龍亞康，王蘇杰，王芳，馬偉峰，吳小延

510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院（龍亞康、馬偉峰）；510060 廣州，中山大學(xué)腫瘤防治中心分子診斷科（龍亞康、王蘇杰、王芳、吳小延）

骨巨細(xì)胞瘤（giant cell tumor of bone， GCTB）是一種溶骨性腫瘤，占所有原發(fā)性骨腫瘤的4% ～ 5%，約占良性骨腫瘤的20%［1］，多發(fā)于青壯年（20 ～ 55歲）四肢長(zhǎng)骨骨端［2-3］，兒童及青少年發(fā)病率較低，約為1.8% ～ 10.6%［4］。該病男性多見(jiàn)，男女發(fā)病率為（1.1 ～ 1.5）∶1.0［5］。組織學(xué)上，GCTB 以單核基質(zhì)細(xì)胞為特征，核圓形至梭形，有單核巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞。部分單核基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出成骨細(xì)胞前體表型，這些細(xì)胞被認(rèn)為是GCTB的腫瘤細(xì)胞，而單核巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞則被認(rèn)為是非腫瘤成分［6-7］。GCTB 有時(shí)會(huì)表現(xiàn)出繼發(fā)性變化，例如動(dòng)脈瘤樣骨囊腫（aneurysmal bone cyst，ABC）變化、泡沫狀組織細(xì)胞聚集和反應(yīng)性骨或軟骨質(zhì)形成。GCTB 需要與來(lái)自各種類型的具有破骨性巨細(xì)胞的骨病變區(qū)分，包括軟骨母細(xì)胞瘤、非骨化性纖維瘤、棕色腫瘤（甲狀旁腺功能亢進(jìn)）、巨細(xì)胞修復(fù)性肉芽腫、原發(fā)性 ABC 和骨肉瘤，尤其是巨細(xì)胞豐富型腫瘤。

組蛋白H3.3 由位于不同位點(diǎn)的兩個(gè)基因編碼：1 號(hào)染色體上的H3F3A 和17 號(hào)染色體上的H3F3B。先前的一項(xiàng)研究揭示了GCTB 中頻繁發(fā)生H3F3A p.G34W 突變及軟骨母細(xì)胞瘤中的H3F3B p.K36 M 突變［8］。隨后的研究表明，大約85%到95%的GCTB 攜帶H3F3A p.G34W 突變，并且一小部分（約1% ～ 2%）攜 帶H3F3A p.G34L、p.G34M、p.G34R 或p.G34V 突變［9-11］?？笻3.3 G34W 突變抗體現(xiàn)在可用于免疫組織化學(xué)染色，但無(wú)法用于其他罕見(jiàn)突變［12］。在本研究中，我們對(duì)15 例經(jīng)免疫組織化學(xué)染色評(píng)估H3F3A G34W 蛋白的表達(dá)為陰性的GCTB 病例進(jìn)行H3F3A DNA Sanger 測(cè)序分析，探討H3F3A G34W 蛋白陰性表達(dá)的GCTB 中H3F3A 的突變類型，為這些突變的診斷意義提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017 年1 月至 2022 年8 月中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的確診為GCTB 的15 例患者， 經(jīng)免疫組織化學(xué)染色評(píng)估H3F3A G34W 蛋白表達(dá)均為陰性。患者腫瘤組織通過(guò)活檢、刮除或切除獲得，采用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。15 例GCTB 中，男7 例，女8 例，男女比例為1∶1.14，年齡15 ～ 55 歲。GCTB 的診斷均符合2013 年世界衛(wèi)生組織軟組織和骨腫瘤的組織形態(tài)診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床特征、影像學(xué)特征及基因檢測(cè)等結(jié)果。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

免疫組織化學(xué)染色使用4 μm 厚福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片進(jìn)行。免疫組織化學(xué)采用EnVision 二步法，一抗 H3.3 G34W 兔單克隆抗體（SD350）購(gòu)自通靈公司（稀釋度 1∶400），二抗購(gòu)自英國(guó)徠卡公司。同時(shí)設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照。使用Leica 全自動(dòng)免疫組化儀（Leica Microsystems Nussloch GmbH）對(duì)H3F3A G34W 進(jìn)行免疫組化染色評(píng)估。

