王濤，王蒙，梁彥旭，杜書祥，周楊，吳剛，孫培春

450003 鄭州，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院 胃腸外科

胃肝樣腺癌（hepatoid adenocarcinoma of the stomach，HAS）是胃癌中一種罕見的組織學(xué)類型，在所有胃癌中發(fā)生率≤1%［1］，由于目前對HAS 認(rèn)識非常有限，臨床上容易對其造成誤診和漏診。HAS 由多角形嗜酸性肝細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞組成，常伴有AFP不同程度的升高［2］。研究表明HAS 患者的預(yù)后較差，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移［3］，目前HAS 的治療主要以手術(shù)和化療為主，但治愈率極低。近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)，其機(jī)制是通過阻斷程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1） /程序性死亡配體1（programmed deathligand 1，PD-L1）信號通路來改善人體自身免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的［4］。多項研究表明普通胃腺癌中PD-L1 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度、血管浸潤和惡性程度顯著相關(guān)［5-6］，且預(yù)示不良的預(yù)后。我們通過研究HAS 中PD-L1的表達(dá)情況，分析PD-L1 過表達(dá)是否可促進(jìn)HAS 轉(zhuǎn)移和浸潤并影響預(yù)后。因此，探討HAS 中PD-L1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響，深入了解HAS 的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為PD-L1 陽性HAS 的免疫治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年1 月至2021 年5 月我院收治的42 例HAS 患者的臨床病理資料，并由兩名病理科醫(yī)師對病理信息進(jìn)行重新確認(rèn)。男33 例，女9 例，年 齡40 ～ 81 歲，平均年齡62.17 歲；PD-L1 陽 性25 例；AFP 染色陽性30 例；Ki67 陽性33 例；腫瘤分期根據(jù)第8 版UICC/AJCC TNM 分期確定，其中Ⅰ～Ⅱ期9 例，Ⅲ～Ⅳ期33 例；根據(jù)腫瘤分化程度：低分化27 例，中 ～ 高分化15 例；腫瘤浸潤深度：T1/T2 7 例，T3/T4 35 例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例；腫瘤位于賁門11 例、胃體15 例、胃竇16 例；潰瘍型30 例；腫瘤直徑 ＞ 5 cm 21 例；存在脈管內(nèi)癌栓29 例；神經(jīng)侵犯24 例；19 例出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（16例肝轉(zhuǎn)移、1 例肺轉(zhuǎn)移、2 例同時出現(xiàn)胰腺、十二指腸和橫結(jié)腸受侵）。

通過電話、短信及門診隨訪，總生存期（overall survival，OS）從HAS 確診開始計算到患者死亡或末次隨訪時間，42 例HAS 患者均有完整的隨訪資料。

1.2 檢測方法與陽性判定

1.2.1 PD-L1 蛋白的檢測 試劑采用兔抗人PD-L1單克隆抗體（克隆號22C3，丹麥DaKo 公司）。采用免疫組化MaxVision 法。將組織標(biāo)本切片后固定-脫水-透明-浸蠟后，切成薄片（4 ～ 5μm）備用，采用櫻花SAKURA Tissue-Tek 染色機(jī)進(jìn)行HE 染色，使用全自動免疫組化機(jī)對組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。按照22C3 PharmDx 試劑盒的操作流程進(jìn)行操作，然后對切片進(jìn)行復(fù)染-封片-閱片。PD-L1 蛋白檢測均以人足月胎盤組織切片為陽性對照，以陰性質(zhì)控抗體代替一抗作為陰性對照。我們采用聯(lián)合陽性評分（combined positive score，CPS）來評估HAS組織中PD-L1 蛋白的表達(dá)水平，相較于腫瘤細(xì)胞陽性比例評分，CPS 不僅評判腫瘤細(xì)胞中PD-L1 的表達(dá)水平，同時也引入了淋巴細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，可以篩查出更多可能從免疫治療中獲益的患者［7-8］。

