劉嘉玉，李澤穎，陳玲燕，梅杰，馬濤，張巖

214122 江蘇 無錫，江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院無錫市婦幼保健院 乳腺外科（劉嘉玉、馬濤、張巖）； 214023江蘇 無錫，南京醫(yī)科大學(xué) 無錫臨床醫(yī)學(xué)院（李澤穎、陳玲燕、梅杰）

2020 年，女性乳腺癌的發(fā)病率已超過肺癌，占據(jù)全球癌癥發(fā)病率榜首，估計(jì)有230 萬例新發(fā)病例，占所有癌癥新病例的11.7%［1］。隨著乳腺癌早期篩查、診斷和治療方案的進(jìn)步，患者的存活率已有所提高。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，可結(jié)合靶基因mRNA 的3’-UTR 區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平使mRNA 降解或在翻譯水平抑制蛋白表達(dá)，其功能取決于與靶序列mRNA 的互補(bǔ)程度［2］。miRNA 表達(dá)異常可引起下游基因或信號(hào)通路的狀態(tài)發(fā)生改變，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)現(xiàn)象［3］。癌癥生物學(xué)的最新進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，除了表觀基因組的修飾，miRNA失調(diào)也可作為惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。在乳腺癌中，miRNA 可通過調(diào)控DNA 和組蛋白修飾從而造成乳腺癌表觀遺傳學(xué)的變化［4］，同時(shí)miRNA也可作為乳腺癌早期發(fā)展的生物標(biāo)記物，為其靶向治療提供指導(dǎo)［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30 家族，包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d 和miR-30e等，均可作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移抑制因子［6］，且有研究證實(shí)miR-30e-5p 可通過調(diào)節(jié)異黏蛋白來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移［7］。然而，miR-30e-5p 對乳腺癌細(xì)胞惡性表型的機(jī)制研究還相對較少。P53 是經(jīng)典的抑癌基因，其失活會(huì)促進(jìn)乳腺腫瘤的進(jìn)展，尤其是在預(yù)后不良的三陰性乳腺癌中更為明顯［8］。P53 介導(dǎo)的miRNA 相關(guān)通路進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞惡性表型的機(jī)制還有待進(jìn)一步發(fā)掘?；诖耍疚闹荚谔接慞53 介導(dǎo)的miR-30e-5p 對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人乳癌腺細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-453 購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7 和MDA-MB-453 細(xì)胞，培養(yǎng)條件：溫度為37℃，5%CO2。為進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，利用Lipofectamine 3000（Invitrogen） 對MCF-7 和MDA-MB-453細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染的基本步驟：先將1.5 μL Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑加入25 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)液中混勻，同時(shí)將1.25 pL、2.5 pL、5 μL miRNA-467b的mimics-GFP 分 別 與25 μL 的Opti-MEM 培 養(yǎng)液混合，孵育5 min 后將上述兩溶液混勻，室溫靜置20 min，將50 μL Lipo-miRNA 復(fù)合體逐滴均勻地加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別形成含有50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 的miRNA mimics 的轉(zhuǎn)染體系，4 ～ 6 h 后換用新鮮培養(yǎng)液，終止轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后流式檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2 染色質(zhì)免疫共沉淀

