傅松哲

(1.設施漁業(yè)教育部重點實驗室(大連海洋大學)，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學 海洋科技與環(huán)境學院，遼寧 大連 116023)

宏基因組學(Metagenome)是由美國Wisconsin大學的Handelsman等于1998年提出的新概念[5]。目前，該方法已經(jīng)廣泛應用于描述和研究環(huán)境中的微生物群落，以及它們與環(huán)境中其他生物、非生物之間的相互作用。宏基因組學研究的是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質的總和，包括傳統(tǒng)方法不能培養(yǎng)的微生物的遺傳信息。得益于宏基因組測序技術的飛速發(fā)展，研究者已經(jīng)有能力深入研究之前不可培養(yǎng)微生物的特性，從而全面地刻畫不同微生物群落對于整個生態(tài)系統(tǒng)的重要意義[6]。

與傳統(tǒng)方法相比，宏基因組測序技術可以檢測特定環(huán)境下所有生物的遺傳物質，是污水生物污染物監(jiān)測較為理想的解決方案。近年來，宏基因組測序技術在未知病原的臨床診斷[7]、環(huán)境保護與污染修復[8]及污水監(jiān)測[9]中得到了廣泛應用。本文從污水中致病性細菌、病毒、有毒藻類及ARGs的豐度與動態(tài)變化的角度，綜述了宏基因組測序技術在入海排污口污水生物污染物監(jiān)測中的應用進展，并結合團隊前期研究和工作實踐，提出了污水監(jiān)測預警模型的構建思路，以期為保障中國海洋生態(tài)環(huán)境安全提供理論參考和技術支撐。

1 宏基因組測序技術的發(fā)展歷程

1.1 第一代宏基因組測序技術

1996年，毛細管電泳技術的發(fā)明，第一次使宏基因組測序技術得以實現(xiàn)。2001年，Cai等在提取環(huán)境中的總DNA后，將純化后的DNA進行16S rRNA基因擴增，再連接到適當?shù)馁|粒載體上，并通過轉化技術將質粒轉入宿主菌，從而形成重組DNA文庫，進一步對獲得的克隆子進行篩選，并用毛細管測序儀測序，得到了宏基因組產物片段[10]。這套方法也稱為鳥槍法(Short-gun method)(圖1)。由于整個試驗過程涉及從環(huán)境樣品提取總DNA及其純化、宿主菌的轉化和從文庫中篩選克隆子等多個步驟，每一步操作都可能會對分析結果產生不同程度的影響，近年來已不再使用。

圖1 宏基因組測序技術的發(fā)展歷程Fig.1 Development roadmap of metagenomic sequencing

1.2 第二代宏基因組測序技術

高通量測序技術(high-throughput sequencing)也稱為第二代宏基因組測序技術(metagenomic next-generation sequencing)。利用這一新方法，在成功制備基因組文庫樣品后，可以直接進行測序，樣品制備的操作時間也極大地縮短。同時，因為采用了大規(guī)模平行測序的方式，測序的通量范圍也得以呈指數(shù)級擴大。目前，主要有3種測序平臺應用于宏基因組測序：羅氏公司的454焦磷酸測序儀、Illumina測序儀和SOLiD測序儀[11]。

1)羅氏454焦磷酸測序儀。2005年，454 Life Science公司首先建立了第二代高通量測序技術，并在隨后推出了454 FLX Pyrosequencer測序儀(羅氏454焦磷酸測序儀)。其測序過程：首先，在具有超過200萬個寡核苷酸的玻璃板上進行大規(guī)模的并行焦磷酸測序[12]；隨后，DNA在熒光素酶催化下發(fā)出熒光，被高分辨率電荷耦合器件(CCD)相機捕獲，從而測定擴增的DNA序列。羅氏454測序儀的局限性在于其高錯誤率。與第一代測序序列的錯誤率(10-4～10-5)相比，羅氏454焦磷酸測序儀平均錯誤率為10-3～10-4[13]。由于聚合酶和熒光素酶效率的限制，羅氏454焦磷酸測序儀的平均讀取長度約為400 bp。

