李剛剛，馬慧群

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004）

銀屑病是由免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，該病治療困難。其主要的臨床表現(xiàn)為局限或者廣泛分布的鱗屑性紅斑或斑塊，病因?yàn)檫z傳、免疫、環(huán)境等多種因素[1]。近年來患者數(shù)量呈逐漸上升趨勢，而其發(fā)病機(jī)制不清。流行病及基礎(chǔ)研究逐漸揭示銀屑病不僅僅是一種皮膚病，還是一種可與多種全身性、代謝性疾病并發(fā)的重要的系統(tǒng)性疾病[2]。

代謝組是由生物個(gè)體系統(tǒng)中所有的代謝物共同組成，其基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)活性及環(huán)境影響的最終結(jié)果。近年來代謝組學(xué)被應(yīng)用于皮膚病研究，由于銀屑病有免疫介導(dǎo)的多基因遺傳的特點(diǎn)，代謝組學(xué)研究在銀屑病病因的探索及特異性診斷生物標(biāo)記物的查找方面提供了重要依據(jù)，因此在皮膚科有重要的研究價(jià)值[3]。運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)患者的臨床樣本進(jìn)行銀屑病代謝生物標(biāo)志物探索，逐漸成為銀屑病早期診斷、臨床分型等方面研究的熱點(diǎn)[4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2016年3—9月，選擇在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科門診及住院的尋常型銀屑病患者，其中有家族史的銀屑病女性患者7例、無家族史的銀屑病患者女性患者7例，以及同期健康體檢女性14例。各組間年齡、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 對(duì)照組及銀屑病組基本信息對(duì)比表

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，納入者均被告知并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①納入的患者均符合《中國銀屑病治療指南（2018版）》[1]的尋常型銀屑病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且處于穩(wěn)定期，年齡15～63歲；②4周內(nèi)沒有接受抗炎及藥物治療；③進(jìn)行問卷調(diào)查和預(yù)實(shí)驗(yàn)，分析可能的主要影響因素，并進(jìn)行分析，保留有意義的病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于月經(jīng)期的患者；②有尿路感染癥狀，尿常規(guī)檢查異常的患者；③有婦科炎性反應(yīng)，分泌物可能污染所留取的標(biāo)本的患者；④膿皰型、關(guān)節(jié)病型、紅皮病型銀屑病及發(fā)生在特殊部位銀屑病，如指甲、皺褶部位、外陰、黏膜、掌跖等部位的患者；⑤處于妊娠、哺乳期或者計(jì)劃1年內(nèi)妊娠者；⑥合并焦慮、抑郁或其他精神疾病者；⑦合并有代謝性或者系統(tǒng)性疾病，未能有效控制者；⑧合并腫瘤者；⑨有水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂及嚴(yán)重感染者；⑩內(nèi)科疾病導(dǎo)致檢查結(jié)果異常影響判斷者；11○已明確對(duì)該研究中所用藥物過敏者；12○不愿意或者不能配合完成研究者。

1.3 樣本收集及處理 本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）相結(jié)合的技術(shù)，因此分開敘述。

1.3.1 GC-MS技術(shù)

1.3.1.1 樣本采集 尿樣：所有受試者前1天清淡飲食，于次日清晨空腹采樣，留取尿液前先用0.05%呋喃西林溶液對(duì)受檢者的外陰部進(jìn)行擦洗，取材過程中用無菌紗布堵住陰道口，用無菌容器收集10 mL中段尿液，所收集的尿液標(biāo)本3 500 r/min（離心半徑為8 cm）離心5 min，取其上清液，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 樣本處理 尿液樣本預(yù)處理：取出保存的尿液樣本，在室溫下自然解凍后取50μL加入到1.5mL離心管中；加入尿素酶（100 U/mL）30 μL，37℃反應(yīng)15 min；加入混合內(nèi)標(biāo)工作液5 μL；然后加入甲醇170 μL，振蕩 1 min，充分混勻；常溫 12 000 r/min（離心半徑為7 cm）離心5 min，取200 μL上清液至1.5 mL安捷倫樣品瓶中；抽真空冷凍干燥。