向培養(yǎng)液中加入1%終濃度的甲醛（0.275 mL，37%）固定10 min，使DNA 蛋白結(jié)合體交聯(lián)，然后加入終濃度約為0.12 mol 的甘氨酸（0.675 mL，2 M），孵育10 min，終止交聯(lián)。加5 mL TNT Buffer，離心（2 000 r/min，4℃，5 min）后棄上清，取胞核沉淀保存?zhèn)溆?。向胞核沉淀中? mL NB buffer，轉(zhuǎn)移至兩個(gè)EP 管中，一管備用，另一管超聲切碎至DNA 片段集中在200 ～ 1 000 bp，超聲條件：500 W，超聲10 s，冰上放置2 ～ 3 min，共7 ～ 10 次，至液體變澄清。取100 μg DNA 至新EP 管內(nèi)（另準(zhǔn)備10 μg input備用），加入700 μL DB buffer 稀釋。然后加入2 μg抗體及2 μg 相對應(yīng)的兔或鼠IgG，4℃，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動(dòng)結(jié)合1 ～ 2 h，離心（14 000 r/min，4 ℃，離心10 min），取上清，各加40 ～ 50μL 預(yù)處理過的蛋白G-Sepharose beads，4 ℃過夜。離心（3 000 r/min，3 min）棄上清，先后用RIPA I、RIPA II、LiCl buffer、TE buffer 洗滌1次。棄去TE buffer 后，beads 用200μL 洗脫buffer洗脫兩次，65 ℃下孵育10 min。收集洗脫后的樣品，加入2 μL 蛋白酶K，在65 ℃解交聯(lián)過夜，從而分離結(jié)合在一起的DNA 和蛋白。將各樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠取出后拍照觀察目的片段表達(dá)量。

1.3 熒光定量PCR 檢測

根據(jù)JASPAR 預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)，使用Primer Blast設(shè)計(jì)P53 在miR-30e-5p 前體結(jié)合片段的熒光定量PCR 引物，進(jìn)行PCR 反應(yīng)（94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)26 次，72℃最終延伸10 min），測定CT 值。引物序列如下：CCAGGCTCTAACCCACAT（正向）； GTGGCAGAATCTCACAGG（反向）。

此外，qPCR 也被用于miR-30e-5p 表達(dá)水平的檢測，U6 作為內(nèi)參，引物序列如下：miR-30e-5p：GCGCGTGTAAACATCCTTGAC（正向），AGTGCAGGGTCCGAGGTATT（反向）；U6：CTCGCTTCGGCAGCACA（正向），AACGCTTCACGAATTTGCGT（反向）。

1.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰蛋白酶消化1 min，然后將其重懸于含有10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中。將懸浮的細(xì)胞接種到96 孔板（Corning Incorporated，美國），細(xì)胞密度調(diào)整為4×104個(gè)細(xì)胞/mL（100 μL/孔），并在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h、48 h、72 h。每個(gè)孔添加10 μL CCK-8，然后將板置于培養(yǎng)箱中2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 下測量每個(gè)孔的光密度值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.5 劃痕法檢測細(xì)胞遷移

將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，細(xì)胞饑餓過夜處理。待細(xì)胞集合度達(dá)80%左右，在用無菌槍頭在六孔板中均勻劃線，根據(jù)組別按1.1步驟轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h、48 h 后，取出細(xì)胞，生物倒置顯微鏡拍照（放大倍數(shù)100×），用0 h 時(shí)劃痕邊緣與24 h、48h 時(shí)劃痕邊緣之間的距離來計(jì)算遷移距離。

1.6 Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲

用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞饑餓過夜處理。使用不完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液100 μL 加入Transwell 小室上室（Corning Incorporated），上室涂有Matrigel。將24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后將小室取出，棄去孔中培養(yǎng)基，PBS 漂洗3 次，將小室內(nèi)PBS吸干凈，此過程快速完成，避免讓小室的膜過于干燥。用無水甲醇固定細(xì)胞15 min，小室翻轉(zhuǎn)晾干10 min。在24 孔板加入500 μL 含0.1%結(jié)晶紫，小室置于其中染色30 min。取出后PBS 清洗至無殘留，生物倒置顯微鏡下拍照（放大倍數(shù)200×）并計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot

將細(xì)胞放置在35 毫米皿中（6×105個(gè)細(xì)胞/皿）。轉(zhuǎn)染后48 h，所有細(xì)胞均用裂解緩沖液處理，以提取總蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。先使用核蛋白和總蛋白提取試劑盒（凱基生物）提取核蛋白和總蛋白，MMP9（1∶1 000 稀釋， Abcam），CyclinD1（1∶1 000 稀釋，Abcam），β-catenin（1∶1 000 稀釋，Abcam），對于每個(gè)樣品，將蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相對于GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 激光共聚焦檢測