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2)因美納Illumina測序儀。2006年，因美納公司推出了基于單分子簇的Illumina測序儀。與Sanger測序中使用的合成測序法類似，Illumina測序儀也是基于可逆終止的化學反應[14]，但具有邊合成邊測序(sequencing by synthesis)的特點。 其測序過程：首先，制備基因組文庫，類似于羅氏454測序儀，文庫的制備涉及將基因組DNA片段化成特定長度，進行末端修飾，并添加接頭(adapter)；隨后，DNA隨機附著到光學透明的玻璃表面(flow cell)，通過聚合酶摻入熒光標記并實現(xiàn)DNA擴增，這些DNA片段經(jīng)過擴增后，在flow cell上形成數(shù)以百萬計的序列簇(cluster)；最后，通過相機讀取每個核苷酸擴增時產生的熒光標記，實現(xiàn)序列測定。Illumina 基因組分析儀的局限性在于其體外擴增步驟容易導致高背景錯誤率(錯誤率為10-2～10-3)[15]。此外，Illumina圖像分析時可能將化學晶體、灰塵和棉絨顆粒識別為簇，從而誤讀為DNA序列。盡管Illumina測序的錯誤率稍高于羅氏454焦磷酸測序儀，但由于其測序成本較低且測序通量較高，故Illumina測序平臺已成為最受歡迎的測序選擇之一。

3)SOLiD測序儀。2007年，美國ABI公司推出了一款名為SOLiD系統(tǒng)的基因測序儀。該測序儀由于測序讀長較短、運行較慢，隨后退出了市場。2010年，ABI公司推出的Ion torrent測序儀采用的是半導體芯片測序原理[16]，將高密度半導體小孔芯片置于測序儀中的離子感受器之上。其測序過程：首先，制備DNA文庫，其過程與Illumina建庫相似，但其DNA的接頭不帶有突出的T堿基黏性末端，而是平頭；隨后，進行乳液PCR，其成分包括水相和油相，其中水相是核心，DNA文庫的PCR擴增在水相中完成，而油相起到分隔作用；最后，由半導體芯片捕捉測序信號，每當擴增出來的DNA鏈摻入芯片時就會釋放出質子，離子感受器隨即感受到這種信號，半導體芯片將化學信號直接轉換為數(shù)字信號，從而讀出相應的核苷酸序列。Ion torrent測序儀由于采用的是半導體芯片測序，不需要昂貴的物理成像和光學檢測設備，故測序成本相對較低。此外，由于其測序操作簡單，無修飾核苷酸的添加，可以在2 h內完成測序工作，因而近年來得到了迅速普及。Ion torrent測序儀的缺點在于其測序讀長仍然較短(100～200 bp)，對于重復序列和移動遺傳元件的測序效果依然不佳[17]。

1.3 第三代宏基因組測序技術

第二代宏基因組測序技術普遍采取PCR擴增技術對初始DNA樣品進行擴增，這會引入一定的測序偏倚。為解決這一問題，不依賴PCR擴增的第三代宏基因組測序技術應運而生。目前，Helicos基因分析系統(tǒng)(Helicos’ genetic analysis system)、牛津大學的納米孔測序技術(Oxford nanopore sequencing)和Pacific Bioscience公司開發(fā)的單分子實時測序技術(single molecule real time, SMRT)經(jīng)過不斷地發(fā)展完善，已成為主流的第三代宏基因組測序平臺。

