王丹丹，黃躍飛,2,3,4，楊海嬌,3,4

(1：青海大學(xué)，水利電力學(xué)院，西寧 810016) (2：青海大學(xué)，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016) (3：青海大學(xué)，黃河上游生態(tài)保護(hù)與高質(zhì)量發(fā)展實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016) (4：青海大學(xué)，水利部江河源區(qū)水生態(tài)治理與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

湖泊是陸地地表主要的蓄水載體之一，對(duì)區(qū)域內(nèi)水資源的調(diào)度和生態(tài)系統(tǒng)的支撐具有重要作用，是生物與非生物因子共同作用下產(chǎn)生的自然綜合體[1]。微生物參與并驅(qū)動(dòng)湖泊生態(tài)系統(tǒng)中C、N、P等元素的循環(huán)和能量的流動(dòng)[2]。湖泊微生物受到水體物理化學(xué)參數(shù)(如：溫度、pH、電導(dǎo)率、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和離子)的影響，表現(xiàn)出顯著的季節(jié)性，進(jìn)而影響了湖泊生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程[3]。

微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、功能和分布的形成機(jī)制是環(huán)境選擇和擴(kuò)散限制相互作用的結(jié)果[4]。中性理論和生態(tài)位理論是解析微生物群落構(gòu)建的兩個(gè)相互補(bǔ)充的重要機(jī)制[5]。中性理論認(rèn)為自然界中微生物具有生態(tài)位等效性，主要包括隨機(jī)的出生、死亡、遷移、滅絕、物種形成和有限擴(kuò)散[6]。相反地，生態(tài)位理論認(rèn)為微生物的擴(kuò)散能力是無(wú)限的，而微生物群落中不同的物種有不同的生境偏好性，微生物群落的形成歸因于環(huán)境因子的選擇和各種生物之間的相互作用[5]。隨機(jī)過(guò)程導(dǎo)致微生物群落發(fā)生不可預(yù)測(cè)的變化，而基于生態(tài)位理論的確定性過(guò)程會(huì)影響微生物群落的適應(yīng)性，進(jìn)而影響微生物群落的豐度和組成[6]。因此，微生物群落構(gòu)建的確定性和隨機(jī)性過(guò)程之間的相互補(bǔ)充是充分理解微生物多樣性形成的關(guān)鍵。2006年，Sloan等建立了中性模型，擬合OTU的出現(xiàn)頻率，量化中性過(guò)程在物種分布過(guò)程中所占的比例(R2)和評(píng)估物種的遷移率(m)[7]。目前，中性模型已被證實(shí)可以量化不同生境(比如河流和湖泊)中微生物群落物種豐度的分布情況[8-11]。Chen等基于Sloan中性模型，解析了隨機(jī)性過(guò)程是亞熱帶河流在干燥和潮濕季節(jié)真核微生物群落的主要構(gòu)建過(guò)程[4]。此外，Liu等使用Sloan中性模型量化研究長(zhǎng)江浮游和沉積物細(xì)菌群落地理分布的結(jié)果表明，中性過(guò)程非常適合大型河流系統(tǒng)中細(xì)菌的群落分布[10]。隨后，Stegen等基于Beta最近分類單元指數(shù)(Nearest Taxon Index-NTI)和Raup-Crick指數(shù)(RCbray)進(jìn)一步量化了確定性和隨機(jī)性過(guò)程對(duì)微生物群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)比例[12-13]。例如，Li等使用零模型解析三峽水庫(kù)沉積物細(xì)菌群落構(gòu)建過(guò)程，發(fā)現(xiàn)同向選擇是沉積物細(xì)菌群落的主要構(gòu)建過(guò)程[14]。2020年，Gad等同時(shí)使用中性模型和零模型研究河流真核微生物的泛化種和特化種群落構(gòu)建過(guò)程，結(jié)果表明確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程共同影響河流真核微生物群落構(gòu)建過(guò)程[15]。同時(shí)，2022年Liu等使用零模型研究西藏區(qū)域23個(gè)湖泊在8月細(xì)菌和真核微生物群落的構(gòu)建過(guò)程，發(fā)現(xiàn)確定性過(guò)程是細(xì)菌群落的主要構(gòu)建過(guò)程，而隨機(jī)性過(guò)程是真核微生物群落的主要構(gòu)建過(guò)程[16]。