將蓋玻片浸入細(xì)胞培養(yǎng)基，使細(xì)胞附著生長。用PBS 洗3 次，每次5 min。然后用多聚甲醛（4%）將細(xì)胞固定15 min，將蓋玻片用PBS 洗3 次。接著，將蓋玻片放在含有0.5%Triton X-100 的PBS 液中孵育5 min，并將細(xì)胞用5%脫脂奶封閉1 h，然后加入β-catenin 抗體（1∶200 稀釋，Abcam），在4 ℃下孵育過夜。將蓋玻片用PBS 洗滌后加二抗（羊抗兔IgG-FITC，1∶100 稀釋，凱基生物）避光孵育1 h。在每張片子滴加50 ～ 100 μL DAPI 染液，避光放置5 min，PBS 洗三次。用防淬滅封片膠封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3 個(gè)表達(dá)區(qū)域拍照（放大倍數(shù)600×）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，miR-30e-5p 的表達(dá)量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P53 轉(zhuǎn)錄激活miR-30e-5p

通過染色質(zhì)免疫共沉淀與熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，在P53 野生型的MCF-7 細(xì)胞中，P53 抗體結(jié)合的miR-30e-5p 啟動(dòng)子區(qū)序列顯著高于IgG，而在P53突變的MDA-MB-453 中，P53 抗體仍可與miR-30e-5p 啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)合，但較MCF-7 細(xì)胞弱（圖1A）。與對照組相比，轉(zhuǎn)染了P53 野生型質(zhì)粒的MCF-7 和MDA-MB-453 細(xì)胞，miR-30e-5p 的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜ 0.05，圖1B），提示P53 可以轉(zhuǎn)錄激活miR-30e-5p。

2.2 miR-30e-5p 對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

MDA-MB-453、MCF-7乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 后，利用CCK8 法檢測其增殖能力變化。與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 的MDA-MB-453 和MCF-7細(xì)胞的增殖能力均受不同程度的抑制（P＜ 0.05，圖2），提示轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 后乳腺癌細(xì)胞的增殖能力下調(diào)。

圖1 P53 與啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活miR-30e-5pFigure 1． P53 Binds to the Promoter to Transcriptionally Activate MiR-30e-5p

圖2 miR-30e-5p 抑制細(xì)胞增殖Figure 2．MiR-30e-5p Inhibits Cell Proliferation

利用劃痕試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 的MCF-7、MDA-MB-453 乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。分別在劃痕后24 h，48 h 檢測遷移的距離，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 的MDA-MB-453 和MCF-7 細(xì)胞的遷移能力受到抑制（P＜ 0.05；圖3）。利用Transwell 小室檢測其侵襲能力變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 的MDAMB-453 和MCF-7 細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制（P＜ 0.05；圖4）。因此，轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 后，乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力均下調(diào)。

2.3 miR-30e-5p 抑制經(jīng)典Wnt 通路

激光共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-30e-5p的細(xì)胞，其核內(nèi)β-catenin 的水平明顯下調(diào)（圖5）。進(jìn)一步利用Western blot 實(shí)驗(yàn)，觀察到轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 細(xì)胞的核內(nèi)β-catenin 水平顯著下調(diào)。此外，β-catenin 靶基因MMP9 及Cyclin D1 表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖6）。

圖3 miR-30e-5p 抑制細(xì)胞遷移（×100，*P ＜ 0.05）Figure 3．MiR-30e-5p Inhibits Cell Migration (×100， *P ＜ 0.05)