1)HeliScope測序儀。2008年4月，Helico BioScience公司利用單分子測序技術對M13病毒的基因組進行了重測序[18]，開啟了第三代測序技術的研發(fā)浪潮。一方面，由于其制備過程中不需要PCR步驟，大大減少了由PCR引起的偏倚和誤差；同時，由于其讀長可達1 300 bp，比任何第二代測序技術都要長，這使得測序的質量又一次得到大幅度地提高。HeliScope測序儀是第一個能夠對單個分子進行測序的測序平臺，與二代測序中的Illumina測序儀類似，也采用邊合成邊測序的技術。但該技術無需對樣本進行PCR擴增，簡化了測序文庫的構建過程，也避免了DNA擴增中出現(xiàn)的錯誤。HeliScope的測序過程相對簡單：首先，將待測DNA隨機打斷成小片段，然后在3′末端加上50 bp帶有熒光標記的poly(A) 尾，并與芯片上固定的Oligo dT探針結合，利用poly(A)上的熒光標記進行精確定位；隨后，依次加入4種Cy5熒光染料標記的單核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，與模板互補配對并延伸一個堿基；最后，用CCD相機采集熒光信號，獲得測序序列。

2)單分子實時測序儀(SMRT)。2009年，Pacific Bioscience公司在HeliScope測序儀的基礎上做了進一步改進，發(fā)展出單分子實時測序儀，其測序過程與HeliScope類似。SMRT測序過程：首先，DNA聚合酶和模板結合，分別將四色熒光基團標記在4種脫氧核苷酸的磷酸基團的末端；隨后，隨著不同堿基的加入，激發(fā)波會激發(fā)基團發(fā)出不同熒光；最后，根據(jù)光的波長與峰值判斷進入的堿基類型。由于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，與HeliScope測序儀20～50 bp的讀長相比，SMRT測序技術平均測序讀長可達3 000～5 000 bp，最長讀長能達到20 000 bp，實現(xiàn)了超長讀長測序[19]。

3)納米孔測序儀。2008年，牛津納米孔公司開發(fā)了依靠納米孔捕獲單分子實時電信號的納米孔測序儀。其測序過程：首先，通過納米孔通道蛋白結合并解螺旋DNA/RNA鏈，在電壓差的作用下，DNA/RNA鏈以穩(wěn)定的速率通過納米孔通道蛋白，由于DNA/RNA鏈上的不同堿基將引起不同電學信號的變化，通過對這些信號進行捕獲，即可得知相應堿基的類型，并完成序列的實時測定[20]。納米孔測序技術有3個突出的優(yōu)點：(1)測序讀長較長，為10 kbp～100 kbp，對于復雜的基因組結構具有較好的效果；(2)數(shù)據(jù)可實時讀取，這使得納米孔測序可以邊測序邊檢測，便于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；(3)由于核酸不會在測序過程中被破壞，故可以直接對RNA進行測序。這些特點使其成功應用于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的實時在線監(jiān)測中，并顯示出顯著高于熒光定量PCR檢出限的檢測效果[21]。2021年，中國成都奇碳科技公司推出了第一臺基于納米孔測序技術的國產基因測序儀 QNome-3841，相對于納米孔測序儀，其讀長更長，而測序成本更低。

綜上，3種三代測序技術各有千秋。HeliScope測序儀測序成本最低，但由于其讀長過短，因此，難以對含有復雜基因結構的序列進行測序。SMRT測序技術準確率和敏感性最高，準確率最高可達99.999%，并能檢測到甲基化等堿基修飾，但其測序成本過高，不適用于大規(guī)模樣本測序。納米孔測序技術的優(yōu)點在于其讀長較長，最高可達100 kbp，但其錯誤率目前仍然較高，且錯誤位置較為隨機[22]。隨著測序技術的進一步發(fā)展，可以預見未來宏基因組測序技術將會朝著更高通量、更準確和更低成本的方向發(fā)展。一些當前只能依靠傳統(tǒng)手段監(jiān)測的病原生物，包括以血吸蟲為代表的寄生蟲和以賈第鞭毛蟲為代表的原生動物也將有可能通過宏基因組測序手段進行監(jiān)測。