青藏高原東北部地處我國(guó)東部季風(fēng)區(qū)、西北干旱區(qū)和青藏高原高寒區(qū)的交匯地帶，是典型的干旱與半干旱氣候區(qū)[17]，自然發(fā)育了眾多內(nèi)陸咸水湖和鹽湖群。近年來(lái)青藏高原的氣候逐漸由暖干向暖濕化發(fā)展，導(dǎo)致湖泊面積快速擴(kuò)增、水位上升和水體理化因子改變[18]，進(jìn)而影響了湖泊微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，造成了湖泊微生物群落結(jié)構(gòu)明顯的季節(jié)差異[19]。前人研究西藏納木錯(cuò)湖泊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度在7月最高，1月最低，并且放線菌、藍(lán)細(xì)菌和Beta變形菌綱對(duì)季節(jié)變化的響應(yīng)最為明顯[20]。2013年，張紅光等研究青海湖和納木錯(cuò)湖水的可培養(yǎng)微生物季節(jié)的變化，發(fā)現(xiàn)在8月份微生物多樣性到達(dá)最大值[21]。另外，李國(guó)強(qiáng)的研究結(jié)果表明青海湖在8和10月，湖水的微生物豐富度和多樣性最高[22]。湖泊微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化主要是水體理化因子驅(qū)動(dòng)的結(jié)果，其中溫度主要影響微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中各種酶的活性；鹽度主要通過(guò)控制微生物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓來(lái)影響微生物的功能代謝；營(yíng)養(yǎng)鹽主要為微生物的代謝提供營(yíng)養(yǎng)底物[16]。目前，已有的研究主要集中在對(duì)青藏高原湖泊群?jiǎn)我患竟?jié)和單一湖泊多季節(jié)的研究中[23-24]，針對(duì)青藏高原東北部湖泊群微生物特征季節(jié)差異研究的報(bào)道較少，對(duì)微生物群落構(gòu)建過(guò)程的研究更少。

因此，本文選擇青藏高原東北部湖泊群為研究對(duì)象，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)采集水樣并對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序分析和統(tǒng)計(jì)分析，研究湖泊群細(xì)菌群落特征及其季節(jié)變化的驅(qū)動(dòng)因素。同時(shí)，使用中性模型和零模型分析，解析中性過(guò)程、確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程分別對(duì)不同季節(jié)細(xì)菌群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)比例，系統(tǒng)地解析了微生物群落的季節(jié)分布特征。開(kāi)展的研究一方面能夠補(bǔ)充高海拔湖泊生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落特征的本底數(shù)據(jù)，另一方面揭示不同季節(jié)湖泊細(xì)菌群落變化的驅(qū)動(dòng)因素、構(gòu)建過(guò)程及其差異，對(duì)于深入理解高海拔湖泊細(xì)菌群落構(gòu)建和湖泊水資源管理具有重要的支撐意義。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)描述

青藏高原暖季為5-10月，冷季為11-4月[25-26]，本研究選擇采樣時(shí)間為2020年6和12月，對(duì)應(yīng)的季節(jié)在本文中表述為非冰封期和冰封期，在兩個(gè)時(shí)期對(duì)青藏高原東北部青海湖(QHL，非冰封期N=6，冰封期N=5)、尕海(GHL，N=3)、托素湖(TSL，非冰封期N=4，冰封期N=3)、可魯克湖(KLKL，N=3)和小柴旦湖(XCDL，N=4)5個(gè)湖泊進(jìn)行表層水樣的采集?？紤]到面積的大小不同，不同湖泊設(shè)置不同的樣點(diǎn)數(shù)(N)，樣點(diǎn)主要分布在入/出湖口或者湖邊/湖心以及兩者之間的中點(diǎn)上，具體分布如圖1所示。

圖1 研究湖泊分布及各自采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of the investigated lakes as well as corresponding sampling sites

1.2 水樣采集與預(yù)處理

在每個(gè)樣點(diǎn)水深約為0.5 m的位置進(jìn)行水樣的采集，每個(gè)樣點(diǎn)采集水樣5份，每份約1 L，裝入已滅菌的窄口玻璃瓶，4℃保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。采集的水樣中3份用0.22 μm孔隙的濾膜(Millipore S-Pak Germany)進(jìn)行抽真空過(guò)濾預(yù)處理，過(guò)濾后將微生物富集的濾膜放置在無(wú)菌的離心管中，放置在-80℃保存，用于后續(xù)細(xì)菌總DNA提取。同時(shí)將剩余的水樣低溫黑暗保存，用于實(shí)驗(yàn)室水體營(yíng)養(yǎng)鹽和溶解有機(jī)碳濃度檢測(cè)。