1.3 H3F3A 突變分析

進(jìn)行PCR 和Sanger 測(cè)序分析以檢測(cè)H3F3A 中的基因突變。對(duì)福爾馬林固定和石蠟包埋組織的標(biāo)本，使用 QIAamp DNA FFPE Tissue 純化試劑盒（FFPE DNA Kit 試劑盒， QIAGEN 公司），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，從組織標(biāo)本中分離基因組DNA （gDNA）。對(duì)于每個(gè)樣品，添加180 μL 裂解緩沖液和20 μL蛋白酶K 消化。渦旋混勻后，將樣品在56℃的金屬浴中孵育過(guò)夜。再經(jīng)過(guò)核酸純化，洗脫獲得DNA。通過(guò)NANO 2000 對(duì)從 FFPE 樣本中獲得的DNA進(jìn)行定量和定性分析，以確定濃度和純度。僅當(dāng)A260/A280 比值大于1.8 時(shí)，才認(rèn)為 DNA 適合分子分析。PCR 反應(yīng)體系：2×Premix EX TapTM 12.5 μL，10 μmol/L 擴(kuò)增引物，60 ng DNA 模板及5.5 μL去離子水。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共32 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保溫。用于PCR 和測(cè)序的引物為：H3F3A 上游引物（GGCTCGTACAAAGCAGAC）； H3F3A 下游引物（CAGTACATTTATTTAAGCAGTAG）。 測(cè) 序 由 ABI 3500 XL 遺傳分析儀進(jìn)行。使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)“國(guó)家生物技術(shù)信息數(shù)據(jù)庫(kù)中心”（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST） 中 的 Basic Local Alignment Search Tool （BLAST） 進(jìn)行突變分析。

1.4 高通量測(cè)序

利用蘇州吉因加生物醫(yī)學(xué)工程有限公司 Gene+Seq 2000 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將基因組DNA 經(jīng)超聲波打斷成 200 bp 左右的片段后，進(jìn)行末端修復(fù)加堿基A，加上接頭，通過(guò)PCR 擴(kuò)增制備成文庫(kù)；將樣本文庫(kù)與探針雜交捕獲，洗脫，PCR 富集目標(biāo)DNA 片段，制備DNA 納米球，加入到測(cè)序芯片上，進(jìn)行高通量測(cè)序；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息分析，得出結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 H3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

GCTB 病變由單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞組成。單核細(xì)胞顯示H3.3 G34W 的核表達(dá)，本研究15 例GCTB 中所有病例腫瘤細(xì)胞皆為陰性（圖1A、B）。

2.2 Sanger 測(cè)序結(jié)果

通過(guò) Sanger 測(cè)序，對(duì)15 個(gè)H3F3A G34W（p.Gly34Trp，NM_002107.4）位點(diǎn)免疫組織化學(xué)呈陰性的病例，進(jìn)行DNA 測(cè)序分析。結(jié)果顯示10 例存在少見(jiàn)型的突變，分別為：1 例G34R（c.103G ＞ C，Gly 34 Arg，NM_002107.4，1/15，6.7%）（圖1C），2 例 G34V

（c.104G ＞ T，Gly 34 Val，NM_002107.4，2/15，13.3%）（圖1D），7例G34L（c.103G ＞ C /104G ＞ T及c.103G ＞ T/104G ＞ T ，Gly 34 Leu，NM_002107.4，7/15，46.7%）（圖1E、F），其余5 例均為野生型（Gly 34，5/15，33.3%）。另外，G34L 有兩種不同的堿基突變形式GGG ＞ CTG及GGG ＞ TTG。未發(fā)現(xiàn)有 G34W（c.103G ＞ T，p.Gly-34Trp，NM_002107.4）的突變形式。