2 宏基因組測序技術在入海排污口微生物監(jiān)測中的應用

2.1 宏基因組測序技術在致病性細菌監(jiān)測中的應用

致病性細菌是能在人體內寄生、增殖并引起疾病的一類細菌的統(tǒng)稱。在中國沿海地區(qū)，每天有成千上萬噸的養(yǎng)殖廢水、生活污水、工業(yè)廢水和醫(yī)療廢水經(jīng)入海排污口排入海洋，排污口排放的污水極易在沿海人口稠密地區(qū)造成如霍亂等致病性細菌病大規(guī)模流行[23]。因此，加強入海排污口污水中致病性細菌的監(jiān)測至關重要。

1) 養(yǎng)殖污水中致病性細菌的監(jiān)測。近幾年來的宏基因組測序結果表明，排污口污水的溶解氧、鹽度和溫度的季節(jié)性變化，潮汐及排污口類型、地理位置上的空間分布差異等，均會對入海排污口污水中細菌群落結構、時空分布和致病性細菌的豐度產生不同程度的影響[23-25](表1)。如Suttner等[26]采用Illumina測序技術對美國加利福尼亞州沿岸的農業(yè)養(yǎng)殖污水進行了9個月的監(jiān)測，結果表明，農業(yè)養(yǎng)殖污水主要致病性細菌為產志賀毒素的大腸埃希氏菌Escherichiacoli，并指出用宏基因組測序技術對農業(yè)養(yǎng)殖污水進行微生物風險評估具有可行性。Moore等[27]采用454焦磷酸測序技術對美國新罕布什爾州大灣區(qū)河口細菌群落進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)了多種貝類病原。

2)城市污水中致病性細菌的監(jiān)測。近年來，中國也在各個沿海省份通過宏基因組測序開展了入海排污口的污水監(jiān)測工作，發(fā)現(xiàn)排污口類型和排污季節(jié)是細菌群落變化的兩個關鍵因素。劉霜等[28]采用454焦磷酸測序儀對青島海域近海港口區(qū)、水產養(yǎng)殖區(qū)、工業(yè)區(qū)和休閑度假區(qū)4種類型排污口鄰近海域致病性細菌的組成與分布進行了分析，結果顯示，青島排污口鄰近海域致病性細菌類群多樣性非常高，且不同類型排污口細菌種類存在較大差異，在工業(yè)區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)均檢測到溶藻弧菌Vibrioalginolyticus和副溶血弧菌V.parahaemolyticus等致病菌。郭明月[29]采用Illumina測序技術對青島市麥島海域和海泊河的污水監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，工業(yè)污水中細菌的群落結構比起生活污水更易受到季節(jié)演替的影響，其夏季致病菌的種類遠遠高于冬季，且夏季致病菌主要是與肺炎相關的軍團菌Legionella及與腹瀉相關的弧菌屬Vibrio、弓形桿菌屬Arcobacter等。姜南等[30]采用羅氏454焦磷酸測序技術，對寧波市沿海的5個陸源入海排污口在3—10月進行了采樣和宏基因組測序，并對不同排污口細菌群落的時空變化進行了分析，結果顯示，寧波市沿海5個入海排污口均含有大量的致病細菌，主要病原菌包括腸桿菌屬Enterobacter、弧菌屬和假單胞菌屬Pseudomonas等，不同排污口在不同季節(jié)的細菌群落結構差異較大。