1.3 湖泊水體物理化學(xué)參數(shù)檢測(cè)

1.4 總DNA提取和PCR過(guò)程

將冷凍保存的細(xì)菌濾膜采用CTAB法提取總DNA，所用試劑和操作流程根據(jù)參考文獻(xiàn)[27]。用1%(w/v)濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA純度。用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTTA-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S r RNA V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[28]。反應(yīng)體系及其流程依據(jù)我們先前研究中的PCR擴(kuò)增體系和流程[29]。

1.5 生物信息學(xué)分析

質(zhì)檢合格的PCR產(chǎn)物送樣進(jìn)行高通量測(cè)序(諾禾致源生物信息科技有限公司，北京)。將原始下機(jī)的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行如下處理：(1)按照條碼序列和引物序列對(duì)原始下機(jī)的數(shù)據(jù)進(jìn)行各樣本數(shù)據(jù)的拆分，并使用FLASH截取掉條碼序列后進(jìn)行每個(gè)樣本序列標(biāo)簽的拼接得到每個(gè)樣本的原始序列數(shù)據(jù)；(2)序列數(shù)據(jù)截取和過(guò)濾的具體操作如下：從連續(xù)低質(zhì)量值的堿基數(shù)到設(shè)定長(zhǎng)度的第一個(gè)低質(zhì)量的堿基位截?cái)?；再將截取后的序列?shù)據(jù)集中堿基長(zhǎng)度小于總序列長(zhǎng)度的75%的序列過(guò)濾掉；得到的序列在去除嵌合體后進(jìn)一步在97%的一致性水平上進(jìn)行OTU的聚類；最后使用QIIME(1.9.1)進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)的計(jì)算[30-31]。相關(guān)原始測(cè)序數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，序列登記編號(hào)為PRJNA728144和PRJNA837682。

1.6 細(xì)菌群落多樣性特征統(tǒng)計(jì)分析

進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)非冰封期和冰封期水體理化參數(shù)的差異顯著性[32]。非冰封期與冰封期細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)的差異使用非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)。另外，計(jì)算環(huán)境因子和不同時(shí)期alpha多樣性指數(shù)的Spearman相關(guān)關(guān)系，確定不同時(shí)期細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)的影響因子?；贐ray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis)來(lái)解析湖泊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同時(shí)期的差異，并使用基于Bray-Curtis相似性指數(shù)的相似性分析(analysis of similarity)檢驗(yàn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在非冰封期和冰封期之間差異的顯著性[33]?；贒CA(detrended correspondence analysis)的分析結(jié)果，當(dāng)DCA第1軸的特征向量值(DCA1)小于3時(shí)，選擇RDA(redundancy analysis)分析；當(dāng)DCA1值介于3～4之間時(shí)，選擇RDA和CCA(canonical correspondence analysis)均可；當(dāng)DCA1大于4時(shí)，選擇CCA分析?；贠TU相對(duì)豐度數(shù)據(jù)和VIF(variance inflation factor)小于10的環(huán)境因子進(jìn)行RDA和CCA分析[33]。使用vegan包中“envfit”函數(shù)對(duì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。使用環(huán)境因子的歐式矩陣和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Bray-Curtis相似指數(shù)矩陣進(jìn)行Mantel和偏Mantel檢驗(yàn)，分析水體理化因子和地理因子對(duì)不同時(shí)期湖泊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。基于OTU豐度表，構(gòu)建中性模型分析中性過(guò)程對(duì)不同時(shí)期湖泊細(xì)菌群落建構(gòu)的貢獻(xiàn)[5]。另外，基于OTU豐度表及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用Picante包進(jìn)一步量化確定性過(guò)程(異向選擇和同向選擇)和隨機(jī)性過(guò)程(擴(kuò)散限制和同向擴(kuò)散)對(duì)不同時(shí)期細(xì)菌群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)比例[3,34-35]。零模型是基于β-NTI 和RCbray指數(shù)來(lái)量化確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程對(duì)細(xì)菌群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)，當(dāng)β-NTI小于-2時(shí)，認(rèn)為細(xì)菌群落構(gòu)建過(guò)程是同向選擇；當(dāng)β-NTI大于2時(shí)，認(rèn)為細(xì)菌群落構(gòu)建過(guò)程是異向選擇。另外，當(dāng)β-NTI介于-2和2之間時(shí)，認(rèn)為細(xì)菌群落構(gòu)建過(guò)程為隨機(jī)性過(guò)程并根據(jù)RCbray指數(shù)的大小，來(lái)判斷擴(kuò)散限制(RCbray>0.95)、同向擴(kuò)散(RCbray<-0.95)和不確定過(guò)程(-0.95