1.2.2 PD-L1 陽性判定 PD-L1 陽性判定：CPS 計數(shù)標(biāo)準(zhǔn) = （PD-L1 陽性的腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總數(shù)）/活的腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。當(dāng) CPS ≥1%時，判定PD-L1 表達(dá)陽性［8］。

1.3 HAS 的病理組織學(xué)診斷

HAS 的診斷主要依靠病理組織學(xué)，病理形態(tài)上出現(xiàn)肝細(xì)胞分化區(qū)域的胃癌，不管血清AFP 或AFP染色是否陽性，均可診斷為HAS。在HE 染色下，肝樣分化區(qū)類似于肝癌的病理學(xué)特征，由大、多角形嗜酸性腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，呈梁索狀或?qū)嵭猿矤钆帕校|(zhì)呈嗜伊紅性細(xì)顆粒狀紅染、部分透明樣，胞漿、血竇豐富［9］。HAS 鏡下常表達(dá)Hep Par-1、Glypican-3、SALL4、AFP、CK19、CDX-2 等免疫組化標(biāo)志物，可輔助診斷和排除診斷。HAS 的病理組織通常表現(xiàn)為普通腺癌與肝樣分化區(qū)共存。一般將僅含肝樣分化區(qū)的HAS，定義為單純型胃肝樣腺癌（simple hepatoid ad-enocarcinoma of stomach，SHAS）；將含有普通腺癌的HAS，定義為混合型胃肝樣腺癌（mixed hepatoid adenocarcinoma of stomach，MHAS）［10］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析，PD-L1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗、連續(xù)校正卡方檢驗和Fisher 精確檢驗，PD-L1 表達(dá)和各項臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系采用單因素分析和多因素COX回歸分析。生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 檢驗分析，并繪制生存曲線。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HAS 癌組織、癌旁組織中PD-L1 的表達(dá)情況

HAS 組織PD-L1 陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織（59.52%vs4.76%），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，表1）。

表1 PD-L1 在癌與癌旁組織中表達(dá)的差異Table 1．PD-L1 Expression in Cancer and Adjacent Tissues

2.2 MHAS 中肝樣腺癌區(qū)與普通腺癌區(qū)的PD-L1表達(dá)差異

在42 例HAS 中，20 例為SHAS，22 例為MHAS。在22 例MHAS 中，肝樣腺癌區(qū)與普通腺癌區(qū)同時表達(dá)PD-L1 占31.82%（7/22），肝樣腺癌區(qū)PD-L1 陽性率為54.55%（12/22），而普通腺癌區(qū)中PD-L1 陽性率為40.91%（9/22），但兩者的PD-L1 表達(dá)并無差異（χ2= 0.820，P= 0.365）。

2.3 HAS 中PD-L1 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

HAS 中PD-L1 過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓顯著相關(guān)（P＜ 0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM 分期、分化程度、腫瘤浸潤深度、腫瘤位置、神經(jīng)侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)（P＞ 0.05，表2）。

表2 胃肝樣腺癌中PD-L1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2．Relationship between PD-L1 Expression in and Clinicopathological Features of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

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2.4 HAS 患者的預(yù)后情況

42 例患者隨訪截止時間2021 年10 月，隨訪5～56 個月，隨訪期間29 例患者死亡，平均生存期為26.9個月，中位生存期15 個月，1 年生存率為69.05%，3 年生存率為38.10%（圖1）。根據(jù)Kaplan-Meier 生存曲線分析，PD-L1 過表達(dá)與HAS 患者OS 密切相關(guān)，即PD-L1 陽性者較陰性者術(shù)后生存時間明顯縮短（χ2= 4.813，P= 0.028，圖2）。

