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá) 膠質(zhì)瘤 C6細(xì)胞分別經(jīng)0 μmol/L、8 μmol/L柴胡皂苷d處理24 h后，按照試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA調(diào)整樣品濃度至統(tǒng)一上樣量，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水煮15 min后分裝保存于-80℃冰箱。取20 μg總蛋白并用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，在4℃條件下孵育一抗過(guò)夜。次日用TBST洗滌，二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌。用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，按A∶B=1∶1比例配置發(fā)光液并均勻滴加在NC膜上反應(yīng)5～10 s后，在凝膠成像系統(tǒng)上采集照片，并用Image J軟件計(jì)算灰度值。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中Beclin1、LC3、AKT和mTOR mRNA的表達(dá) 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞分別經(jīng)0 μmol/L、8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，后續(xù)進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)Beclin1、LC3、AKT和mTOR mRNA的表達(dá)水平。引物序列（5'-3'）：Beclin1上游為T(mén)CAAGATCCTGGACCGAGTGACC，下游為CTCCTCTCCTGAGTTAGCCTCTTCC；LC3上游為GCCTTCTTCCTCCTGGTGAAT，下游為T(mén)TTTTGCCTTGGTAGGGGCTT；AKT上游為CACAGGTCGCTACTATGCCATGAAG，下游為GCAGGACACGGTTCTCAGTAAGC；mTOR上游為CCTTCGTGCCTGTCTGATTCTTACC，下游為AACCTTTCTCTGCTTCTTCAAATGTGTG；GAPDH上游為CACTGAGCATCTCCCTCACAA，下游為T(mén)GGTATTCGAGAGAAGGGAGG。以GAPDH作為內(nèi)參，取Ct值后轉(zhuǎn)化為2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度柴胡皂苷d對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，與Control組相比，各濃度柴胡皂苷d均能抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖，且細(xì)胞的增殖抑制率隨著柴胡皂苷d藥物濃度的升高而升高（均P＜0.01）。其中12 h、24 h和48 h的IC50分別為8.4548 μmol/L，8.7748 μmol/L，8.3348 μmol/L，據(jù)此以8 μmol/L柴胡皂苷d為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，觀察時(shí)間點(diǎn)選擇24 h。

圖1 柴胡皂苷d抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖能力Fig.1 Saikosaponin d inhibited the proliferation ability of glioma C6 cells

2.2 柴胡皂苷d能抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的克隆形成能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，與Control組相比，8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的克隆形成數(shù)目顯著減少[（479.33±30.66）個(gè)vs（258.66±73.35）個(gè)，P＜0.01]，表明柴胡皂苷d能抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的克隆形成能力。

圖2 柴胡皂苷d抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞克隆形成能力Fig.2 Saikosaponin d inhibited the clone formation ability of glioma C6 cells

2.3 柴胡皂苷d能降低膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，與Control組相比，8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞遷移率顯著降低[（70.83±4.29）%vs（19.47±1.71）%，P＜0.001]，表明柴胡皂苷d能抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的遷移能力。

2.4 柴胡皂苷d能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞自噬的發(fā)生

Western blot檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，與Control組比較，8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的自噬相關(guān)因子Beclin1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.01）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，與Control組相比，8 μmol/L柴胡皂苷d作用24 h后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的自噬相關(guān)因子Beclin1、LC3的mRNA表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.01），表明柴胡皂苷d能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖3 柴胡皂苷d抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的遷移能力（100×）Fig.3 Saikosaponin d inhibited the migration ability of glioma C6 cells(100×)

圖4 柴胡皂苷d誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞發(fā)生自噬Fig.4 Saikosaponin d induced autophagy in glioma C6 cells

2.5 柴胡皂苷d能抑制AKT/mTOR信號(hào)通路

Western blot檢測(cè)結(jié)果（圖5A）顯示，與Control組相比，8 μmol/L柴胡皂苷d作用后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5B）顯示，與Control組相比，8 μmol/L柴胡皂苷d作用后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中AKT及mTOR的mRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05），說(shuō)明柴胡皂苷d可能通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞自噬發(fā)生。

圖5 柴胡皂苷d抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞AKT/mTOR通路Fig.5 Saikosaponin d inhibited glioma C6 cells AKT/mTOR pathway

3 討論

膠質(zhì)瘤是目前極難治療的腦部腫瘤之一，因其發(fā)病部位的特殊性，以及病灶與周?chē)＝M織邊界不清導(dǎo)致手術(shù)難以徹底根除，預(yù)后極差。隨著中藥學(xué)的不斷發(fā)展，中藥在預(yù)防腫瘤的發(fā)生及治療腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，中醫(yī)藥抗腫瘤的機(jī)制也成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究新熱點(diǎn)之一。

自噬是一種在進(jìn)化上古老且高度保守的分解代謝過(guò)程，包括從自噬體雙膜囊泡的形成，到吞噬細(xì)胞蛋白和細(xì)胞器以遞送到溶酶體，最終降解以供自身所需[7]。自噬過(guò)程受多種信號(hào)通路和自噬相關(guān)基因調(diào)控，包括起始、延伸、成熟和降解等連續(xù)過(guò)程。細(xì)胞在接受信號(hào)或刺激后，可啟動(dòng)VPS34（vacuolar protein sorting 34）與Beclin1結(jié)合形成吞噬泡，吞噬泡在自噬延伸階段與自噬相關(guān)因子（autophagy related gene，ATG）組裝對(duì)接，形成雙模結(jié)構(gòu)的自噬小體，自噬小體成熟后與溶酶體結(jié)合最終降解胞內(nèi)物質(zhì)。功能延伸是自噬發(fā)生的關(guān)鍵步驟，在此階段2個(gè)泛素化結(jié)合系統(tǒng)導(dǎo)致LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ存在于自噬體內(nèi)外膜上，并作為各種自噬接頭的錨，因此LC3-Ⅱ常作為檢測(cè)自噬的關(guān)鍵指標(biāo)[8]。既往的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，柴胡皂苷d具有抗腫瘤[5]、抗抑郁[9]、改善肝纖維化[10]等藥理作用。在結(jié)直腸癌研究中顯示，柴胡皂苷d能使人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中的LC3-Ⅱ表達(dá)含量增高，且LC3蛋白翻轉(zhuǎn)試驗(yàn)呈陽(yáng)性，在使用自噬抑制劑3-MA后負(fù)向調(diào)控柴胡皂苷d所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡皂苷d處理后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖能力和遷移能力顯著受到抑制，且自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯上升，說(shuō)明柴胡皂苷d能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

AKT/mTOR信號(hào)通路是經(jīng)典的負(fù)向調(diào)控自噬途徑，磷酸化的AKT可以激活mTOR從而抑制自噬發(fā)生，其中mTOR為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，因此通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[12-14]。既往研究報(bào)道，中藥扶正抑瘤湯可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌自噬發(fā)生并抑制其增殖[15]。在肝癌研究中也顯示柴胡皂苷d可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬發(fā)生，從而提升機(jī)體對(duì)腫瘤的抗性[16]。還有研究報(bào)道，柴胡皂苷d可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬從而增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性[17]。但目前鮮有研究報(bào)道柴胡皂苷d對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬影響的作用機(jī)制。本研究進(jìn)一步檢測(cè)經(jīng)柴胡皂苷d處理后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)水平均降低，再次說(shuō)明柴胡皂苷d能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬且可能是通過(guò)調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了柴胡皂苷d可能通過(guò)抑制AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞發(fā)生自噬，并抑制其增殖與遷移，這為膠質(zhì)瘤的靶向藥物治療提供了新的理論依據(jù)。