3)污水致病性細菌的風險評估。通過宏基因組測序也可對污水致病性細菌的風險進行評估。楊文新等[31]采用Illumina測序技術對大連市入海排污口及鄰近海域的微生物種群演替進行了動態(tài)分析，結果顯示，市政排污口排放的污水中致病性細菌非常豐富，包括希瓦氏菌屬Shewanella、弧菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬等，其中，腸桿菌科為主要優(yōu)勢類群, 在各排污口均有檢出，提示該菌風險較大。郎秀璐等[32]用宏基因組測序表明，相對于排入河流后進行生態(tài)處理的方式，直接排海的排放方式使得致病性細菌更易持久性存在于近岸海域，并使某些致病性細菌如假單胞菌屬和弓形桿菌屬，在擴散后仍然保持較高的相對豐度，因此，應對這幾種致病性細菌進行重點監(jiān)測。2017—2020年，本研究團隊采用Illumina測序技術在遼寧省東港市的2個入海排污口進行污水監(jiān)測，在東港市宏基因組數(shù)據(jù)中共檢測到76種致病性細菌，其中，夏季污水中氣單胞菌屬Aeromonas、不動桿菌屬Acinetobacter、霍亂弧菌Vibriocholerae和副溶血性弧菌最為豐富，而弓形桿菌屬則在冬季達到峰值[33]。此外，本研究團隊進一步分析了宏基因組數(shù)據(jù)中的毒力基因，包括不動桿菌、銅綠假單胞菌等機會性致病菌的毒力，從而更為準確地對微生物風險進行了評估[33]。

2.2 宏基因組測序技術在病毒監(jiān)測中的應用

病毒是污水中的另一大類生物污染物。最早應用宏基因組學技術分析病毒群落的科學家是Breitbart Mya教授，他于2002年首次應用宏基因組監(jiān)測技術對美國加州兩處海岸中的病毒進行研究，分別發(fā)現(xiàn)了374、7 114個潛在的新病毒[34]。隨后，包括諾如病毒和冠狀病毒等在內的許多人類相關病毒也通過宏基因組測序技術在水環(huán)境中被檢測到[35-36]。

1)提高病毒鑒定的分辨率。傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)法只能在科水平上鑒定病毒，而宏基因組工具提高了許多與人類相關病毒多樣性的分辨率，為改進水質和更科學地防治病毒侵染提供了重要的管理工具。Adriaenssens等[37]通過RNA和DNA病毒學分析，對污水處理廠及下游河流、河口的病毒群落進行研究，在種水平上發(fā)現(xiàn)了8 400余種不同的病毒群落，表明來自污水的病毒群落也會沉積在河口水體中，同時這種現(xiàn)象也會受當?shù)氐乩?、天氣和潮汐的影響。Xu等[38]通過對珠江口表層水的病毒群落深度進行宏基因組測序，發(fā)現(xiàn)其病毒群落主要由感染細菌、無脊椎動物和人類的病毒組成。

2)實現(xiàn)新冠疫情的早期預警。新冠疫情暴發(fā)以來，污水病毒宏基因組測序也在新冠疫情早期預警方面發(fā)揮著關鍵作用。自2020年6月首篇用污水監(jiān)測新冠病毒SARS-CoV-2的研究報告發(fā)表以來[39]，已有大量研究采用病毒宏基因組測序技術，在污水中檢測到了該病毒的不同變異株[40-41]。最近研究發(fā)現(xiàn)，對污水的病毒宏基因組測序不僅有助于跟蹤新冠病毒不同變異株的進化趨勢，還能為病毒傳播提供早期預警信號[42]。此外，采用病毒宏基因組學方法還可以通過測定污水中SARS-CoV-2的濃度，依據(jù)相關模型預測社區(qū)感染人數(shù)[42]。如本研究團隊通過測定污水中SARS-CoV-2的濃度，采用蒙特卡洛模擬法構建了定量污水預測模型[43]，并實時預測了陜西省西安市和江西省南昌市等地新冠疫情規(guī)模和感染人數(shù)，為相關部門決策提供了科學依據(jù)。

3)發(fā)現(xiàn)未知病毒。通過對污水樣本進行宏基因組測序，還可以直接獲得環(huán)境中不可培養(yǎng)的病毒信息，并闡明某些中間宿主的病毒攜帶情況[44]。這不僅增加了對環(huán)境病毒遺傳多樣性的認識，而且實時監(jiān)測到一些潛在致病性病毒的進化情況，有助于對一些新發(fā)病原體進行早期預警。中國采用病毒宏基因組測序技術進行污水監(jiān)測起步較晚，近3年來，應用逐步增多。Wang等[45]對中國香港地區(qū)2家污水處理廠排污口污水進行了跨度為9年的采樣，用宏基因組測序技術共獲得8 478 種病毒片段，并發(fā)現(xiàn)了一些之前未有的新病毒。