2.5 HAS 患者的生存分析

COX 單因素分析表明，年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、AFP 染色、PD-L1 過表達(dá)是影響HAS 患者預(yù)后的不良因素（P＜ 0.05，表3）；COX 多因素回歸分析表明，術(shù)前有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期、AFP 染色是HAS 患者生存的獨(dú)立影響因素（表4）。

圖1 HAS 患者生存曲線圖Figure 1．Survival of HAS Patients

圖2 PD-L1 陽性表達(dá)的HAS 患者生存曲線Figure 2．Survival of HAS Patients with Positive PD-L1 Expression

表3 胃肝樣腺癌預(yù)后單因素分析Table 3．Univariate Analysis of the Prognosis of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

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表4 胃肝樣腺癌預(yù)后多因素分析Table 4．Multivariate Analysis of the Prognosis of Hepatoid Adenocarcinoma of the Stomach

3 討 論

HAS 是胃癌的特殊亞型，發(fā)病率極低，早期易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差［10-12］，既往研究表明HAS 中位生存期為6～17 個月［13］，1 年、3 年、5 年生存率分別為30%～60%［14］、13%～52%［14-15］、9%～20%［16］。本研究HAS 中位生存期為15 個月，1 年、3 年生存率分別為69.05%和38.10%。如何早期準(zhǔn)確診斷HAS至關(guān)重要，目前HAS 診斷金標(biāo)準(zhǔn)為病理組織學(xué)檢測，但也有許多免疫標(biāo)志物可協(xié)助診斷，如SALL4在成人正常胃組織及胃癌組織中不表達(dá)，在普通型胃癌中部分表達(dá)，而在HAS 中呈彌漫性表達(dá)［10］。Hep Par-1 是一種針對正常肝細(xì)胞和腫瘤肝細(xì)胞的單克隆抗體，被認(rèn)為是正常肝細(xì)胞和腫瘤肝細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。CDX-2 在腸道腫瘤和伴有腸型上皮分化的腫瘤均表達(dá)陽性。CK19 在胃腺癌、膽管細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中陽性表達(dá)，在肝癌中較少表達(dá)，如果CK19陰性則可排除HAS，而CK19陽性可除外肝癌，這在HAS 肝轉(zhuǎn)移時具有重要的診斷意義［17］。在我們的研究中42 例HAS 患者免疫組化顯示胎腸標(biāo)志物如AFP 染色陽性率為71.43%（30/42）、Glypican-3陽性率為67.65%（23/34）、SALL4 陽性率為68.75%（22/32）、CDX-2 陽 性 率 為65.71%（23/35）、CK19 陽性率為100.0%（35/35），肝細(xì)胞標(biāo)志物Hep Par-1 陽性率為76.47%（26/34），以上免疫標(biāo)記物在HAS 中廣泛表達(dá)是協(xié)助診斷HAS 的靈敏指標(biāo)。

研究表明腫瘤標(biāo)記物（AFP、CEA、CA199 等）對HAS 的診斷有一定的輔助價值，且與患者的預(yù)后相關(guān)。既往研究表明腫瘤標(biāo)記物CEA 升高預(yù)示HAS患者預(yù)后較差［16］，但鮮有研究探討其他腫瘤標(biāo)記物對HAS 的預(yù)后價值。本研究結(jié)果顯示AFP 陽性率為59.52%（25/42）；CEA 陽性率為45.24%（19/42）；CA199 陽 性 率 為50.00%（21/42），對AFP、CEA 和CA199 進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)三者對HAS 患者的預(yù)后均無影響（P＞ 0.05），由于本研究樣本量較小，今后仍需大量研究探討血清腫瘤標(biāo)記物對HAS 患者的預(yù)后影響。我們還對可能影響HAS 患者預(yù)后的其他因素進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1 表達(dá)、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AFP 染色、脈管癌栓是影響HAS 患者預(yù)后的不良因素（P＜ 0.05）。但進(jìn)行多因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)PD-L1 表達(dá)、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓并不是影響HAS 預(yù)后的獨(dú)立影響因素，而AFP 染色、TNM 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為HAS 患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子（P＜ 0.05）。