1.3.1.3 樣品衍生化 冷凍干燥后的尿液樣本通過以下2個(gè)步驟對(duì)樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)。首先，往試管中加80 μL濃度為10 mg/mL甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，在30℃條件下放置90 min進(jìn)行甲基肟化反應(yīng)，以保護(hù)其羰基。之后，為了增強(qiáng)化合物的揮發(fā)性，加入90 μL含有濃度為1%的三甲基氯硅烷的N-甲基三甲基硅三氟乙酰胺溶液（MSTFA+1%TMCS）在37℃環(huán)境中靜置30 min進(jìn)行衍生化。

1.3.1.4 GC-MS分析 按照Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library Application Note操作。色譜條件為：DB-5柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）；載氣為 He 氣體（純度為99.999%）；進(jìn)樣口溫度為260℃；輔助加熱區(qū)溫度為300℃。GC柱溫度設(shè)定為在60℃下等溫加熱1 min，然后以10℃/min的爐溫升至325℃，在此溫度下保持10 min。矯正載氣壓力至6.51 psi的恒定壓力下使肉豆蔻酸（Myristic acid）的保留時(shí)間鎖定在16.72 min。

質(zhì)譜條件如下：EI離子源；全掃描模式（50～550 m/z）；電子碰撞電離電壓（70 eV）；離子源的溫度200℃；采集頻率2.91 spec/sec。以不分流模式進(jìn)樣 1.0 μL 樣品。

1.3.1.5 數(shù)據(jù)的預(yù)處理及化合物的識(shí)別 使用美國MSD Chemstation software E.02.02（安捷倫）錄入原始數(shù)據(jù)，之后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（NIST）解卷積軟件AMDIS中，使用Fiehn保留時(shí)間鎖定（RTL），數(shù)據(jù)庫對(duì)所錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積處理，并使用 Fiehn GC/MS代謝組學(xué) RTL庫（Agilent Technologies，Inc）進(jìn)行鑒定。導(dǎo)出包含相對(duì)峰強(qiáng)度，化合物名稱和樣品信息的電子表格用于多變量數(shù)據(jù)分析。

1.3.1.6 模式識(shí)別和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將預(yù)處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MATLAB2009a（Math Works Inc.，Natick，MA，USA）用于多變量統(tǒng)計(jì)分析。首先進(jìn)行主成分分析（PCA）以進(jìn)行代謝輪廓辨別。然后使用非參數(shù)Mann-Whitney-Wilcoxon檢驗(yàn)確定組間的改變的代謝物。原始P值經(jīng)Benjamini&Hochberg（BH method）方法校正，采用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）控制多重檢驗(yàn)下的假陽性結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.1.7 功能富集和通路拓?fù)浞治?對(duì)差異性代謝 物 使 用 網(wǎng) 絡(luò) Metabo Analyst 3.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）工具進(jìn)行通路分析，以挖掘潛在的生物信息。首先使用ORA算法（Over-representation analysis）進(jìn)行功能富集分析，再通過計(jì)算相對(duì)介數(shù)中心度進(jìn)行通路拓?fù)浞治觥?/p>

1.3.2 LC-MS技術(shù)

1.3.2.1 收集樣本 所有的受試者在前一日須清淡飲食，在次日晨空腹留取生物學(xué)標(biāo)本，取尿樣本前使用0.05%的呋喃西林溶液對(duì)受檢者的外陰部位進(jìn)行擦洗，取材過程中用無菌紗布堵住陰道口，用無菌的容器收集10 mL中段尿液，所收集的尿液標(biāo)本3 500 r/min（離心半徑為14 cm）離心5 min，取其上清液置-80℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 處理樣本 取出冰凍的樣本，常溫下溶解。先從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本中分別取出50 μL混勻，配成質(zhì)控組（Quality Control，QC）樣本。從實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和指控組分別取出100 μL，分別加入乙腈500 μL，并渦旋混勻，4 ℃條件下、14 000 r/min（離心半徑為7 cm）5 min，取上清液進(jìn)行LC-MS分析。

1.3.2.3 檢測樣本 色譜的條件：使用B Sciex TripleTOF 5600質(zhì)譜儀和Agilent快速分離液相色譜系統(tǒng)。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，Agilent）。色譜柱溫度：40℃。樣本進(jìn)樣量：2 μL。

