許竟成，林衍峰，楊泉，沈冰燕，耿洪璐，李梅，李婷婷，楊?yuàn)W偉，柏曉輝

(1.黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.休寧縣水產(chǎn)站，安徽 休寧 245400)

臺(tái)灣白甲魚(yú)OnychostomabarbatulumPellegrin[1]，又名臺(tái)灣鏟頜魚(yú)，是鯉科Cyprinidae白甲魚(yú)屬Onychostoma的一種淡水魚(yú)類(lèi)，主要分布在長(zhǎng)江及長(zhǎng)江以南水系中，也有少數(shù)種類(lèi)分布在淮河、海河及渭河[2]。臺(tái)灣白甲魚(yú)喜好棲息在水質(zhì)清澈且有礫石的山間溪流底層或江河中上游的湍急水流中，其肌肉中富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸等，營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，是受消費(fèi)者喜愛(ài)的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[3]。近年來(lái)，受水體污染、棲息環(huán)境破壞及過(guò)度捕撈等因素的影響，臺(tái)灣白甲魚(yú)資源日益匱乏，現(xiàn)已被列為瀕危魚(yú)類(lèi)[4]。因此，加強(qiáng)臺(tái)灣白甲魚(yú)魚(yú)種的繁殖、保護(hù)和研究具有重要意義。

對(duì)白甲魚(yú)的研究主要集中在稀有白甲魚(yú)Onychostomarata[5-6]、多鱗白甲魚(yú)O.macrolepis[7]和長(zhǎng)江白甲魚(yú)O.sima[8]等。研究主要涉及白甲魚(yú)的ITS2序列結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性[8]、線粒體DNA特征[5,9]、生物學(xué)特征與繁殖技術(shù)[10]、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分[11-12]和腸道微生物群落組成[13]等。然而，對(duì)臺(tái)灣白甲魚(yú)的研究相對(duì)較少，對(duì)其微生物群落構(gòu)成的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，采用Illumina公司的Novaseq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)采自不同環(huán)境(地點(diǎn))的臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，比較了其皮膚細(xì)菌群落特征及其多樣性，以期為臺(tái)灣白甲魚(yú)的健康養(yǎng)殖提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 2020年11月，分別于率水河流域的安徽省黃山市休寧縣溪口鎮(zhèn)生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)采集人工養(yǎng)殖1齡臺(tái)灣白甲魚(yú)樣品6尾和安徽省黃山市休寧縣流口鎮(zhèn)水產(chǎn)種質(zhì)保護(hù)區(qū)采集野生1齡臺(tái)灣白甲魚(yú)樣品6尾。采用符合生態(tài)捕魚(yú)法的撒網(wǎng)法捕魚(yú)，臺(tái)灣白甲魚(yú)生物學(xué)信息見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器 AC2-4S1型生物安全柜(新加坡Esco公司)、SQ510C型高壓滅菌鍋(重慶雅馬拓公司)、MiniSpin plus型高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)、Tanon-1600型數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)、DS-11型超微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(美國(guó)DeNovix公司)。