綜上，有相當多的病毒類群穩(wěn)定出現(xiàn)在污水中，這為揭示病毒種群的時空演替規(guī)律奠定了基礎。這些工作顯示了病毒宏基因組測序技術在污水病毒監(jiān)測中的應用潛力。

2.3 宏基因組測序技術在有害藻華監(jiān)測中的應用

有害藻華(harmful algal blooms，HAB)是指伴隨著浮游藻類的驟然大量增殖而直接或間接導致水面發(fā)生變色的現(xiàn)象，是威脅、危害海洋生態(tài)環(huán)境和人類健康的另一種海洋災害。宏基因組測序技術在對有害藻華的監(jiān)測中發(fā)揮著日益重要的作用。2016年7月，美國佛羅里達州奧基喬比湖及整個圣露西河口發(fā)生了一次大型有毒藍藻引起的水華，導致佛羅里達州宣布進入緊急狀態(tài)。隨后Kramer等[47]通過宏基因組測序對這一河口地區(qū)進行了污水監(jiān)測，宏基因組測序分析表明，與產生微囊藻毒素和藻類神經(jīng)毒素相關的基因來自微囊藻屬，在所有調查位點中，總氮、微囊藻毒素與微囊藻毒素合成基因豐度之間存在顯著相關性，這表明含高濃度氮的污水排放導致了水華期間微囊藻毒素的產生。這些結果表明，奧基喬比湖、圣露西河及河口的監(jiān)測與監(jiān)管策略應考慮管理氮負荷，以控制未來藻類和微囊藻毒素產生的藍藻大量繁殖。有害藻類也可能通過河口污水排放迅速傳播并造成大規(guī)模水華。

表1 宏基因組測序技術在入海排污口污水監(jiān)測中的典型應用案例Tab.1 Application of metagenomic sequencing technology in the monitoring of marine sewage outfalls

宏基因組測序也幫助闡明了有害藻華的形成機制。Ma等[48]通過宏基因組測序，闡明了原核生物群落在有害藻華的建立和生長中的作用，宏基因組測序表明，硅藻產生的不穩(wěn)定碳水化合物和有機氮促成了某些原核生物的激增。值得注意的是，Planctomycetaceae科細菌和硅藻可能形成了共生關系，硅藻為Planctomycetaceae提供了有機物質，而細菌則向硅藻提供維生素和過氧化氫作為交換，并最終促進了硅藻水華的形成。此外，微囊藻還可以與固氮微生物形成共生關系，依靠固氮微生物提供的氮源，微囊藻在氮缺乏狀態(tài)下也能形成水華。

宏基因組測序也進一步揭示了促進有害藻華發(fā)生的環(huán)境因素。王靖淇等[53]對盤錦遼河口水體進行宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮、氨氮和磷酸鹽等營養(yǎng)鹽是影響真核浮游藻類種群結構特征最重要的環(huán)境因子。綜上，宏基因組測序為認識和監(jiān)測污水中有害浮游藻類的演替規(guī)律提供了借鑒。