2 結(jié)果分析

2.1 湖泊水體理化參數(shù)的變化

高原湖泊在非冰封期和冰封期15個(gè)水體的理化因子特征見(jiàn)附表Ⅰ。托素湖水溫在不同時(shí)期的均值最大(8.05℃，非冰封期=12.15，冰封期=3.95)?？婶斂撕诜潜馄诤捅馄谌芙庋鯘舛鹊木底罡?9.76 mg/L，非冰封期=6.79，冰封期=12.73)。5個(gè)湖泊的水體非冰封期pH值均小于冰封期，均表現(xiàn)出堿性。因?yàn)檠a(bǔ)給水源、湖泊面積大小和水文條件的差異，不同湖泊的鹽度差異較大，其中尕海的平均鹽度最高(69 g/L)，可魯克湖最低(3.17 g/L)。受到周圍旅游業(yè)和畜牧業(yè)的影響，青海湖不同時(shí)期葉綠素a和總磷的平均濃度明顯高于其他湖泊。在營(yíng)養(yǎng)鹽方面，尕?？偟拖鯌B(tài)氮的濃度在非冰封期和冰封期的變化量最大，托素湖最小。此外，非冰封期5個(gè)采樣湖泊的平均水溫、pH、溶解氧、氧化還原電位、濁度、葉綠素a和總磷與冰封期有顯著的差異，而電導(dǎo)率、總?cè)芙夤腆w、鹽度、溶解有機(jī)碳、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氮在不同時(shí)期水體中無(wú)明顯差異。

2.2 細(xì)菌群落特征的變化

2.2.1 不同時(shí)期alpha多樣性指數(shù)的比較 采樣湖泊所有樣點(diǎn)水體在非冰封期和冰封期共檢測(cè)出的OTUs數(shù)目分別為46147和55209。進(jìn)一步計(jì)算并分析不同時(shí)期細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson多樣性指數(shù)、Chao1豐度指數(shù)以及PD系統(tǒng)發(fā)育指數(shù))的差異性及其與環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性，結(jié)果如附表Ⅱ、圖2和圖3所示。非冰封期和冰封期細(xì)菌群落的平均Chao1豐度指數(shù)分別為2342.69和3026.69，非冰封期細(xì)菌Chao1豐度指數(shù)顯著低于冰封期(Wilcoxon，P<0.01)。非冰封期細(xì)菌群落的平均Simpson指數(shù)(0.92)顯著低于冰封期(0.94)。非冰封期細(xì)菌群落Shannon指數(shù)為6.29，冰封期為6.81，非冰封期和冰封期并無(wú)顯著差異。非冰封期細(xì)菌群落平均PD指數(shù)略大于冰封期，與冰封期細(xì)菌群落PD指數(shù)并無(wú)顯著差異。非冰封期細(xì)菌Chao1豐度指數(shù)和Simpson多樣性顯著低于冰封期，表明高原湖泊細(xì)菌群落豐度和多樣性存在顯著的季節(jié)分布特征。另外，環(huán)境因子與不同時(shí)期alpha多樣性指數(shù)的相關(guān)關(guān)系結(jié)果表明，非冰封期細(xì)菌多樣性隨著水溫、氧化還原電位、溶解有機(jī)碳和總氮的增加而顯著增加(圖3，P<0.05)，而冰封期細(xì)菌多樣性隨著溶解有機(jī)碳和總氮的增加顯著減少。非冰封期細(xì)菌Chao1豐度指數(shù)與經(jīng)度、海拔、pH、氧化還原電位、葉綠素a和氨氮呈顯著正相關(guān)，與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)。冰封期細(xì)菌Chao1豐度指數(shù)與水溫和溶解氧呈顯著正相關(guān)，與電導(dǎo)率、總?cè)芙夤腆w、鹽度、總氮和總磷呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖2 非冰封期和冰封期細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)對(duì)比分析(*代表非冰封期和冰封期細(xì)菌 alpha多樣性指數(shù)的Wilcoxon檢驗(yàn)P<0.05，**代表P<0.01，ns代表差異不顯著)Fig.2 Comparative analysis of alpha diversity indices in bacterial communities between non-freezing and freezing periods