1.1.3 試劑 dNTPs、Trans 2K plus DNA maker和100 bp DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸和無(wú)水乙醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Agarose瓊脂糖(Biowest,西班牙)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 從采集的樣本中分別隨機(jī)挑選健康無(wú)損傷的白甲魚(yú)，在無(wú)菌條件下將捕獲的白甲魚(yú)頸椎脫臼后犧牲，用無(wú)菌鉗子鉗住魚(yú)嘴并用口腔拭子在魚(yú)的兩側(cè)擦拭整個(gè)魚(yú)身體(除了頭部)以獲取皮膚微生物；再將該口腔拭子放入預(yù)先準(zhǔn)備好的無(wú)菌樣品管中，放入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)，將采完皮膚微生物樣品的魚(yú)編號(hào)后也放入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，稱(chēng)重和測(cè)量長(zhǎng)度后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白甲魚(yú)皮膚微生物總DNA的提取 參照趙裕棟等[14]的方法，提取白甲魚(yú)皮膚微生物總DNA。簡(jiǎn)述如下：用無(wú)菌剪刀將含有白甲魚(yú)皮膚微生物的口腔拭子剪下并放入無(wú)菌EP管中，向其中加入1.0 mL CTAB裂解液振蕩混勻，靜置15 min后加入溶菌酶和蛋白酶K，并于56 ℃水浴鍋上反應(yīng)30 min(每10 min混勻一次)；離心收集上清液，并向其中加入酚、氯仿、異戊醇混合溶液(三者的體積比為25∶24∶1)450 μL后混合均勻，以12 000 r/min離心10 min；吸取上清液至新EP管中，加入2倍體積的異丙醇，混勻后于4 ℃冰箱中過(guò)夜沉淀；以12 000 r/min離心10 min后棄去上清液，再用1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌沉淀兩次；再次離心棄去上清液，并于超凈工作臺(tái)上揮發(fā)殘留乙醇，最后用無(wú)菌雙蒸水洗脫抽提的總DNA，用電泳檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 白甲魚(yú)皮膚微生物16S rRNA基因V3～V4序列的擴(kuò)增 以提取的白甲魚(yú)皮膚微生物基因組DNA為模板，利用引物341F：5′CCTAYGGGRBGCASCAG 3′和806R：5′GGACTACNNGGGTATCTAAT 3′擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)。PCR擴(kuò)增體系(共50 μL)：5×PrimerStar buffer 10 μL，dNTPs 2 μL，341F引物2 μL，806R引物2 μL，DNA模板2 μL，PrimerStar polymerase 1 μL，無(wú)菌ddH2O 31 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，52 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min；電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的高通量測(cè)序 上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)后，取電泳條帶明顯、清晰的樣品用超微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢驗(yàn)合格后，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并委托北京諾禾致源科技股份有限公司利用Illumina Novaseq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建文庫(kù)和高通量測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析 將測(cè)序獲得的序列中的條碼和引物去除，并用軟件FLASH[15]對(duì)匹配的序列進(jìn)行組裝，獲得Raw Tags序列；再用QIIME 2軟件[16]對(duì)Raw Tags序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。簡(jiǎn)述如下：將序列分值Q≤19或序列長(zhǎng)度經(jīng)處理后小于原始序列長(zhǎng)度75%的序列舍去；參考數(shù)據(jù)庫(kù)the Gold Database中已有的結(jié)果，利用USEARCH軟件包中的UCHIME算法[17]，將測(cè)序序列中的嵌合體找出并除去，以獲得高質(zhì)量的序列。

利用UPARSE軟件[18]將上述高質(zhì)量序列中相似度≥97%的序列劃分到相同的操作單元(operational taxonomic units,OTUs)；隨后，用RDP classifier[19]和SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)[20]對(duì)上述OTUs中的代表序列進(jìn)行注釋和分析。利用Chao1指數(shù)(http://www.mothur.org/wiki/Chao)、Shannon指數(shù)(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)和Simpson指數(shù)(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)等對(duì)白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白甲魚(yú)皮膚微生物總DNA提取結(jié)果

采用改進(jìn)的CTAB法對(duì)采自白甲魚(yú)皮膚的微生物總DNA進(jìn)行提取。從圖1(a)可見(jiàn)，絕大多數(shù)的白甲魚(yú)皮膚微生物總DNA基本可成功提取，個(gè)別質(zhì)量不佳的經(jīng)重新抽提后基本滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。從圖1(b)可見(jiàn)，利用引物341F和806R擴(kuò)增的16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)條帶均一、清晰，回收后可用于后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)。

2.2 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌16S rRNA V3～V4可變區(qū)測(cè)序結(jié)果

采用Illumina Novaseq測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)上述微生物總DNA進(jìn)行測(cè)序分析。從表2可見(jiàn)：測(cè)序獲得的原始序列條數(shù)普遍在18.4萬(wàn)條以上，最多的可達(dá)29.9萬(wàn)條；通過(guò)校正測(cè)序序列、剔除錯(cuò)誤序列和嵌合體外，獲得的質(zhì)控后序列也普遍在3.0萬(wàn)條以上，其中最多的可高達(dá)14.5萬(wàn)條。這表明，白甲魚(yú)皮膚存在著大量細(xì)菌。