圖1 骨巨細(xì)胞瘤H3F3A 免疫組織化學(xué)及基因突變檢測(cè)結(jié)果Figure 1．Results of Immunohistochemistry and Gene Mutation of H3F3A in Giant Cell Tumor of Bone

2.3 高通量測(cè)序法驗(yàn)證Sanger 測(cè)序野生型的標(biāo)本

本研究中，共有5 例Sanger 測(cè)序?yàn)橐吧偷臉颖?，我們?duì)其中3 例進(jìn)行高通量測(cè)序驗(yàn)證，其余 2 例因核酸質(zhì)量不足而無(wú)法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 例原本是Sanger 測(cè)序野生型的標(biāo)本，高通量測(cè)序結(jié)果仍為野生型（圖 2）。

圖2 骨巨細(xì)胞瘤H3F3A 高通量基因檢測(cè)結(jié)果Figure 2．High Throughput Gene Detection Results of H3F3A in Giant Cell Tumor of Bone

3 討 論

在GCTB 中，以往研究在位于染色體1q21 上的H3F3A基因里發(fā)現(xiàn)了雜合性的特定突變，編碼蛋白質(zhì)組蛋白H3.3［10］。這些突變可在 92% 的GCTB中檢測(cè)到，并且僅存在于具有成纖維細(xì)胞樣外觀的腫瘤細(xì)胞群中，而不存在于巨細(xì)胞及其前體細(xì)胞中［12-13］。突變頻繁發(fā)生于編碼甘氨酸34 號(hào)密碼子的103 位堿基。組蛋白 H3.3 的改變可能通過(guò)改變破骨細(xì)胞 RANKL（核因子Kappa-B 受體活化因子配體）的基本信號(hào)的表達(dá)導(dǎo)致破骨細(xì)胞激活異常［14-15］，從而影響GCTB 的發(fā)展。

在骨吸收抑制劑denosumab 治療后，GCTB 可能出現(xiàn)一系列形態(tài)變化，與治療前差距較大，denosumab 治療后的GCTB 特征包括OLGC 缺失、病變內(nèi)大量骨沉積和膠原基質(zhì)，以及無(wú)核梭形細(xì)胞取代單核腫瘤細(xì)胞的增殖，這些細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與GCTB幾乎沒(méi)有相似之處［16-17］。如果不了解denosumab 的先前治療，這部分GCTB 可能被誤診為良性纖維骨病變或骨肉瘤等骨腫瘤［18-19］。因此，H3F3A 突變的分子檢測(cè)對(duì)于 GCTB 與其他骨腫瘤的鑒別診斷具有重要的意義。

GCTB 中H3F3A 的突變檢測(cè)，以往研究顯示［12-13］，可以使用免疫組織化學(xué)和單克隆兔抗體，該抗體靶向組蛋白3 上的突變位點(diǎn)G34W。該抗體檢測(cè)H3F3A 突變的GCTB 時(shí)，單核細(xì)胞群表現(xiàn)明顯強(qiáng)核染色，而包括破骨巨細(xì)胞在內(nèi)的所有其他細(xì)胞核均為陰性。免疫組織化學(xué)是一種易于應(yīng)用的方法，但使用該抗體的局限性在于它只能檢測(cè)最常見(jiàn)的Gly34Trp 突變，少數(shù)GCTB 含有其他無(wú)法通過(guò)該方法檢測(cè)的 Gly34 突變。 此外，應(yīng)仔細(xì)考慮含有骨碎片的樣品，因?yàn)榭乖Y(jié)構(gòu)可能會(huì)受到脫鈣過(guò)程的影響。