圖3 非冰封期和冰封期細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)與環(huán)境因子之間Spearman相關(guān)系數(shù)(*代表環(huán)境因子與 細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)的顯著性P<0.05，**代表P<0.01， ***代表P<0.001)Fig.3 Spearman coefficient between alpha diversity indices of bacterial in non-freezing and freezing periods and environmental factors

2.2.2 不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較 在不同的分類水平上(門和屬)，高原湖泊非冰封期水體細(xì)菌物種組成及其相對(duì)豐度存在明顯差異。非冰封期和冰封期的優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門(Proteobacteria，非冰封期=40.06%，冰封期=56.31%)，但在冰封期其平均相對(duì)豐度比例更高。然而，非冰封期細(xì)菌群落中的擬桿菌門(Bacteroidetes-18.51%)、放線菌門(Actinobacteria-17.71%)和厚壁菌門(Firmicutes-14.21%)的相對(duì)豐度均明顯的高于冰封期Bacteroidetes(15.81%)、Actinobacteria(14.15%)和Firmicutes(3.03%)(圖4)。這表明了在門分類水平上，細(xì)菌群落組成具有季節(jié)分布特征。在屬水平上，非冰凍期和冰凍期湖泊水體中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌也表現(xiàn)出極為明顯的差異。其中非冰封期細(xì)菌屬主要為Proteiniclasticum、Fusibacter、Leuconostoc、Myroides、Dysgonomonas、Flavobacterium等，冰封期的主要為Nonlabens、Desulfotignum、Roseibaca、Chitinophagadunha、Pseudoxanthomonas等(圖5)，此外，基于Bray-Curtis距離的PCoA結(jié)果表明，前兩個(gè)軸對(duì)不同時(shí)期細(xì)菌群落變化的解釋率為27.57%(圖6)。來(lái)自同一時(shí)期的細(xì)菌群落基本聚集在一起，而非冰封期和冰封期細(xì)菌群落出現(xiàn)了明顯的分離，表明不同時(shí)期細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)不同。同時(shí)，不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析結(jié)果表明非冰封期和冰封期湖泊細(xì)菌群落組成差異極顯著(R=0.481，P=0.001)(圖6)。

圖4 不同樣點(diǎn)非冰封期和冰封期前10門相對(duì)豐度堆積圖Fig.4 Plot of relative abundance of top 10 phyla in different sampling sites in non-freezing and freezing periods

圖5 不同樣點(diǎn)非冰封期和冰封期細(xì)菌前35個(gè)屬相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.5 Top 35 genera heatmaps of bacterial community in different sampling sites in non-freezing and freezing periods

圖6 基于Bray-Curtis距離的不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析(橢圓代表95%的置信圈)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析Fig.6 Principal coordinate analysis of bacterial community based on the Bray-Curtis distance (ellipse represent 95% confidence internal) and analysis of similarity of bacterial community in different periods

2.3 不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子

DCA結(jié)果(非冰封期DCA1=1.82，冰封期DCA1=1.64)表明RDA分析可以合理解析不同時(shí)期細(xì)菌群落的驅(qū)動(dòng)因子。非冰封期和冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA的結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，對(duì)采樣湖泊非冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著(P<0.05)的環(huán)境因子分別為：總氮>緯度>總?cè)芙夤腆w>經(jīng)度>溶解有機(jī)碳，而顯著影響冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子分別為：海拔>溶解氧>溶解有機(jī)碳>pH。非冰封期和冰封期的RDA前兩軸分別解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)總變化的40.91%和67.16%。Mantel和偏Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示高原湖泊非冰封期和冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性均與環(huán)境因子顯著相關(guān)，且水體理化因子對(duì)非冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響比冰封期更明顯。然而，地理因子僅對(duì)冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(表1)。

圖7 非冰封期和冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析(帶*的環(huán)境因子代表“envfit”函數(shù)檢驗(yàn)P<0.05)Fig.7 Redundancy analysis of bacterial community structure in non-freezing and freezing periods (environmental factors with * represent P<0.05 using function of “envfit”test)