M—DNA分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量； 1～12分別對(duì)應(yīng)樣本s1～s12。 M—DNA marker; 1 to 12 correspond to samples s1 to s12, respectively. 圖1 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚微生物DNA提取結(jié)果Fig.1 Skin microbial DNA extracted from Onychostoma barbatulum Pellegrin

表2 樣本測(cè)序結(jié)果質(zhì)控統(tǒng)計(jì)Tab.2 Quality control statistics of sequencing results in samples

利用稀釋曲線(rarefaction curve)對(duì)白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌菌群的測(cè)序深度和豐富度進(jìn)行分析。從圖2(a)可見(jiàn)，當(dāng)測(cè)序序列條數(shù)達(dá)到2.0萬(wàn)條以上時(shí)，隨著測(cè)序深度的加深，臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的稀釋度曲線趨近飽和，這說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果能客觀、真實(shí)地反映白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的真實(shí)組成。從圖2(b)可見(jiàn)，臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌測(cè)序獲得的序列條數(shù)在門(mén)phylum、綱class、目order、科family和屬genus這5個(gè)水平上差別不大，但在種species的水平上測(cè)序所獲得的序列條數(shù)有差異。

圖2 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)特征Fig.2 Characteristics of skin bacterial sequencing data of Onychostoma barbatulum Pellegrin

2.3 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成

將測(cè)序獲得的序列與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中的微生物進(jìn)行比對(duì)和注釋?zhuān)@得臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚微生物樣本中細(xì)菌在門(mén)和屬水平的組成情況。從門(mén)水平上分析顯示，臺(tái)灣白甲魚(yú)樣本皮膚細(xì)菌主要集中在變形菌門(mén)Proteobacteria、厚壁菌門(mén)Firmicutes、擬桿菌門(mén)Bacteroidetes和放線菌門(mén)Actinobacteria，還有少量菌分布在疣微菌門(mén)Verrucomicrobia、梭桿菌門(mén)Fusobacteria和酸桿菌門(mén)Acidobacteria等;盡管臺(tái)灣白甲魚(yú)樣本中細(xì)菌在門(mén)水平的組成種類(lèi)差別不大，但不同白甲魚(yú)個(gè)體和不同環(huán)境的白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的比例在門(mén)水平上有明顯的差別(圖3)。

從屬水平上分析顯示，臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚樣本細(xì)菌主要集中在嗜氫菌屬Hydrogenophilus、芽孢桿菌屬Bacillus、普雷沃菌屬Prevotella、變形桿菌屬Proteus、鰻利斯頓氏菌屬Limnohabitans、水棲菌屬Enhydrobacter和纖維弧菌屬Cellvibrio等，不同白甲魚(yú)個(gè)體和不同環(huán)境的白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的比例在屬水平上也有明顯的差別(圖4)。

圖3 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌基于門(mén)水平的分布Fig.3 Distribution of skin bacteria in Onychostoma barbatulum Pellegrin based on the phylum level

2.4 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌分析

采用熱圖(heatmap)法對(duì)臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚樣本中含量前20的菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌在門(mén)水平上主要集中在變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)(圖5(a))。

圖4 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌基于屬水平的分布Fig.4 Distribution of skin bacteria in Onychostoma barbatulum Pellegrin based on the genus level

圖5 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌分析Fig.5 Heatmap analysis of bacterial community in skin microbiome of Onychostoma barbatulum Pellegrin