研究顯示，一小部分 GCTB（1% ～ 2%）具有 H3-F3A p.G34L、p.G34M、p.G34R 或 p.G34V 突變［9-11］。Yamamoto 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性GCTB 免疫組化H3.3 G34R 陽(yáng)性并伴有 H3F3A p.G34R 突變，及 H3.3G34V陽(yáng)性并伴有 H3F3A p.G34V 突變，而所有 H3.3 G34W陽(yáng)性的 GCTB 和非 GCTB 病變的 H3.3 G34R 和 G34V的免疫組織化學(xué)均為陰性。這些結(jié)果表明，除 H3.3 G34W 外，H3.3 G34R 和G34V 的免疫組織化學(xué)染色可能是 H3F3A 基因型診斷 GCTB 的高度特異性替代標(biāo)志物。然而，有文獻(xiàn)指出，H3.3 G34V 抗體和G34L突變蛋白之間會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，會(huì)成為診斷GCTB 的一個(gè)潛在陷阱，同時(shí)指出，H3G34 突變特異性抗體并不是腦腫瘤中H3.3 突變的完美替代物［21］。

我們采用Sanger 測(cè)序?qū)?5 例H3F3A G34W蛋白表達(dá)為陰性的GCTB 病例進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證基因突變類型，發(fā)現(xiàn)其中10 例GCTB（10/15，66.7%）有G34R/V/L 罕見(jiàn)的突變類型。之前有研究顯示［22］，免疫組織化學(xué)和Sanger 測(cè)序兩種方法結(jié)果一致的比例為 86%（43/50），而結(jié)果不一致的比例為14%（7/50）。對(duì)于不一致的樣本，有的樣本通過(guò)Sanger測(cè)序檢測(cè)為野生型，而通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)出c.103 G ＞ T 突變陽(yáng)性，反之亦有。 這種差異可能是由于 Sanger 測(cè)序的敏感性低。通常，至少需要20%的腫瘤樣本攜帶該突變，Sanger 測(cè)序才會(huì)檢測(cè)到突變的等位基因，而免疫組織化學(xué)方法只需要部分細(xì)胞即可檢測(cè)出來(lái)。對(duì)于無(wú)法通過(guò)免疫組化或Sanger 測(cè)序獲得結(jié)果的病例，可以使用下一代測(cè)序方法進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。免疫組織化學(xué)靈敏且快速，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成診斷，對(duì)大多數(shù)情況很有用，因?yàn)閏.103G ＞ T， p.Gly34Trp （NM_002107.4，NP_002098.1）覆蓋了大約92%的陽(yáng)性，如果免疫組化結(jié)果為陰性，可以進(jìn)行 Sanger 測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證分析。

本研究中，有5 例標(biāo)本H3F3A G34W 蛋白表達(dá)和Sanger 測(cè)序結(jié)果均為陰性，由于免疫組化抗體種類受限，只能檢測(cè)G34W 蛋白突變類型，而一代測(cè)序的靈敏度相對(duì)比較低，只能檢測(cè)腫瘤細(xì)胞含量20%以上的突變，因而致低頻突變?nèi)菀桩a(chǎn)生誤診。鑒于以上兩種方法會(huì)有漏檢的情況，本研究對(duì)5 例野生型標(biāo)本進(jìn)行高通量測(cè)序，2 例標(biāo)本因核酸質(zhì)量不足而無(wú)法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，剩余3 例標(biāo)本高通量測(cè)序結(jié)果仍為野生型。高通量測(cè)序因其靈敏度高，近幾年在各種突變檢測(cè)中不斷被開(kāi)發(fā)利用，對(duì)低頻突變尤其占優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，通過(guò)免疫組織化學(xué)和Sanger 測(cè)序分析15 例 GCTB 病例，我們證明Sanger 測(cè)序是一種準(zhǔn)確可靠的方法，可識(shí)別 c.103G ＞ T （G34W） 和c.103G ＞ C （G34R）等多種GCTB 中的H3F3A 基因突變形式。Sanger 測(cè)序似乎更準(zhǔn)確，因?yàn)镾anger測(cè)序可以識(shí)別免疫組織化學(xué)陰性的病例。免疫組織化學(xué)可以用作第一種方法，它既快速又具有成本效益，同時(shí)具有高特異性和靈敏度。以上兩種方法可以用于初步檢測(cè)，但是，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性或弱陽(yáng)性時(shí)，建議使用高通量測(cè)序驗(yàn)證。

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