表1 不同時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(Bray-Curtis distance)與環(huán)境因子(Euclidean distance)之間關(guān)系的相關(guān)和偏相關(guān)檢驗(yàn)Tabl.1 Mantel and partial Mantel tests for relationship between bacterial community structures (Bray-Curtis distance) and environmental factors (Euclidean distance) in different periods

2.4 不同時(shí)期細(xì)菌群落的構(gòu)建過(guò)程

使用基于中性理論的中性模型來(lái)擬合不同OTUs的出現(xiàn)頻率，探究采樣湖泊水體細(xì)菌群落在不同時(shí)期分布特征差異的驅(qū)動(dòng)機(jī)制。中性模型評(píng)估結(jié)果如圖8所示，非冰封期和冰封期細(xì)菌OTUs的出現(xiàn)頻率和它們相對(duì)豐度變化之間關(guān)系的70%和79%可以被中性過(guò)程所評(píng)估，表明中性過(guò)程對(duì)冰封期湖泊細(xì)菌的構(gòu)建過(guò)程貢獻(xiàn)更大。結(jié)果也表明在不同時(shí)期，與確定性過(guò)程相比，細(xì)菌種類的損失和增加之間的平衡過(guò)程在高海拔湖泊中占據(jù)了重要的地位。另外，非冰封期和冰封期細(xì)菌的遷移率m分別為0.130和0.289，這表明非冰封期湖泊細(xì)菌物種擴(kuò)散能力低于冰封期。進(jìn)一步基于零模型，量化了確定性過(guò)程和隨機(jī)性過(guò)程對(duì)采樣湖泊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)貢獻(xiàn)比例，結(jié)果如圖9所示。確定性和隨機(jī)性過(guò)程共同驅(qū)動(dòng)青藏高原湖泊細(xì)菌的季節(jié)變化。非冰封期細(xì)菌群落的構(gòu)建過(guò)程有同向選擇(貢獻(xiàn)率=32.63%)、異向選擇(貢獻(xiàn)率=0.53%)、同向擴(kuò)散(貢獻(xiàn)率=1.58%)、擴(kuò)散限制(貢獻(xiàn)率=54.74%)、不確定的過(guò)程(貢獻(xiàn)率=10.53%)。冰封期細(xì)菌群落的構(gòu)建過(guò)程主要由隨機(jī)性的擴(kuò)散限制過(guò)程(貢獻(xiàn)率=55.56%)所主導(dǎo)，確定性過(guò)程(同向選擇和異向選擇)對(duì)冰封期細(xì)菌群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)比例為34.50%。

圖8 基于中性模型的非冰封期和冰封期OTU出現(xiàn)頻率圖(藍(lán)色實(shí)線表示中性模型的擬合結(jié)果，綠色和橘色的虛線分別表示在95%的置信區(qū)間上和下的預(yù)測(cè)結(jié)果，綠色和橙色的點(diǎn)代表OTU的出現(xiàn)頻率大于或者小于模型預(yù)測(cè)的頻率)Fig.8 The occurrence frequency of the OTU in non-freezing and freezing periods based on the neutral model (blue solid lines denote the fitting results of neutral model, green and orange dash lines denote the results of the model prediction of the upper and lower of the 95% confidence interval, respectively. Green and orange dots represent the occurrence frequency of OTU with more or less than that in the prediction of neutral model)

圖9 不同時(shí)期細(xì)菌群落的構(gòu)建過(guò)程Fig.9 Processes in assembly of bacterial communities in different periods

3 討論

本研究結(jié)果表明不同采樣湖泊和同一湖泊不同樣點(diǎn)的水體理化因子差異較大。青海湖、尕海、托素湖和小柴旦湖是咸水湖，可魯克湖是淡水湖。值得注意的是，可魯克湖KLKL1樣點(diǎn)的鹽度與KLKL2和KLKL3樣點(diǎn)存在較大差異。這主要是由于KLKL1樣點(diǎn)最接近尾閭咸水湖(托素湖)。青海湖QHL2、QHL5和QHL6樣點(diǎn)水體葉綠素a和總氮濃度明顯高于其他3個(gè)樣點(diǎn)，青海湖水體理化參數(shù)的空間分異主要是由于入湖補(bǔ)給水源的差異[36]。根據(jù)前人研究結(jié)果，QHL2和QHL6樣點(diǎn)處的入湖河泉吉河和黑馬河總氮濃度超標(biāo)，QHL5的入湖河倒淌河化學(xué)需氧量超標(biāo)[36]，這與湖邊污泥中有機(jī)氮濃度較高和當(dāng)?shù)啬撩裆顝U水入湖有關(guān)[37]。