細(xì)菌韋恩圖分析顯示：養(yǎng)殖白甲魚(yú)皮膚中獨(dú)有3 374種細(xì)菌，野生組白甲魚(yú)皮膚中獨(dú)有6 550種細(xì)菌；它們共有870種細(xì)菌，其中，含量最豐富的前8種細(xì)菌集中于嗜氫菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、水棲菌屬、普雷沃菌屬、刺骨魚(yú)菌屬Epulopiscium、纖維弧菌屬和雷爾氏菌屬Ralstonia(圖5(b))。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：野生組中細(xì)菌在互養(yǎng)菌門(mén)Synergistetes和廣古菌門(mén)Euryarchaeota也較多(圖5(c))。此外，養(yǎng)殖組中白甲魚(yú)細(xì)菌在屬水平上集中在貪食菌屬Variovorax、葡萄球菌屬Staphylococcus、異常球菌屬Deinococcus、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、短波單胞菌屬Brevundimonas和鰻利斯頓氏菌屬Limnohabitans；野生組白甲魚(yú)細(xì)菌在屬水平上集中在克雷伯氏菌屬Klebsiella、梭菌屬Clostridium、口動(dòng)菌屬Lautropia、魏斯氏菌屬Weissella、拉恩氏菌屬Rahnella、藤黃單胞菌Luteimonas、硝化螺菌屬Nitrospira、嗜膽菌屬Bilophila和生絲微菌屬Hyphomicrobium(圖5(c))。

2.5 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌α多樣性分析

利用Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)上述臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行α多樣性分析。從圖6可見(jiàn)：野生組的Chao1指數(shù)平均值為1 750，大于養(yǎng)殖組，表明野生組物種數(shù)較多；養(yǎng)殖組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為7.0和0.975，野生組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為7.5和0.981，表明野生組白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的豐富度較高且均勻度較好。Wilcox檢驗(yàn)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖組和野生組的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖6 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的α多樣性分析Fig.6 α diversity of skin bacteria of Onychostoma barbatulum Pellegrin

2.6 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌β多樣性分析

基于白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌β多樣性進(jìn)行上述臺(tái)灣白甲魚(yú)樣本間的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖組和野生組的白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌除個(gè)別樣本(如s2和s7)外，同一組的樣本基本聚在一起(圖7(a))。利用樣本的OTU豐度信息計(jì)算Bray Curtis，并用主坐標(biāo)分析(PCoA)法分析以上樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組別的白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌群落具有一定相似性(圖7(b))。

圖7 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的β多樣性分析Fig.7 β diversity of skin bacteria of Onychostoma barbatulum Pellegrin

2.7 白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌功能分析

將測(cè)序獲得的臺(tái)灣白甲魚(yú)樣本細(xì)菌信息與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的代謝通路結(jié)合，預(yù)測(cè)白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌群落功能。由預(yù)測(cè)結(jié)果可知，以上樣本細(xì)菌群落中的細(xì)菌主要參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子與維生素代謝、脂代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、能量代謝和異生物質(zhì)代謝等方面。有趣的是，無(wú)論是個(gè)體水平(圖8(a))，還是野生和養(yǎng)殖組的平均水平(圖8(b))，參與上述代謝過(guò)程的微生物數(shù)量差別均不顯著，暗示這些細(xì)菌對(duì)白甲魚(yú)生長(zhǎng)是重要的。

圖8 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌功能分析Fig.8 Functional analysis of skin bacteria of Onychostoma barbatulum Pellegrin

3 討論

3.1 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的多樣性

白甲魚(yú)是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，對(duì)其進(jìn)行研究可為加強(qiáng)該魚(yú)種的繁殖、保護(hù)等提供科學(xué)依據(jù)。本研究中，首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和酸桿菌門(mén)是臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌中豐度最高的菌群。蘇月華等[13]報(bào)道梭桿菌門(mén)和變形菌門(mén)是白甲魚(yú)腸道中豐富度最高的菌群，而Wu等[21]通過(guò)高通量測(cè)序方法也報(bào)道梭桿菌門(mén)和變形菌門(mén)是草魚(yú)Ctenopharyngodonidella腸道內(nèi)重要的菌群。由此推測(cè)，梭桿菌門(mén)和變形菌門(mén)在魚(yú)的生長(zhǎng)中發(fā)揮了非常重要的功能。同時(shí)，本研究中從臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌中鑒定的厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)和酸桿菌門(mén)在白甲魚(yú)的腸道中也廣泛存在[13,22]，這表明以上菌群是白甲魚(yú)中廣泛存在的菌群。