3 宏基因組監(jiān)測技術在入海排污口ARGs監(jiān)測中的應用

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來為人類治療細菌性感染做出了重大貢獻，然而，隨著抗生素的長期濫用，ARGs不斷出現(xiàn)，已對細菌性感染的治療產生了嚴重影響。入海排污口是抗生素、耐藥性細菌及ARGs的重要儲存庫，又是耐藥性細菌馴化繁殖的“溫床”，同時它還是向環(huán)境中傳播擴散抗生素、耐藥性細菌和ARGs的重要源頭[54]。生活污水、制藥廢水及醫(yī)院污水中均含有大量的ARGs，這些污水經(jīng)污水處理系統(tǒng)處理后，仍含有相當數(shù)量的抗生素、耐藥性細菌和ARGs，其對人類健康及生態(tài)環(huán)境構成了潛在威脅。一項全球入海排污口ARGs的監(jiān)測表明，根據(jù)樣本采樣位置的人口密度，所有研究樣本的ARGs豐度差異明顯，高人口密度環(huán)境具有更高的ARGs豐度，其中23.78%的ARGs對人類健康構成嚴重威脅[54]。Suttner等[26]對加利福尼亞州河口水體、沉積物進行9個月的樣品采集，通過宏基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，所有樣本中攜帶ARGs的宏基因組讀數(shù)明顯高于其他淡水和土壤宏基因組中的ARGs讀數(shù)，這表明農業(yè)養(yǎng)殖污水可能是ARGs的天然儲存庫。

中國學者很早就對入海排污口的ARGs問題給予了高度關注。Zhou等[49]采用宏基因組測序技術測定了廣東、廣西地區(qū)30個主要河口的ARGs污染水平，結果發(fā)現(xiàn)，珠江口地區(qū)具有較高的抗性組多樣性和豐度，特別是在珠江的主要河口，水體pH是塑造成廣東、廣西地區(qū)河口ARGs時空演變的重要因素。Zhu等[50]從中國東部海岸18個河口排污口沉積物樣本中監(jiān)測到近200個不同類型的ARGs，其中，四環(huán)素胺類基因及其他磺胺類藥物ARGs檢出率相對較高。Zhao等[51]從山東省東營市黃河口保護區(qū)和海水養(yǎng)殖區(qū)排污口分別采集水樣，采用高通量測序技術和實時定量PCR芯片技術，測定了87種ARGs在沉積物中的組成和豐度，結果表明，養(yǎng)殖區(qū)排污口樣品中ARGs的檢出數(shù)目(7～15種)顯著高于保護區(qū)ARGs的檢出數(shù)目(5種)，海水養(yǎng)殖污水樣品中，ARGs的相對豐度也比黃河口保護區(qū)提高了10倍左右。此外，盡管大部分ARGs的豐度在入海后有所下降，但是個別ARGs的豐度依然較高，這說明海水的稀釋并不能完全消除養(yǎng)殖污水排放所造成的ARGs富集。

致病性細菌間的共生關系是ARGs轉移的另一個關鍵驅動因素。本研究團隊通過解析2018—2020年遼河口養(yǎng)殖區(qū)域水體樣品中微生物的種群演替，發(fā)現(xiàn)了與致病性弧菌存在共生關系的物種類型，隨后有針對性地分析了這些物種的移動遺傳元件，發(fā)現(xiàn)致病性弧菌與其存在共生關系的物種間存在廣泛的ARGs水平轉移[52]。該研究對于探究ARGs的傳播途徑及闡明抗生素耐藥機制具有重要意義。

4 存在問題及展望

4.1 宏基因組測序面臨的主要技術問題

目前，宏基因組測序技術已經(jīng)在污水監(jiān)測領域得到了廣泛應用，然而，未來研究還需要攻克以下幾個技術難題，以進一步拓寬其應用范圍。

1)當前宏基因組測序技術只能表征微生物種群的相對豐度。由于細菌總數(shù)的季節(jié)性變化，通過相對豐度的變化來評估污水病原和ARGs的健康風險可能會產生偏差，這些潛在的偏差可能高估或低估微生物和ARGs風險。盡管定量聚合酶鏈式反應(qPCR)可以定量測定某個致病性細菌或病毒的絕對豐度，但為每一種微生物開發(fā)一套qPCR檢測方案是不現(xiàn)實的。可能的解決方案是開發(fā)基于絕對定量的宏基因組測序技術，即通過細菌總量乘以每一種細菌的相對豐度來推斷每一種細菌的絕對豐度。目前，測定污水樣品細菌總量的方法主要包括流式細胞術、16S qPCR和Spike-in內參序列法等[55]。對于病毒宏基因組測序，未來也可通過熒光顯微計數(shù)法測定樣品中病毒的絕對豐度，從而推算出每種病毒的數(shù)量。