微生物alpha多樣性指數(shù)是反映微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)青藏高原北部湖泊細(xì)菌Chao1豐度指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)在非冰封期和冰封期表現(xiàn)出顯著不同，并且非冰封期低于冰封期，說(shuō)明冰封期采樣湖泊水體中細(xì)菌的物種較為豐富，群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。這與先前報(bào)道的暖季細(xì)菌群落高于冷季的結(jié)論不一致[38-39]。根據(jù)一般生存理論，在更極端(寒冷)的環(huán)境條件下湖泊水體細(xì)菌的數(shù)量一般會(huì)偏少，群落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單，而本研究結(jié)果表明非冰封期細(xì)菌群落豐度和多樣性低于冰封期，可能存在如下解釋：(1)高原湖泊細(xì)菌本身具備抵抗極端寒冷生境的能力，隨著冰封期溫度的降低，耐低溫細(xì)菌的生態(tài)位可用性增加[40]；(2)冰封期更均勻的細(xì)菌分布(非冰封期和冰封期Pielou’s均勻度指數(shù)分別為0.56和0.61)，使得冰封期細(xì)菌多樣性高于非冰封期；(3)可能是湖泊冰封期間人類和動(dòng)物活動(dòng)影響相對(duì)較小所致[41]。一般而言，人類活動(dòng)的影響會(huì)導(dǎo)致湖水中營(yíng)養(yǎng)物濃度增加和藻類的大量繁殖，導(dǎo)致生境中溶解氧濃度降低，使得好氧細(xì)菌豐度減少。2020年，Wang等研究人類活動(dòng)影響白洋淀淺湖中微生物群落，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的人類活動(dòng)使湖泊微生物的Shannon和Simpson指數(shù)顯著降低[40]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)旅游業(yè)發(fā)展能夠減少國(guó)家濕地公園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的alpha多樣性但是增加beta多樣性[32]。另外，已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)青海湖入湖河流中微生物alpha多樣性指數(shù)顯著高于湖泊水體本身，因此，非冰封期采樣湖泊水體細(xì)菌多樣性低于冰封期，并非是非冰封期入湖地表水的稀釋所致[41]。

在非冰封期和冰封期采樣湖泊水體中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門都為Proteobacteria，與楊漸[42]得出的青藏高原湖泊微生物群落多樣性中Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)門的結(jié)論一致。研究表明，Proteobacteria在水環(huán)境中廣泛分布，主要有Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon-proteobacteria綱[24]。然而，Proteobacteria在非冰封期湖泊中平均相對(duì)豐度明顯低于冰封期，主要是由于Alpha-和Gamma-變形菌綱在非冰封期明顯低于冰封期(附圖Ⅰ)，這與Jiang等研究水庫(kù)Proteobacteria在秋季和冬季高于春季和夏季的結(jié)果一致[43]。同樣地，F(xiàn)irmicutes在非冰封期相對(duì)豐度為14.21%，而在冰封期為3.03%。已有研究表明Firmicutes可以作為糞便污染指標(biāo)[39]，因此其差異性可能與非冰封期湖泊周邊動(dòng)物活動(dòng)頻繁有關(guān)。另外，PCoA結(jié)果說(shuō)明高原湖泊非冰封期和冰封期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。這種差異可能是由于兩個(gè)時(shí)期環(huán)境因素和水文條件不同造成的。如非冰封期和冰封期水溫、溶解氧等理化參數(shù)存在顯著差異，而水溫和溶解氧被證實(shí)是湖泊細(xì)菌群落變化的顯著驅(qū)動(dòng)因子[32,35]。

