李慶岸，于海，曹鵬，康文哲

（遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110179）

現(xiàn)行的乙腦滅活疫苗多采用生物反應(yīng)器、細(xì)胞工廠或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)[1]。用生物反應(yīng)器進(jìn)行高密度微載體細(xì)胞培養(yǎng)乙腦滅活疫苗質(zhì)量較高，而且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)疫苗生產(chǎn)的工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化[2-3]。但根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020版）三部的規(guī)定，其細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量不得高于2 μg/mL，細(xì)胞DNA殘留量每劑應(yīng)小于100 pg[4]。一般采用濃縮至一定體積后密度梯度離心或凝膠過濾層析的方法進(jìn)行純化，能去除大量的分子差異較大的細(xì)胞蛋白[5]。但對(duì)于分子大小或聚集體接近病毒分子的雜質(zhì)，去除能力較差。因此，近年來(lái)研究人員聚焦于純化工藝的創(chuàng)新，已經(jīng)開發(fā)出一些現(xiàn)代化純化工藝，比如離子交換、疏水/親和層析方法等。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法（Design of Experiment，DOE）是一種基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)，可以用最少的實(shí)驗(yàn)確定關(guān)鍵性因素及其相互作用。本研究使用MODDE軟件中全因子分析方法摸索Sartobind Q膜層析的工藝條件，以篩選Sartobind Q膜層析的關(guān)鍵工藝參數(shù)，并初步確定工藝參數(shù)范圍

1 材料與方法

1.1 毒株及細(xì)胞

乙型腦炎毒種，P3株，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；Vero細(xì)胞，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC）。

1.2 儀器與試劑

Sartobind Q膜，德國(guó)Sartorius Stedim公司；AKTA pure 150層析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；Vero殘留DNA-154檢測(cè)試劑盒，湖州申科生物技術(shù)有限公司；300 kDa的膜包，美國(guó)Millipore公司。

1.3 病毒原液的制備

Vero細(xì)胞使用微載體Cytodex1在7.5 L生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)，獲得病毒收獲液。

1.4 病毒滅活

將病毒收獲液澄清后，經(jīng)過300 kDa膜包濃縮約20倍，按β-丙內(nèi)酯∶濃縮液=1∶4 000的體積比向病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯；將病毒濃縮液在2～8 ℃冷庫(kù)攪拌滅活24 h；滅活結(jié)束后，置于37 ℃下水解2 h，獲得病毒滅活液。

1.5 疫苗純化

將乙腦滅活液經(jīng)過Sepharose 6 FF層析，洗脫液為 PBS緩沖液（含 0.3～0.7 mol/L NaCl，pH7.5)，紫外280 nm下收集第一個(gè)吸收峰，即得乙腦病毒蛋白初步純化液（S0）。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)乙腦病毒蛋白初步純化液（S0）進(jìn)行Sartobind Q膜層析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示，采用4因素3水平全因子分析DOE模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，輸入因子為上樣量（40 mL 、70 mL 和 100 mL）、鹽濃度（0.3 mol/L、0.5 mol/L和 0.7 mol/L）、pH（6.0、7.0和 8.0）、流速（1.0 mL/min、10.5 mL/min和20.0 mL/min），輸出響應(yīng)值為抗原回收率、細(xì)胞殘留DNA去除率。本文所用Sartobind Q膜體積（CV）為1 mL，即上樣量為40～100 mL，流速為 1～20 mL/min。

表1 乙腦病毒蛋白初步純化液Sartobind Q膜層析DOE

1.7 中間產(chǎn)品成分檢測(cè)[4]

1.7.1 乙腦殘留DNA含量檢測(cè)

PCR-熒光探針法檢測(cè)Vero細(xì)胞宿主DNA。

1.7.2 乙腦滅活液、純化液抗原含量檢測(cè)

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020版）三部的方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)乙型腦炎病毒抗原進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用層析系統(tǒng)控制軟件自帶的數(shù)據(jù)處理功能模塊（賽多利斯MODDE?集成DOE軟件包），將檢測(cè)數(shù)據(jù)逐一輸入對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下，生成箱線圖及響應(yīng)曲面圖并進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)的抗原回收率及DNA去除率如表2所示。使用Sartobind Q膜層析的目的是將細(xì)胞殘留DNA從前一步純化液中捕獲出來(lái)。由于純化液一般成分較復(fù)雜，病毒蛋白中混有宿主細(xì)胞殘留蛋白、人血白蛋白和牛血清殘留成分等，且樣品體積較大，因此對(duì)于收率的要求為＞90%，細(xì)胞殘留DNA的去除率＞90%。從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi)，獲得的產(chǎn)品純度無(wú)顯著差異，抗原回收率為100%，DNA去除率均在90%以上，滿足Sartobind Q膜層析設(shè)計(jì)的要求。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 輸入因子與輸出變量箱線圖分析

圖1為影響DNA去除率的因素箱線圖。由圖1可知，對(duì)于細(xì)胞殘留DNA去除率，鹽濃度是顯著影響因子，鹽濃度越接近0.3 mol/L，去除率越高，且上樣量、鹽濃度、pH、流速兩兩之間沒有明顯的交互作用；根據(jù)實(shí)驗(yàn)室多次測(cè)定結(jié)果，對(duì)于抗原回收率來(lái)說，上樣量、鹽濃度、pH、流速無(wú)顯著影響，抗原回收率均達(dá)到90%以上（所用方法為半定量，數(shù)據(jù)未展示）。

圖1 影響DNA去除率的因素箱線圖

2.3 響應(yīng)曲面分析

從圖2中可以看出，對(duì)于DNA去除率，鹽濃度在0.3～0.7 mol/L、上樣量40～100 倍膜體積范圍內(nèi)，宿主細(xì)胞DNA去除率在90%以上，鹽濃度越趨向于0.3 mol/L，去除率越高，可以達(dá)到96%以上。

圖2 DNA去除率的響應(yīng)曲面圖

3 結(jié)論

此純化平臺(tái)工藝是在原有乙腦滅活疫苗純化工藝基礎(chǔ)上，增加了Sartobind Q膜陰離子交換層析。利用細(xì)胞殘留DNA在接近中性條件下大多帶負(fù)電荷的特性，進(jìn)一步去除原液中Vero細(xì)胞殘余DNA，工藝去除率在90%以上；利用完整乙腦病毒顆粒分子量較大、不易結(jié)合在介質(zhì)上的特點(diǎn)，采用直接流穿模式即可達(dá)到分離的目的，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置。本實(shí)驗(yàn)通過DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，成功地建立了一種乙腦滅活疫苗層析純化工藝平臺(tái)，使得產(chǎn)品的安全性得到了進(jìn)一步的提高，而且減少了樣品收集和上樣的步驟，生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，優(yōu)化了傳統(tǒng)工藝，可用于Vero細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的乙腦滅活疫苗生產(chǎn)。