3.2 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌的特有菌群

從菌群屬水平上看，本研究中首次利用高通量測(cè)序技術(shù)在兩個(gè)不同環(huán)境中生活的白甲魚(yú)皮膚上鑒定出含量豐富的共有菌群，如嗜氫菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、水棲菌屬、普雷沃菌屬、刺骨魚(yú)菌屬、纖維弧菌屬和雷爾氏菌屬，這是臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌群落屬水平的首次報(bào)道?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中，僅見(jiàn)南極魚(yú)皮膚微生物中存在芽孢桿菌屬[23]，這說(shuō)明魚(yú)類(lèi)皮膚存在芽孢桿菌屬菌落。與已報(bào)道的白甲魚(yú)腸道中存在的屬水平菌落[13,22]相比，本研究中發(fā)現(xiàn)的嗜氫菌屬、芽孢桿菌屬、水棲菌屬、普雷沃菌屬、刺骨魚(yú)菌屬、纖維弧菌屬和雷爾氏菌屬均不存在于腸道中，暗示這些菌僅在白甲魚(yú)皮膚上定植。此外，養(yǎng)殖組白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌主要分布于貪食菌屬、葡萄球菌屬、異常球菌屬、鞘脂單胞菌屬和短波單胞菌屬，而野生組白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌主要分布于口動(dòng)菌屬、魏斯氏菌屬、拉恩氏菌屬、藤黃單胞菌屬和硝化螺菌屬等，表明這些細(xì)菌的分布可能與白甲魚(yú)生活環(huán)境差異有關(guān)。

3.3 臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌群落的功能

本研究中，利用Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)兩個(gè)不同環(huán)境的臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成進(jìn)行α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩個(gè)不同環(huán)境的白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成、豐富度及均勻度存在差異，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不具有顯著性差異，這說(shuō)明白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成相對(duì)穩(wěn)定。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣本中細(xì)菌群落功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落豐富度高的菌群主要集中于氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子與維生素代謝、脂代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和能量代謝等通路，這說(shuō)明細(xì)菌菌群廣泛參與白甲魚(yú)的生長(zhǎng)、代謝活動(dòng)，對(duì)其生長(zhǎng)是非常重要的。

本研究中，充分利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成進(jìn)行分析，最大限度地還原其皮膚細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與豐度；同時(shí)，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究結(jié)果可為后續(xù)白甲魚(yú)的繁育、保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。同時(shí)，鑒于該測(cè)序技術(shù)的局限性，后續(xù)可通過(guò)宏基因組技術(shù)對(duì)臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌進(jìn)行更深入的功能分析。

4 結(jié)論

1)養(yǎng)殖和野生臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌菌群主要分布于18個(gè)門(mén)，其中，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)的菌落數(shù)最多；從屬水平上看，菌落含量豐富度排名前8的菌主要分布在嗜氫菌屬、變形桿菌屬、芽孢桿菌屬、水棲菌屬、普雷沃菌屬、刺骨魚(yú)菌屬、纖維弧菌屬和雷爾氏菌屬，這是白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌組成的首次報(bào)道。

2)從臺(tái)灣白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌中鑒定出的厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)和酸桿菌門(mén)也存在于白甲魚(yú)的腸道中，說(shuō)明這些菌群是白甲魚(yú)中廣泛存在的菌群。

3)嗜氫菌屬、芽孢桿菌屬、水棲菌屬、普雷沃菌屬、刺骨魚(yú)菌屬、纖維弧菌屬和雷爾氏菌屬僅存在于白甲魚(yú)皮膚中，暗示其是皮膚特有菌群。

4)結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，白甲魚(yú)皮膚細(xì)菌菌群主要參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子與維生素代謝、脂代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和能量代謝等通路，說(shuō)明這些細(xì)菌對(duì)白甲魚(yú)的生長(zhǎng)是非常重要的。