大量研究結(jié)果表明湖泊水體鹽度、pH、水溫、總氮和海拔，是湖泊細(xì)菌群落特征差異的顯著驅(qū)動(dòng)因子[3,44-45]。Ji等[46]研究西藏區(qū)域25個(gè)湖泊水體的細(xì)菌多樣性，結(jié)果顯示鹽度是解釋鹽湖細(xì)菌群落變化的主要因素，但是在淡水湖細(xì)菌群落特征受水溫和空間因子的影響顯著，總氮對(duì)湖泊細(xì)菌群落變化的影響不顯著，僅解釋了細(xì)菌群落變化的1.2%。本文的研究結(jié)果與其存在一定的差異。一般而言，總氮為細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝過(guò)程提供必須的營(yíng)養(yǎng)和能量，影響了細(xì)菌的豐度和群落結(jié)構(gòu)。出現(xiàn)這種差異一方面可能與本研究中與總氮正相關(guān)的Actinobacteria相對(duì)豐度較大有關(guān)[39]；另一方面，是研究區(qū)域尺度大小不同所致。當(dāng)研究區(qū)域尺度較大，湖泊之間環(huán)境因子梯度(如：鹽度和水溫)和空間因子梯度差異過(guò)大，會(huì)影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。海拔是冰封期高原湖泊細(xì)菌群落的最顯著驅(qū)動(dòng)因子，海拔與冰凍期湖泊水體中葉綠素a和營(yíng)養(yǎng)鹽(總氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖3，P<0.05)。因此，我們推測(cè)海拔對(duì)冰凍期湖泊水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響是通過(guò)改變細(xì)菌限制營(yíng)養(yǎng)元素來(lái)驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落的變化。另外，溶解氧同樣對(duì)冰封期高原湖泊細(xì)菌有顯著的驅(qū)動(dòng)作用，這可能是由于其驅(qū)動(dòng)好氧細(xì)菌、兼性厭氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌比例的變化，從而改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。冰封期水體中溶解氧濃度的變化與水溫呈顯著正相關(guān)(圖3，P<0.05)，說(shuō)明當(dāng)水溫降低，水體中溶解氧濃度隨之減少，致使偏好厭氧生境的Gamma-proteobacteria相對(duì)豐度增加[23]，這也在一定程度上說(shuō)明了Gamma-proteobacteria綱相對(duì)豐度在不同時(shí)期的差異。

除了環(huán)境因子的變化對(duì)采樣湖泊水體浮游細(xì)菌群落特征產(chǎn)生影響外，中性模型模擬其他過(guò)程對(duì)細(xì)菌群落分布的影響程度，結(jié)果表明采樣湖泊非冰封期細(xì)菌群落組成變化的70%可以被中性過(guò)程所解釋，而冰封期79%可以被中性過(guò)程解釋，指示了隨機(jī)性過(guò)程在塑造高原湖泊細(xì)菌群落構(gòu)建中的重要作用。然而冰封期比非冰封期擬合程度高，表明冰封期細(xì)菌群落的中性過(guò)程更強(qiáng)或者擴(kuò)散潛力更大，雖然冰封期水體的連通性降低，可能會(huì)使冰封期細(xì)菌遷移率降低，但在相似的元群落結(jié)構(gòu)下，微生物高擴(kuò)散潛力不僅與連通性有關(guān)，還與生境的同質(zhì)性有關(guān)[5]。本研究中高原湖泊冰封期水體更均勻的物理化學(xué)條件更有利于中性過(guò)程，較大的環(huán)境梯度使得環(huán)境因子對(duì)微生物群落的影響更大[5]。這一點(diǎn)也可以被偏Mantel檢驗(yàn)水體理化因子對(duì)非冰封期細(xì)菌群落的影響更大的結(jié)果所證實(shí)(表1)。因此，采樣湖泊生境的同質(zhì)性對(duì)細(xì)菌群落的遷移率要大于水體的連通性，因而表現(xiàn)出冰封期細(xì)菌群落中性過(guò)程更強(qiáng)(擴(kuò)散潛力更大)。另外，中性理論認(rèn)為物種的豐度越高，其擴(kuò)散潛力越大[4]，這與本研究采樣湖泊冰封期細(xì)菌群落Chao1豐度指數(shù)高于非冰封期的結(jié)論一致。然而，隨機(jī)模型并不能100%的解釋采樣湖泊細(xì)菌非冰封期和冰封期的群落構(gòu)建機(jī)制，這表明采樣湖泊細(xì)菌群落的構(gòu)建在整體上受到多種過(guò)程(如同向選擇、異向選擇、低擴(kuò)散以及低環(huán)境選擇)的驅(qū)動(dòng)[10]。

4 附錄

附表Ⅰ、Ⅱ和附圖Ⅰ見(jiàn)電子版(DOI: 10.18307/2023.0121)。