圖4 miR-30e-5p 抑制細(xì)胞侵襲（結(jié)晶紫染色，×200，*P ＜0.05）Figure 4．MiR-30e-5p Inhibits Cell Invasion (Crystal Violet Staining，×200， *P ＜ 0.05)

A-B. Transfection of miR-30e-5p down-regulates the invasion ability of MDA-MB-453 cells； C-D. Transfection of miR-30e-5p down-regulates the invasion ability of MCF-7 cells

圖 5 激光共聚焦顯微觀察轉(zhuǎn)染miR-30e-5p 的細(xì)胞胞核內(nèi)β-catenin 的水平下調(diào)（DAPI 染色，×600）Figure 5．Down-Regulated β-Catenin Level in the Nuclei of Cells Transfected with MiR-30e-5p Observed by Laser Confocal Microscopy (DAPI Staining, ×600)

圖 6 Western blot 顯示MMP9、Cyclin D1 與核內(nèi)β-catenin 表達(dá)水平明顯下調(diào)Figure 6．Significantly Down-Regulated Levels of MMP9, Cyclin D1 and Nuclear β-Catenin in Western Blot

3 討 論

近年來，miRNA 通過調(diào)控靶基因的表達(dá)從而影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為一直是乳腺癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中，對于miR-30e-5p 的研究還相對較少。P53是人類癌癥中最頻繁改變的基因，在侵襲性腫瘤中約有50%存在突變，在三陰性乳腺癌等難以治療的癌癥中80%以上發(fā)生突變［9］。P53 調(diào)控的miRNA相關(guān)通路進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞惡性表型的機(jī)制還有待進(jìn)一步發(fā)掘。本文利用染色質(zhì)免疫共沉淀與熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中P53可結(jié)合miR-30e-5p 啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄激活miR-30e-5p 的表達(dá)。

miR-30 家族具有抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，其在5’端附近具有相同的種子序列，而在3’端附近具有不同的補(bǔ)償序列，在不同類型腫瘤中可同時(shí)發(fā)揮抑癌和致癌作用［10］。在乳腺癌中，miR-30或作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［11-12］。研究表明，乳腺癌細(xì)胞中的miR-30c 表達(dá)降低，而miR-30c 能結(jié)合KRAS 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’UTP 并沉默KRAS，抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［13］，并靶向作用于VIM/TWF1 而抑制細(xì)胞侵襲［14］。此外，miR-30c 可通過HER/RACI 途徑發(fā)揮作用，或可作為他莫昔芬治療潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，為晚期雌激素受體陽性乳腺癌患者是否能從內(nèi)分泌治療中得到臨床獲益提供預(yù)測指標(biāo)［15］。miR-30 家族的另一成員miR-30e 通過直接靶向IRS1 阻斷AKT 和ERK1/2 途徑的激活以及HIF-1α和VEGF 的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［16］。此外，RPS6KB1 與miR-30e 的3’-UTR 結(jié)合而成為其直接靶標(biāo)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤生長［17］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-30 可通過抑制乳腺癌中的CTHRC1 從而抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。

Wnt/β-catenin 是在進(jìn)化中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和干細(xì)胞更新等功能。其中，β-catenin 是鈣黏蛋白復(fù)合物的核心成分，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中涉及的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，如cyclin D1，在乳腺癌組織中該蛋白表達(dá)上調(diào)，其核蓄積是激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin 可作為某些miRNA的 靶 基 因，包 括miR-26b、miR-135、miR-214、miR-216a 和miR-340［21］。本 文 發(fā) 現(xiàn) 乳 腺 癌 細(xì) 胞 表 達(dá)miR-30e-5p 后，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，且miR-30e-5p 可通過抑制經(jīng)典Wnt 通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)P53 可介導(dǎo)miR-30e-5p表達(dá)，通過抑制經(jīng)典Wnt 通路從而抑制乳腺癌細(xì)胞惡性表型，證明miR-30e-5p 有希望成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)，為乳腺癌靶向治療提供指導(dǎo)。

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