正離子的組成：流動(dòng)相為0.1%甲酸和水；流動(dòng)相B為0.1%甲酸和乙腈。負(fù)離子的組成：流動(dòng)相A成分是水；流動(dòng)相B的成分是乙腈，實(shí)驗(yàn)開始前為了避免氣體對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，將流動(dòng)相放進(jìn)數(shù)控超聲波清洗器中進(jìn)行排氣處理。

質(zhì)譜的條件：氮?dú)馐怯糜阱F孔、霧化的氣體；ESI是離子源：分別使用正、負(fù)離子不同模式進(jìn)行檢測（ESI+/ESI-）；飛行管檢測的模式為V型；毛細(xì)管的電壓是3.2 kv；萃取錐孔電壓是3 v；錐孔電壓是35v；離子源溫度為100℃；脫溶劑氣流量是650L/h；脫溶劑氣溫度是350℃；反向錐孔氣流量為50 L/h；低質(zhì)量區(qū)分辨率是4.7 v；高質(zhì)量區(qū)分辨率是15 v；離子能量是0；碰撞池入口電壓為2 v；碰撞池出口的電壓為-10 v；碰撞的能量是4 eV；碰撞氣流是0.5 mL/min；檢測器為 1 800 v；掃描時(shí)長為 1 s；掃描的間隔時(shí)間是0.02 s；敏感度選擇normal；動(dòng)態(tài)范圍選擇extended；質(zhì)核比的范圍選擇50～1 000 m/z；對(duì)樣品進(jìn)行儀器分析之前，先使用質(zhì)譜較機(jī)液對(duì)其質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

1.3.2.4 數(shù)據(jù)的處理 原始數(shù)據(jù)由HPLC-TOFMS獲得，運(yùn)用Analyst1.5.1軟件包中的Data Acquisition軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，得到格式為.scan的文件，分別為：樣本名稱和各化合物保留的時(shí)間、精確質(zhì)核比、峰度的值等相關(guān)信息。銀屑病患者及正常人血樣的LC-MS總離子流圖通過軟件包中PeakView軟件獲得。

數(shù)據(jù)的預(yù)處理：使用MaekerView軟件，將所得的.scan文件數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、標(biāo)度化、濾噪及色譜峰對(duì)齊等一系列的處理。

1.3.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用聚類分析、PCA、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)銀屑病組患者與健康對(duì)照組間的代謝差異。

①為了對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維壓縮，用主要成分描述數(shù)據(jù)的內(nèi)部特征，使用MaekerView軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。各主成分相互間呈正交，并且第一個(gè)主成分能包含數(shù)據(jù)的絕大部分信息，第二個(gè)主成分次之，以此類推。代謝信息相近樣本在PCA得分圖（Score plot）中聚集在相同的區(qū)域，相距越遠(yuǎn)則樣本的代謝差異就越大。②對(duì)照組和銀屑病組數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)使用MaekerView軟件進(jìn)行，選取差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的變量。③使用BRB軟件對(duì)于P＜0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以評(píng)價(jià)樣本間的相似性。④PLS-DA使用SIMCA-P11.5軟件對(duì)P＜0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用來考察這些差異變量對(duì)銀屑病組及對(duì)照組的判別能力，從而獲得代謝的差異[權(quán)重值（VIP）＞1]。⑤利用SPSS 20軟件繪制受試者操作特征曲線（ROC）的方法，結(jié)合繪制均值柱形圖來選定銀屑病患者尿液中潛在的生物靶標(biāo)物。