PD-L1 是B7 共刺激分子家族的成員，與PD-1結(jié)合后，PD-1 胞質(zhì)區(qū)的TISM 結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，募集SHP-2 磷酸酶，使Igα/β 和Syk發(fā)生去磷酸化，從而傳遞抑制性信號［18］，這種信號對免疫細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸和增殖。目前少有研究報道PD-L1 在HAS 中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響。我們試圖對42 例HAS 患者癌組織進(jìn)行免疫組化檢測，觀察PD-L1 在HAS 中的表達(dá)水平，結(jié)果表明HAS 組織中PD-L1 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且陽性率高達(dá)59.52%。而PD-L1 在普通胃腺癌和肝細(xì)胞癌中表達(dá)情況又如何呢？Wu 等［19］的研究表明340 例普通胃腺癌中PD-L1 的陽性率為40.3%，而李毓飛等［20］的研究表明胃癌中PD-L1的陽性率為37.3%，均低于HAS 中PD-L1 的表達(dá)水平；在肝細(xì)胞癌的有關(guān)研究中，PD-L1 陽性率在17% ～ 92.3%之間，差異較大，可能與樣本量、染色技術(shù)、判定標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)［21-23］。我們還對MHAS中肝樣腺癌區(qū)與普通腺癌區(qū)的PD-L1 表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MHAS 中肝樣腺癌區(qū)與普通腺癌區(qū)共表達(dá)PD-L1 占31.82%，盡管肝樣腺癌區(qū)PD-L1 的陽性表達(dá)率（54.55%）明顯高于普通腺癌區(qū)（40.91%），但兩者PD-L1 表達(dá)并無差異（P＞ 0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HAS 中PD-L1 的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓顯著相關(guān)（P＜ 0.05）。王閆飛等［14］對30 例HAS 患者的病理資料進(jìn)行分析，其中16例檢測了PD-L1 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PD-L1 的表達(dá)對HAS 患者的預(yù)后并無影響，我們對PD-L1 陽性 HAS 患者進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1 過表達(dá)與HAS 患者生存期密切相關(guān)，PD-L1陽性者較陰性者生存期明顯縮短（P＜ 0.05），這也證實(shí)PD-L1 在HAS 的進(jìn)展中起著重要作用。PD-L1 陽性HAS 可能具有多種誘導(dǎo)PD-L1 表達(dá)的機(jī)制，并提示PD-1 驅(qū)動的免疫逃避可能在PD-L1陽性 HAS 中發(fā)揮重要作用，今后仍需大量研究進(jìn)一步探討。目前，HAS 治療仍以手術(shù)與化療為主的綜合治療模式，但HAS 的OS 卻沒有得到明顯的改善。近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種惡性腫瘤的治療中取得良好效果［24］。2022 中國臨床腫瘤學(xué)會胃癌診療指南中，我國已經(jīng)將免疫治療地位提升至一線并覆蓋晚期胃癌全程治療中，因PD-L1陽性HAS 患者的腫瘤微環(huán)境中也存在免疫抑制，故HAS 患者可能也是PD-L1/PD-1 抑制劑治療的受益人群。早期檢測HAS 中PD-L1 的表達(dá)情況對HAS 的治療有一定指導(dǎo)意義，早期使用PD-1/PD-L1 抑制劑治療PD-L1 陽性 HAS 患者可能會展現(xiàn)出更好的效果。

本研究尚存在一定的局限性。首先，由于部分病例存在隨訪時間的不足，故僅報道了3 年生存率的結(jié)果。其次由于本研究為回顧性研究，時間跨度長，有些臨床病理數(shù)據(jù)缺失，可能對結(jié)果造成影響。最后本研究納入的病例數(shù)較少，今后還需大量研究進(jìn)一步探討和驗證結(jié)果。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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