2)對于宏基因組測序得到的海量數(shù)據(jù)，如何構建更加快速的分析流程，并自動生成更加清晰易懂的分析報告，仍然是需要克服的技術難題。

3)如何通過宏基因組測序技術構建污水監(jiān)測的健康風險評估模型，也是未來研究的重點。本研究團隊提出了一個由病原菌篩選、病原菌基因分型和風險評估3個步驟組成的微生物風險評估流程，利用這一流程，筆者初步評估了遼寧省東港市入海排污口致病性細菌和病毒的健康風險。目前，已有初步研究可通過測定污水中新冠病毒的濃度，從而推測出區(qū)域內的感染人數(shù)。未來如何將這一方法拓展到對SARS-CoV-2及其他病原的健康風險評估中值得深入探索。這些技術的應用將極大地提高宏基因組測序技術對城市和養(yǎng)殖污水進行微生物風險評估的可行性(圖2)。

圖2 絕對定量宏基因組測序技術在入海排污口污水風險評估中的流程Fig.2 Workflow of absolute quantification of metagenomic sequencing technology in the risk assessment of wastewater

4.2 構建基于絕對定量宏基因組測序技術的污水監(jiān)測預警體系

隨著宏基因組測序技術的不斷發(fā)展，對污水樣品進行現(xiàn)場測序已經(jīng)具備了可行性。特別是便攜式納米孔測序儀的出現(xiàn)，更是讓研究人員能夠在野外讀取污水樣本中的生物遺傳信息，從而為防止生物污染物的進一步擴散提供及時有效的信息。污水監(jiān)測預警體系的構建主要包括以下兩個方面。

1)提供所有病原微生物和ARGs的絕對豐度。相對于一次只能對1種或少數(shù)幾種病原進行定量檢測的傳統(tǒng)方法，在理論上可以覆蓋成千上萬種所有可能的生物污染物，并對每一種生物污染物的豐度進行推測，從而實時提供包括SARS-CoV-2等高致病性病毒、有毒藻類和抗生素ARGs豐度數(shù)量等信息。這將給未來傳染性疾病和生物污染物的監(jiān)測預警帶來革命性的變革。絕對定量宏基因組測序技術，可以在數(shù)小時內快速測定污水樣品中的生物遺傳信息，計算所有病原微生物和ARGs的豐度，實現(xiàn)在線風險評估。未來研究人員將可以通過一次宏基因組測序，全面掌握監(jiān)測水體中生物污染物的數(shù)量，大大提升污水監(jiān)測的效率。

2)實現(xiàn)定量風險評估。結合本研究團隊開發(fā)的定量污水預測模型和其他定量風險評估工具，人們可以進一步通過絕對定量宏基因組測序獲取生物污染物的種類和數(shù)量，并預測出包括新冠病毒肺炎和感染性腹瀉等多種疾病的感染人數(shù)。同時，給上述檢測指標設置不同閾值后，可以通過污水監(jiān)測，實現(xiàn)對諸如SARS-CoV-2疫情、感染性腹瀉疫情和有害藻華暴發(fā)等重大公共安全事件的早期預警。

可以預見，在不遠的將來，隨著現(xiàn)場測序技術、絕對定量宏基因組測序技術和風險評估模型的不斷完善，人們將實現(xiàn)對所有生物污染物指標的定量在線監(jiān)測和風險評估，并構建多層級污水監(jiān)測預警體系。這些技術的研發(fā)將有助于實現(xiàn)海洋污染物的早期預警和及時處置，從而有力地保障公共衛(wèi)生和海洋生態(tài)環(huán)境安全。