2 結(jié)果

有、無家族史的女性尋常型銀屑病患者尿液中L-丙氨酸、天門冬氨酸水平高于健康對(duì)照組，但甘油（丙三醇）水平則低于健康對(duì)照組，見圖1、2。

圖1 無家族史的女性尋常型銀屑病患者尿液中L-丙氨酸、天門冬氨酸水平高于對(duì)照組，甘油水平則低于對(duì)照組

圖2 有家族史的女性尋常型銀屑病患者尿液中L-丙氨酸、天門冬氨酸水平高于對(duì)照組，甘油水平則低于對(duì)照組

3 討論

銀屑病是遺傳與環(huán)境相關(guān)性疾病，機(jī)體代謝改變引起的表觀遺傳學(xué)異常似乎影響廣泛。表觀遺傳學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，代謝過程中通過DNA甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化、組蛋白修飾導(dǎo)致的染色質(zhì)重塑，通過 p53 途徑中的 p14ARF、MDM2、p21WAF1、Bcl-2/Bax、原癌基因（c-Myc）等效應(yīng)分子以及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）影響其介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或過度增殖，參與了銀屑病的發(fā)病[5]。銀屑病患者存在著明顯的代謝異常，包括氨基酸代謝紊亂和糖酵解活性增高等，其免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程與動(dòng)脈粥樣硬化類似[6-7]，由此也許是某些環(huán)境因素誘發(fā)了機(jī)體代謝過程的改變，活化了T細(xì)胞，啟動(dòng)了機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，導(dǎo)致了銀屑病的啟動(dòng)和持續(xù)。

現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)為快速系統(tǒng)的研究銀屑病代謝提供了可能：代謝組學(xué)的分析技術(shù)主要有核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（Mass spectrum，MS）。MS有極高的檢測敏感度和目標(biāo)特異性，可對(duì)樣品中多種代謝成分同時(shí)進(jìn)行檢測與鑒定。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要分為GC-MS和LC-MS 2大類，GC-MS技術(shù)有優(yōu)秀的敏感度及良好的分辨率，可通過比對(duì)結(jié)構(gòu)信息對(duì)代謝組分進(jìn)行定性，同時(shí)有商業(yè)性的化合物譜庫，可提高鑒定結(jié)果的統(tǒng)一性及重現(xiàn)性，但無法檢測樣品中揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性較差的代謝物，對(duì)于體系中極性比較大的難揮發(fā)組分，需要進(jìn)行繁瑣的衍生化預(yù)處理，影響結(jié)果信息的準(zhǔn)確性。LC-MS技術(shù)對(duì)待測組分的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性沒有要求，無需對(duì)樣本進(jìn)行衍生化操作，樣品前處理簡單，分離物質(zhì)快速、高效。但LC-MS缺少可以參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫，只能通過所獲得代謝物的精確相對(duì)分子質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，以驗(yàn)證確定分子的結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)還存在基質(zhì)效應(yīng)、共流出峰間離子抑制及誘導(dǎo)作用等問題?；耍狙芯坎捎肎C-MS和LC-MS聯(lián)合技術(shù)，從有家族聚集傾向的銀屑病患者入手，以家族內(nèi)外健康人和銀屑病散發(fā)病例為對(duì)照，將可能的靶標(biāo)物追蹤進(jìn)行分析。

通過銀屑病代謝異常生物標(biāo)記物的文獻(xiàn)追蹤和Meta分析，結(jié)果顯示乳酸、尿酸、丙氨酸、丙三醇、天門冬酰胺、天門冬氨酸等與銀屑病代謝關(guān)系密切，研究已經(jīng)在系統(tǒng)性評(píng)價(jià)的國際化前瞻性注冊(cè)數(shù)據(jù)庫（PROSPERO）注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：CRD42017057297），分析結(jié)果的森林圖見圖3。本文的質(zhì)譜分析中提示女性尋常型銀屑病患者L-丙氨酸、天門冬氨酸較健康組高，甘油水平較健康組低，且無家族聚集現(xiàn)象的病例也有同樣表現(xiàn)。Kang等[8]研究也發(fā)現(xiàn)與健康組相比，銀屑病患者血清中天門冬氨酸水平升高。尋常型銀屑病患者糖代謝紊亂，會(huì)分解甘油進(jìn)行糖異生，這也許是尿中甘油水平降低的原因。有研究指出血中天門冬氨酸、丙氨酸含量明顯增高可能與肝臟代謝功能異常有關(guān)[9]。這可能是尿中上述成分異常的原因。

圖3 銀屑病代謝異常生物標(biāo)記物的文獻(xiàn)追蹤和Meta分析森林圖

本研究期望通過對(duì)銀屑病患者生物學(xué)樣本中代謝異常物質(zhì)的查找，以求深入研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)及預(yù)防銀屑病的發(fā)生、評(píng)估銀屑病的預(yù)后提供新的思路。